Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

C.elegans'ta poliglutamin floresan muhabirin dokuya özgü ifadesinin kullanılması önemlidir, çünkü proteostaz düzenleyicilerinin bozulmamış çok hücreli bir organizma bağlamında keşfedilmesine ve karakterizasyonuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, organizmaların proteomun uygun katlanmasını ve işlevini ve yaşlanmanın etkilerini nasıl koruduklarına dair daha derin mekanistik içgörü elde etmek için gerekli olan hücresel proteostaz in vivo'daki yaşa bağlı düşüşün görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin sağlamasıdır. Proteostazı koruyabilen elucidating mekanizmaları, proteostazın tehlikeye atılacağı yaşlanma ilişkili hastalıkların tedavisi ve sağlıklı yaşlanmayı teşvik etmek için hedefe yönelik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.

Proteostaz çökmesi, Alzheimer, Parkinson, Huntington hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz da dahil olmak üzere protein yanlış katlama hastalıklarının gelişiminin altında olduğu için büyük bir klinik sorunudur. Her test durumu için beş agar plakası hazırlamak için 6 santimetre çapında Petri plakaları kullanarak başlayın. RNAi ile yapılan deneyler için, dönüştürülmüş HT115 E.coli'de dsRNA üretimine neden olun ve RNAi agar kullanın.

RNAi içermeyen deneyler için standart NGM agar üzerinde OP50 E.coli kullanın. E.coli kültürlerini 220 RPM'de titrerken bir gecede 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, bakterileri 2, 400 G'de 15 ila 20 dakika santrifüjleme ile peletleyin, ardından süpernatantı epire edin ve peletin başlangıç lb hacminin onda birinde yeniden askıya alın.

Aliquot her plakaya 200 mikrolitre konsantre bakteri ve tüm sıvı emilene kadar açık plakaların temiz bir ortamda kurumasını sağlar. C.Eleganları hipoklorit tedavisi ile senkronize etmek için, gravid hermafroditleri M9 tamponu ile iki kez yıkayın, ardından taze bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 5 mililitre hipoklorit çözeltisinde kuluçkaya yatırarak her dakika sallayın. Kuluçkadan sonra, hayvanları aşağı çevirin ve M9 tamponu ile üç kez yıkayın.

Embriyoların 20 santigrat derecede dönme ile 3 mililitre M9 çözeltisinde bir gecede tüplerde yumurtadan çıkmasına izin verin. L1 hayvanlarının yoğunluğunu, 6 santimetrelik bir tabağa üç kez 10 mikrolitre L1 çözeltisi bırakarak ve L1 hayvanlarının sayısını sayarak hesaplayın. Periyodik olarak, hayvanların yerleşmesini önlemek için L1 çözeltilerini karıştırın.

Tohum 50 L1 her tabağa bir hayvan, tohumlanan sayıyı sayın ve kaydedin ve plakaları 20 santigrat derecelik bir inkübatöre taşıyın. Alternatif olarak, hayvanları yumurta bırakma yoluyla senkronize etmek için, her tabağa dört ila altı saat boyunca beş ila on genç, gravid yetişkin hayvan yerleştirin ve tabak başına yaklaşık 50 yumurta olana kadar yumurta bırakmalarına izin verin. Tüm gravid yetişkinleri çıkarın ve yumurtalarla birlikte tabakları 20 santigrat derece inkübatöre taşıyın.

Hayvanları 20 santigrat derecede yaklaşık 40 saat sürecek olan L4 aşamasına kadar yetiştirin. Daha sonra 160 kat FUDR'den 50 mikrolitre ekleyin. Kas dokusundaki proteostazdaki düşüşü ölçmek için, 20 hayvan seçin ve% 3 agarose ped ve 10 milimoler sodyum azid 5 mikroliter damlası ile bir mikroskop kaydırağı üzerine monte edin.

Tüm solucanlar hareketsiz hale getirdikten sonra, 10 X büyütme lensi kullanarak hayvanların tüm vücutlarını görüntüleyin. Fitc veya YFP filtresi ve her hayvan için aynı pozlamayı kullanın. İşiniz bittiğinde slaytları atın.

Tüm hayvanın vücut duvarı kaslarındaki odak sayısını sayın. Odaklar, arka plandaki dimmer çözünür sinyalden ayırt edilebilen daha parlak noktalı sinyallerdir. Puanlama günlerinde, hayvanlarla plakalara bakın ve felçli hayvanların sayısını kaydedin, ardından felçli hayvanları tabaktan çıkarın.

Deneyin tamamlanmasıyla, her durum için felç oranını hesaplayın ve felcin ilerlemesini çizin. Nöronal dokudaki proteostazdaki düşüşü ölçmek için solucanları daha önce açıklandığı gibi bir kaydırağa monte edin ve 40 X büyütme lensi kullanarak hayvanların başının Z yığını görüntülerini bileşik bir mikroskopta alın. Görüntülemeden sonra slaytları atın.

Görüntüleri aldıktan sonra, Z yığınlarını düzleştirin ve sinir halkası bölgesinde bulunan nöronlardaki odakların sayısını ölçmek için kullanın. 4, 6, 8 ve 10. Yetişkinliğin ikinci gününde, tabaktan 10 senkronize hayvan seçin ve onları bir mikroskop kaydırağı üzerinde 10 mikroliter M9 tamponu damlasına yerleştirin.

40 veya daha fazla hayvan örneği almak için bu adımı en az dört kez tekrarlayın. Video özellikli bir kamera ile stereo mikroskopta hayvanların 30 saniyelik bir süre boyunca hareketini video kaydedin. Analiz edilecek hayvanlarla tüm videolar kaydedildikten sonra, videoyu oynatın ve her hayvanın vücut virajlarını puanlayın.

Her noktanın Y ekseninde 30 saniyede vücut büküm sayısını ve X ekseninde test edilen farklı koşulları temsil ettiği bir sütun grafiğinde her hayvan için gövde bükümlerinin sayısını çizin. Poliglutamin tekrar modeli, proteostatik ağı düzenleyen genlerin tanımlanmasında etkili olmuştur. Kaslara özgü poliQ-YFP ekspresyifi, basit bir floresan diseksiyon mikroskobu altında ölçülmesi kolay floresan odaklarının birikmesiyle sonuçlanır.

Orta yaş sırasında hayvanlar felç olur, çünkü kas içindeki proteom muhabirin proteotoksik etkisi nedeniyle çöker. Nöronal proteostazdaki yaşa bağlı düşüş, hayvanları sıvıya yerleştirdikten sonra koordineli vücut virajlarında agrega oluşumunun ve düşüşlerinin doğrudan ölçülmesi ile takip edilebilir. Bu yöntem, transkripsiyonel bir kofaktör olan protein kinazını etkileyen homeo etki alanının, otofaji ve moleküler refakatçilerin ekspresyonunu düzenleyerek yaşlanma sırasında proteostazı etkilediğini göstermek için kullanılmıştır.

HPK-1 kaybı, yaşlanma sırasında biriken Q35-YFP toplamlarının sayısını artırır. Kontrol hayvanları ortalama 18 agrega gösterirken, HPK1 null mutant ve HPK1 RNAi tarafından tedavi edilen hayvanlar sırasıyla ortalama 28 ve 26 agrega sergiledi. Yetişkinliğin sekizinci gününe gelindiğinde, HPK1 eksikliği olan hayvanların% 77 ila 78'i felç oldu, bu da kontrolün sadece% 50'sine karşılık geldi.

Ek olarak, HPK1'in aşırı ekspresyonunun protein agrega oluşumunu düzenlediği ve yaşlanan hayvanları yaşlanma sırasında Q35-YFP ilişkili felçten koruduğu gösterilmiştir. Bu yöntem, bir hücre tipi içindeki proteomların genel düşüşünü ölçer. Prostat ağının belirli bileşenlerindeki değişiklikleri değerlendirmek için birçok yöntem vardır.

Birlikte, kapsamlı bir resim sağlarlar. Azalan proteostaz yaşlanmanın bir özelliğidir. Bu yaklaşım, araştırmacıların bu düşüşü ölçmelerini sağlar.

Genetik analizle birleştirildiğinde, keşif için güçlü bir araçtır.