Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Arbovirüsün aracılık ettiği bir yaklaşım, çünkü karşı önlemler büyük ölçüde sivrisineklerin azaltılması ile sınırlıdır. Bu nedenle, vektör yeterlilik analizleri kritik önleme stratejileridir, çünkü belirli bir arbovirüs için hangi popülasyonların ve sivrisinek türlerinin vektör olarak hizmet edebileceğini belirlerler ve bu nedenle hedeflenmelidirler. Bu nedenle, sivrisineklerin ve diğer vektörlerin bulaşıcı hastalıkların bulaşmasında rolünü değerlendirmek için araç kutumuzdaki en önemli bileşenlerden biri vektör yeterlilik çalışmasıdır.

Bunlar, örneğin sadece sivrisinek veya kene türlerini değil, aynı zamanda coğrafi suşları ve aynı zamanda farklı bir virüsün veya başka bir bulaşıcı organizmanın çok spesifik suşlarını çok hassas bir şekilde kontrol edebileceğimiz deneylerdir ve farklı türlerin dünyanın çok özel bölgelerinde farklı ajanları bulaştırma riski hakkında çok kesin ve iyi kontrol edilen veriler elde edebiliriz. Enfekte sivrisineklerle çalışmak, deneycinin risklerini en aza indirmek için özel tesisler, eğitim, deneyim ve dikkatli bir planlama gerektirir, ayrıca kaçan, enfekte olmuş bir sivrisinek risklerini de azaltır. Bu nedenle, bu tesislerdeki yeni bireylerin, tekniklere ve iş akışına aşina olmaları için enfekte olmamış kan sivrisinekleriyle çalışmak için zaman ayırmaları oldukça önemlidir.

Maruz kalındığı gün, besleme ünitelerini önceden ısıtmak için bir Eklembacaklı muhafaza tesisindeki güç kaynağını açın. Taze hasat edilmiş sitrat veya heparinize insan kanını bire bir hacim oranında viral bir stokla birleştirin ve standart üç mililitrelik bir rezervuar ünitesini saf ve enfekte olmamış bir farenin derisiyle kaplayın. Kapalı rezervuarı beyaz kağıt havluların üzerine yerleştirin ve rezervuara her seferinde bir mililitre olmak üzere yaklaşık iki mililitre bulaşıcı kan ekleyin.

Ardından, sızıntı olmadığını doğrulamak için kağıt havluları inceleyin. Enfeksiyöz tahlili gerçekleştirmeden 24 saat önce, Vero hücreleri ile 24 oyuklu hücre kültürü plakaları hazırlayın ve her birini sivrisinek ve numunenin kimliği ile etiketleyin. Sivrisineklerin bulaşıcı kan ununa maruz kalacağı sabah, suya doymuş pamuk toplarını çıkarın ve yapay kan yemeklerinin bulunduğu rezervuarları şeffaf bir plastik muhafaza eldiveni kutusu ile besleme ünitesi kablolarına bağlayın.

Açlıktan ölmek üzere olan sivrisineklerle birlikte karton kartonu, besleme ünitesinin altındaki torpido gözüne yerleştirin. Beslemenin tamamlanmasının ardından rezervuarı çıkarın ve taze hazırlanmış% 10 çamaşır suyuna batırın. Torpido gözü içinde, soğuk anestezi uygulanmış sivrisinekleri buz üzerindeki bir Petri kabına dökün ve tıkanmış sivrisinekleri tıkanmamış sivrisineklerden ayırın.

Tıkanmış sivrisinekleri tekrar karton kartona dökün ve hızlı bir şekilde bir ekran ve kapakla kaplayın. Kartondaki fazla elek ağını kesin ve kapağı bantla sabitleyin. Ekrana steril filtrelenmiş %10 sükroz ile doyurulmuş bir pamuk top ekleyin ve nemi korumak için kartonu nemli bir süngerle büyük bir plastik ikincil kaba koyun.

İkincil kabı 27 santigrat derecede inkübe edin ve deneyler tamamlanana kadar sivrisineklerin sakaroza ad libitum erişmesine izin verin. Kartondan önceden belirlenmiş sayıda kuluçkaya yatırılmış sivrisinek elde etmek için mekanik bir aspiratör kullanın ve bittiğinde toplama tüpünü pamuklu bir yuvarlakla kapatın. Torpido gözü içinde çalışarak, soğuk anestezi uygulanmış sivrisinekleri buz üzerindeki bir Petri kabına dökün.

Her sivrisinek bacağının altısını da çıkarın ve bunları sterilize edilmiş paslanmaz çelik bilyalı rulman ve 500 mikrolitre sivrisinek toplama ortamı veya MCM ile önceden etiketlenmiş iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Sivrisinekleri nazikçe bir damla mineral yağın üzerine yerleştirin ve yağın sivrisineğin kafasına veya hortumuna temas etmemesine dikkat edin. Hortumu, 10 mikrolitre ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile doldurulmuş bir mikro pipet ucuna yerleştirin ve sivrisineklerin 30 dakika boyunca tükürük salgılamasına izin verin.

Pipet ucunu tükürükle birlikte 100 mikrolitre MCM içeren bir mikro santrifüj tüpüne çıkarın ve karkası sterilize edilmiş çelik bilyalı rulman ve 500 mikrolitre MCM ile iki milimetrelik ayrı bir tüpe yerleştirin. Tüpleri bir biyo güvenlik kabini içindeki bir boncuk frezeleme doku homojenizasyon cihazına taşıyın ve viral partikülleri süpernatan içine serbest bırakmak için tüm vücut ve bacak örneklerini beş dakika boyunca 26 hertz'de tritüre edin. Hücresel kalıntıları pelitlemek için tüm numuneleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyerek berraklaştırın.

Numunelerle aşılamadan hemen önce, ortamı önceden hazırlanmış Vero hücrelerinden çıkarın. Gövdelerden veya bacaklardan 100 mikrolitre arıtılmış süpernatantları dikkatlice alıkoyun, pelitten sivrisinek hücresi kalıntılarını rahatsız etmemeye dikkat edin. Ardından, plakaları bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa bir mililitre metilselüloz kaplama ekleyin ve plakaları üç ila yedi gün boyunca inkübatöre geri koyun. Kaplama plakalarını inkübatörden çıkarın ve bir biyo güvenlik kabinine getirin. Metilselüloz kaplamayı %10 ağartıcı içeren bir tepsi tavasına atın ve her bir yıkamayı tepsi tavasına atarak her kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın.

PBS'yi çıkarın ve oyuk başına bir mililitre metanol-aseton ekleyin ve hücrelerin 30 dakika boyunca plakaya sabitlenmesine izin verin. Ardından, sabitleyiciyi atın ve plakaları kurumaya bırakın. Her bir kuyucuğu, steril olmayan PBS ile yıkama başına 15 dakika boyunca bir orbital plaka külbütörü üzerinde üç kez yıkayın, ardından her bir oyuğa bir mililitre engelleme çözeltisi ekleyin ve plakayı 15 dakika daha sallayın.

Her oyuğa 100 mikrolitre anti Zika Virüsü veya anti flavivirüs birincil antikoru ekleyin ve plakayı gece boyunca sallanarak inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın ve yıkamaları PBS ile tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve bir saat boyunca sallanırken plakayı inkübe edin.

Yıkamaları PBS ile tekrarlayın, ardından oyuk başına 100 mikrolitre substrat geliştirme reaktifi ekleyin ve plakayı 15 dakika sallayın. Odaklar veya plaklar geliştiğinde, plakayı musluk suyuyla durulayarak reaksiyonu durdurun. Musluk suyunu dökün ve plakaların kurumasına izin verin, ardından verilen numunede bulunan odak oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için viral odakları ölçün.

Üç sivrisinek popülasyonu, bir dizi kan unu titresi üzerinde bir Zika Virüsü salgın suşuna maruz bırakıldı. Takip eden iki hafta boyunca, enfeksiyon, yayılma ve potansiyel bulaşma oranını belirlemek için sivrisinek alt kümeleri işlendi. Düşük kan unu titrelerinde, Salvador, Brezilya'dan gelen sivrisinekler 4, 10 ve 14 günlük ekstrinsik inkübasyondan sonra enfekte oldu ve test edilen bacaklarda yaygın enfeksiyon kanıtı gözlenmedi.

En yüksek titrede, virüs sivrisineklerin bacaklarında tespit edildi, ancak tükürükte tespit edilmedi. Dominik Cumhuriyeti'nden gelen sivrisineklerin enfeksiyona en duyarlı olduğu ve test edilen tüm kan unu titrelerinde en fazla bulaşma yetkilisi olduğu kanıtlandı. Her üç dozu da besleyen sivrisinekler, enfeksiyondan 14 gün sonra yedi gün yayılma ve bulaşma yeterliliği gösterdi.

Teksas'taki Rio Grande Vadisi'nden gelen sivrisinekler, daha düşük kan unu titrelerine maruz kalırken, enfeksiyondan dört gün sonra enfekte olurken, 14 gün sonra yayılmış enfeksiyonlar bulundu. En yüksek titreye maruz kalan kohortta, enfeksiyondan sonraki ikinci günden itibaren enfeksiyon gözlendi ve 4, 10 ve 14 günlerde zirvelere ulaştı. Yaygın enfeksiyonlar yedi günde gözlendi ve 10 günde sadece tek bir sivrisinek bulaşma yeteneğine sahipti.

Bu protokolü denerken, hızlı değil, güvenli bir şekilde çalışmak önemlidir. Bu nedenle, enfekte olmuş veya potansiyel olarak enfekte olmuş sivrisinekleri, bacakları veya kanatları çıkarılana kadar her zaman bir torpido gözü veya biyo güvenlik kabininin sınırları içinde tutun. Temel vektör yeterliliği iş akışı, bulaşma çalışmaları gibi aşağı akış analizleri için enfekte sivrisinekler üretmenin yanı sıra sivrisinekler, virüs ve mikrobiyom arasındaki etkileşimleri incelemek üzere uyarlanabilir.

Vektör yeterliliği, viral hastalık salgınları sırasında sivrisineklerin virüs bulaştırmadaki rolünü anlamak için gerçekten önemli bir araç olmuştur ve bu, onlarca yıldır geçerlidir. Ama aynı zamanda, bu virüsler ve sivrisinek vektörleri arasındaki etkileşimler hakkında öğrendiğimiz yeni bilgileri dahil etmek için yıllar içinde gelişen bir yöntemdir. Sadece iki örnek vermek gerekirse, virüsün genetik popülasyonu, sivrisinek içindeki popülasyonun karmaşıklığı, bulaşma yeteneği için çok önemli olduğu ortaya çıkıyor ve şimdi bunu, viral popülasyonu sıralamak için yeni yöntemlerle vektör yeterlilik çalışmalarına dahil edebiliriz.

Artık sivrisineklerin gastrointestinal sisteminde yaşayan bakteri ve diğer organizmaların popülasyonunun da bulaşma yetenekleri üzerinde büyük bir etkiye sahip olabileceğini biliyoruz ve bu popülasyonu şimdi dizilemede yeni yöntemlerle de değerlendirebiliriz. Dolayısıyla vektör yetkinliği, bu karmaşık etkileşimler hakkında daha fazla şey öğrendikçe gelişen ve gelişmeye devam eden bir yöntemdir.