Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Arbovirüsler tarafından tetiklenen salgınlarda, karşı önlemler büyük ölçüde sivrisineklerin azaltılmasıyla sınırlıdır. Bu nedenle, vektör yetkinlik analizleri kritik önleme stratejileridir; çünkü hangi sivrisinek popülasyonlarının ve türlerinin belirli bir arbovirüs için vektör olarak hizmet edebileceğini ve dolayısıyla hedef alınması gerektiğini belirlerler. Bu nedenle, sivrisineklerin ve diğer vektörlerin bulaşıcı hastalıkların yayılmasındaki rolünü değerlendirmek için kullandığımız araç setindeki en önemli bileşenlerden biri vektör yetkinlik çalışmasıdır. Bunlar; sadece sivrisinek veya kene türünü değil, aynı zamanda coğrafi suşları ve farklı bir virüsün veya diğer bulaşıcı organizmaların çok spesifik suşlarını da çok hassas bir şekilde kontrol edebildiğimiz deneylerdir; böylece dünyanın çok spesifik bölgelerinde farklı ajanların bulaşmasında farklı türlerin taşıdığı riskler hakkında çok kesin ve iyi kontrollü veriler elde edebiliriz. Enfekte sivrisineklerle çalışmak, hem deney yapan kişi için riskleri hem de enfekte bir sivrisineğin kaçma riskini minimize etmek için özel tesisler, eğitim, deneyim ve dikkatli bir planlama gerektirir. Bu nedenle, bu tesislerdeki yeni kişilerin, tekniklere ve iş akışına aşina olmak için enfekte edilmemiş kanla beslenen sivrisineklerle çalışmaya zaman ayırmaları oldukça önemlidir.

Maruz bırakma gününde, besleme ünitelerini önceden ısıtmak için bir eklem bacaklılar (arthropod) muhafaza tesisindeki güç kaynağını açın. Yeni toplanmış sitratlı veya heparinli insan kanını, bir viral stok ile bire bir hacim oranında birleştirin ve standart üç mililitrelik bir rezervuar ünitesinin üzerini enfekte olmamış naif bir farenin derisiyle örtün. Örtülü rezervuarı beyaz kağıt havluların üzerine yerleştirin ve rezervuara yaklaşık iki mililitre enfeksiyöz kanı, her seferinde bir mililitre olacak şekilde ekleyin.

Ardından, sızıntı olmadığını doğrulamak için kağıt havlu ile kontrol edin. Enfektif analizden 24 saat önce, Vero hücreleri içeren 24 kuyucuklu hücre kültürü plakalarını hazırlayın ve her kuyucuğu sivrisineğin ve numunenin kimliğiyle etiketleyin. Sivrisineklerin enfektif kan öğününe maruz bırakılacağı sabah, suya doygun pamuk toplarını çıkarın ve yapay kan öğünlerini içeren rezervuarları, şeffaf plastik bir muhafaza eldiven kutusuyla besleme ünitesi hatlarına bağlayın.

Aç bırakılmış sivrisineklerin bulunduğu karton kutuyu, besleme ünitesinin altındaki glove box'a yerleştirin. Besleme işlemi tamamlandığında, rezervuarı çıkarın ve taze hazırlanmış %10'luk çamaşır suyuna daldırın. Glove box içerisinde, soğuk anestezi altındaki sivrisinekleri buz üzerindeki bir Petri kabına dökün ve karnı doymuş sivrisinekleri doymamış olanlardan ayırın.

Şişkin sivrisinekleri karton kutuya geri boşaltın, kutuyu hızlıca bir tel örgü ve kapakla kapatın. Kartonun üzerindeki fazla tel örgü kısmını kesin ve kapağı bantla sabitleyin. Tel örgünün üzerine steril filtrelenmiş %10 sükroz ile doyurulmuş bir pamuk topu ekleyin ve nemi korumak için nemli bir sünger içeren büyük, plastik bir ikincil konteynera kartonu yerleştirin.

Deneyler tamamlanana kadar, sivrisineklerin sükroza ad libitum erişimine izin vererek ikincil kabı 27 °C'de inkübe edin. Kartondan önceden belirlenmiş sayıda inkübe edilmiş sivrisineği toplamak için mekanik bir aspiratör kullanın ve işlem bittiğinde toplama tüpünü pamuklu bir diskle kapatın. Glove box içerisinde çalışarak, soğuk anestezi altındaki sivrisinekleri buz üzerindeki bir Petri kabına boşaltın.

Her bir sivrisineğin altı bacağının tamamını çıkarın ve bunları, sterilize edilmiş paslanmaz çelik bir bilye ve 500 µL sivrisinek toplama medyumu (MCM) içeren, önceden etiketlenmiş iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Sivrisineği, yağın başa veya proboskise temas etmemesine dikkat ederek nazikçe bir mineral yağı damlasının üzerine yerleştirin. Proboskisi, 10 µL ısı ile inaktive edilmiş FBS ile doldurulmuş bir mikro pipet ucuna yerleştirin ve sivrisineğin 30 dakika boyunca tükürük salgılamasına izin verin.

Tükürükle birlikte pipet ucunu 100 µL MCM içeren bir mikro santrifüj tüpüne boşaltın ve gövdeyi, sterilize edilmiş çelik bilye ve 500 µL MCM içeren ayrı bir 2 mm'lik tüpe yerleştirin. Tüpleri bir biyogüvenlik kabini içerisinde boncuklu değirmen doku homojenizasyon cihazına taşıyın ve viral partiküllerin süpernatanta geçmesini sağlamak için tüm gövde ve bacak örneklerini 26 Hz'de beş dakika boyunca tritüre edin. Hücresel kalıntıları çöktürmek için tüm örnekleri 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ederek berraklaştırın.

Numunelerle inokülasyondan hemen önce, önceden hazırlanmış Vero hücrelerindeki medyumu uzaklaştırın. Pellet içerisindeki sivrisinek hücresi kalıntılarını rahatlatmamaya dikkat ederek, gövdelerden veya bacaklardan elde edilen berraklaştırılmış süpernatanlardan her bir kuyucuğa dikkatlice 100 µL alikotlayın. Ardından, plakaları bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, her kuyucuğa bir mililitre metilselüloz overlay ekleyin ve plakaları üç ila yedi gün boyunca tekrar inkübatöre yerleştirin. Overlay plakalarını inkübatörden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine taşıyın. Metilselüloz overlay'i %10 çamaşır suyu içeren bir tepsiye boşaltın ve her kuyucuğu iki kez PBS ile yıkayarak her yıkama işlemini aynı tepsiye boşaltın.

PBS'yi uzaklaştırın, her kuyucuğa bir mililitre metanol-aseton ekleyin ve hücrelerin plakaya fikse olması için 30 dakika bekleyin. Ardından, fiksatörü dökün ve plakaları kurumaya bırakın. Her kuyucuğu, orbital plaka sallayıcıda her yıkama için 15 dakika olacak şekilde steril olmayan PBS ile üç kez yıkayın, ardından her kuyucuğa bir mililitre bloklama solüsyonu ekleyin ve plakayı 15 dakika daha sallayın.

Her kuyucuğa 100 µL anti-Zika Virüsü veya anti-flavivirüs primer antikoru ekleyin ve plakayı sallayarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün primer antikoru uzaklaştırın ve PBS ile yıkama işlemlerini tekrarlayın. Son yıkamadan sonra 100 µL sekonder antikor ekleyin ve plakayı sallayarak bir saat boyunca inkübe edin.

PBS ile yıkama işlemlerini tekrarlayın, ardından her kuyucuğa 100 microliter substrat geliştirme reaktifi ekleyin ve plakayı 15 dakika boyunca sallayın. Odaklar veya plaklar geliştiğinde, plakayı musluk suyuyla durulayarak reaksiyonu durdurun. Musluk suyunu dökün ve plakaların havada kurumasını bekleyin, ardından verilen örnekte bulunan odak oluşturucu birim sayısını belirlemek için viral odakları sayımlayın.

Üç sivrisinek popülasyonu, çeşitli kan öğünü titreliklerinde bir Zika Virüsü salgın suşuna maruz bırakılmıştır. Takip eden iki hafta boyunca, enfeksiyon, yayılım ve potansiyel bulaşma oranını belirlemek amacıyla sivrisinek alt grupları işleme alınmıştır. Düşük kan öğünü titreliklerinde, Brezilya, Salvador'dan gelen sivrisinekler 4, 10 ve 14 günlük ekstrinsik inkübasyon sonrası enfekte olmuş, ancak analiz edilen bacaklarda yayılmış enfeksiyona dair herhangi bir kanıt gözlemlenmemiştir.

En yüksek titrede virüs, sivrisineklerin bacaklarında tespit edildi ancak tükürükte saptanmadı. Dominik Cumhuriyeti'nden gelen sivrisineklerin enfeksiyona karşı en duyarlı olduğu ve test edilen tüm kan öğünü titrelerinde transmisyon yeteneğinin en yüksek olduğu kanıtlandı. Üç dozla da beslenen sivrisinekler, enfeksiyon sonrası yedinci günde yayılım ve 14. günde transmisyon yeteneği gösterdi.

Teksas'taki Rio Grande Vadisi'nden alınan ve daha düşük kan öğünü titrelerine maruz bırakılan sivrisineklerde, enfeksiyon enfeksiyon sonrası dördüncü gün kadar erken bir dönemde görülürken, yaygın enfeksiyonlar 14 gün sonra tespit edilmiştir. En yüksek titreye maruz kalan kohortta ise enfeksiyon enfeksiyon sonrası ikinci günden itibaren gözlemlenmiş ve 4, 10 ve 14. günlerde zirve noktalarına ulaşmıştır. Yaygın enfeksiyonlar yedinci günde gözlemlenmiş ve 10. günde yalnızca tek bir sivrisineğin bulaştırma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür.

Bu protokol uygulanırken, hızlı çalışmaktan ziyade güvenli çalışmaya önem verilmelidir. Bu nedenle, enfekte veya potansiyel olarak enfekte sivrisinekler, bacakları veya kanatları çıkarılana kadar her zaman bir glove box veya biyogüvenlik kabini içerisinde tutulmalıdır. Temel vektör yetkinliği iş akışı, transmisyon çalışmaları gibi sonraki analizler için enfekte sivrisinekler üretmek ve aynı zamanda sivrisinekler, virüs ve mikrobiyom arasındaki etkileşimleri incelemek amacıyla uyarlanabilir.

Vektör yetkinliği, viral hastalık epidemileri sırasında virüslerin taşınmasında sivrisineklerin rolünü anlamak için on yıllardır gerçekten önemli bir araç olmuştur. Ancak bu yöntem, virüsler ve sivrisinek vektörleri arasındaki etkileşimler hakkında yeni bilgiler öğrendikçe, bu bilgileri kapsayacak şekilde yıllar içinde evrilmiştir. İki örnek vermek gerekirse, virüsün genetik popülasyonu, yani sivrisinek içindeki popülasyonun karmaşıklığı, virüsün bulaştırma yeteneği için çok önemli görünmektedir ve artık viral popülasyonu dizilemeye yönelik yeni yöntemlerle bunu vektör yetkinliği çalışmalarına dahil edebiliyoruz.

Ayrıca, sivrisineğin gastrointestinal sisteminde yaşayan bakteri ve diğer organizma popülasyonlarının, taşıma kapasiteleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabildiğini biliyoruz ve artık yeni dizileme yöntemleriyle bu popülasyonu değerlendirebiliyoruz. Dolayısıyla vektör yetkinliği, bu karmaşık etkileşimler hakkında daha fazla bilgi edindikçe gelişmiş ve gelişmeye devam eden bir yöntemdir.