Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım

Mikrobubble ajanları ile odaklanmış ultrason odaklama odak ve geçici kan beyin bariyeri açabilirsiniz. Bu teknik, kan beyin bariyeri boyunca çok çeşitli ajanlar sunmak için kullanılmıştır. Bu makale, MRI kılavuzu olsun veya olmadan kemirgen beynine lokalize teslimat için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Fokuslu Ultrason, dolaşımdaki mikro kabarcıklarla birlikte, kan-beyin bariyerinde geçici milimetre boyutunda açıklıklar sağlamak için kullanılabilir. Bu, sistemik olarak dolaşan ajanların hedef beyin bölgelerine non-invaziv olarak verilmesini sağlar. Başlamak için, kateter tıkacını tuzlu suyla doldurun ve farenin kuyruğunu bir lamba ile ısıtın, hayvanı aşırı ısıtmamaya dikkat edin.

Mikro kabarcıklar, Evans mavisi boyası, MRI kullanılıyorsa gadobutrol MRI kontrastı ve ilgilenilen deneysel ajanı vermek için kullanılacak 24 gauge kuyruk ven kateterini yerleştirin. Damar vurulduğunda kılıfı kan dolduracaktır. Kılıfı damarın içine daha fazla iterken iç iğneyi yavaşça çıkarın.

Kateter tapasını, port kanla dolar dolmaz kateter portunun ucuna vidalayın. Üstte küçük bir parçadan başlayarak ve kaudal yönde ilerleyerek yerinde tutmak için kateterin ve kuyruğun etrafına laboratuvar bandını dikkatlice sarın. Kateter tıkacının en ucunu açıkta bırakın.

Anestezi hattını stereotaktik çerçevedeki anestezi konektörüne takın. Ardından, ağzı ısırma çubuğuna yerleştirerek ve kulak çubuklarını her iki kulak kanalına yönlendirerek ve ayar vidalarını sıkarak hayvanın kafasını çerçeveye sabitleyin. Hayvanı MRI yatağına taşıyın.

Metin makalesinde açıklanan parametreleri kullanarak, koordinat ölçümleri için MRI referansının yanı sıra tüm beyni yakalayan koronal ve eksenel T2 ağırlıklı görüntüleri toplayın. Koronal görüntülerde, güvenin merkezini gösteren, güvenin en büyük olduğu görüntüyü bulun. Hem medial-lateral yönde hem de dorsal-ventral yönde, referans noktasının tepesinden ilgilenilen beyin bölgesine olan mesafeyi milimetre cinsinden kaydedin.

Eksenel görüntülerde, referansın en üstünü gösteren görüntüyü bulun ve referansın merkezi için X ve Y koordinatlarını ve ilgilenilen beyin bölgesinin X ve Y koordinatlarını kaydedin. Referans merkezinden hedef beyin bölgesine olan mesafeyi hem rostral-kaudal hem de medial-lateral yönlerde hesaplayın. Koordinatları topladıktan sonra, ön tarama görüntülerini toplayın.

Hayvanı bu stereotaksik çerçevede tutarak, MRI yatağından hızlı bir şekilde tezgah üstü FUS kurulumuna taşıyın. Hayvanın anestezi etkisi altında uykuda kaldığından emin olun. Çerçeveyi çerçeve tutucuya kaydırın ve sıkıca yerine oturtun.

Hayvanın kafasını tıraş etmek için makas kullanın, ardından fazla tüyleri fırçalayın ve saç derisine tüy dökücü krem sürün. Üç dakika bekletin ve su ve gazlı bezle silin. MRG kılavuzu kullanıyorsanız, işaretçiyi takın ve işaretçiyi MRG referansının konumuna getirin.

İmleci, MRG görüntüsündeki tüm mesafelerin hesaplandığı nokta olan MRG referansının en üstüne ve ortasına yerleştirin. İşaretçiyi çıkarın ve konumlandırıcıyı medial-lateral koordinatlara ve rostral-kaudal koordinatlara getirin. Su banyosunun ve ultrason jelinin yerleştirilmesine izin vermek için boş konum düğmesini yalayın ve yukarı 50 düğmesine basarak konumlandırıcıyı yukarı kaldırın.

Hayvanın kafa derisine ultrason jeli uygulayın ve su banyosunu hayvanın üzerine yerleştirin, poliimid bant penceresi jelin üzerine bastırılmış ve jelde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Su banyosunu gazı alınmış su ile doldurun. Yüksek güç dönüştürücüsünü kullanıyorsanız, konumlandırıcıyı mıknatıs suyun hemen üzerinde olacak şekilde indirin.

Dönüştürücüyü belirli bir açıyla suya dikkatlice indirerek ve mıknatısları bağlayarak dönüştürücüyü konumlandırıcıya takın. Konumlandırıcıyı dorsal-ventral koordinata indirin ve RF gücünü açın. Kateter tıkacına bir iğne ucu sokarak ve enjekte ederek kilogram başına bir mililitre %3 Evans mavi boya enjekte edin.

Tüm hayvan saniyeler içinde mavi hale gelmelidir, bu da kateterin kuyruk damarına düzgün bir şekilde yerleştirildiğini gösterir. Boyanın beş dakika boyunca dolaşmasına izin verin, ardından mikro kabarcıkları kabarcık çalkalayıcı ile şiddetli bir şekilde sallayarak etkinleştirin. Mikro kabarcıkların düzgün bir dağılımını elde etmek için bu şırıngayı birkaç kez ters çevirin, ardından kanatlı infüzyon setini takın ve doldurun.

Şırıngayı infüzyon pompasının üzerine yerleştirin ve infüzyon pompasını saatte altı mililitre hızında 0,2 mililitre verecek şekilde ayarlayın, bu da iki dakikalık FUS maruziyeti boyunca mikro kabarcıkların yavaş infüzyonunu sağlar. Kanatlı iğneyi kateter tapasına yerleştirin. Önce infüzyon pompasını çalıştırın, üç saniye bekleyin, ardından açma düğmesine ve fonksiyon üretecine basarak FUS tedavisini başlatın.

Mikro baloncukların temizlenmesini sağlamak için bunu bölge başına beş dakika olacak şekilde iki kez tekrarlayın. İnfüzyon pompası iki dakika sonra durduğunda FUS tedavisini durdurmak için fonksiyon üreteci üzerindeki açma düğmesine tekrar basın. Mikro kabarcıkların temizlenmesi için beş dakika bekleyin, ardından infüzyona ve ikinci FUS tedavisine başlayın.

İkinci FUS tedavisinden hemen sonra, gadobutrol kontrastı ve ilgilenilen ajanı enjekte edin. Tüm ajanların toplam teslim hacmi kilogram başına beş mililitreyi geçmemelidir. BBB'nin açılmasını doğrulamak için, hayvanı aynı yerde MRI yatağına geri yerleştirin ve anestezi hattını takın.

BBB açıklığı bölgesinde gadobutrol MRG gelişimini doğrulamak için tarama öncesi görüntülerle aynı görüntüleme parametrelerine sahip MRI son taramalarını toplayın. Bu protokol, hem düşük güçlü daldırma dönüştürücü hem de yüksek güçlü odaklanmış ultrason dönüştürücü ile lokalize kan-beyin bariyeri açılmasını indüklemek için kullanıldı. İlk olarak, düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü, anterior veya medial beyin yarımküresine hedeflendi.

Hayvanlar perfüzyonlu veya perfüzyonsuz olarak sakrifiye edildi ve BBB açılışı Evans mavi boya oto-floresan ile görselleştirildi. Daha sonraki deneylerde, FUS dönüştürücüsü ya hipokampus ya da ön singulat kortekse hedeflendi. Evans mavi boyasına ek olarak, VIVO'da BBB'nin hedeflenen açılışını doğrulamak için MRI kontrast maddesi gadobutrol kullanıldı.

Hayvanlar kurban edildikten sonra, Evans mavi boya otomatik floresan açılış yerini doğruladı. Bu tekniğin hedeflenen gen iletimi için kullanılıp kullanılamayacağını değerlendirmek için, hipokampusta kan beyin bariyeri açıldıktan hemen sonra yeşil floresan proteini ve gadobutrol kontrastını ifade eden AAV dokuz enjekte edildi. Hayvan, açıklığı gadobutrol kontrastı ile doğrulamak için görüntülendi.

Daha sonra, gen iletimi GFP ekspresyonu ile doğrulandı. Bu protokol, stereotaktik cerrahiye non-invaziv bir translasyonel alternatif sağlamak için diğer laboratuvarlar tarafından kolayca uyarlanabilen, MRG kılavuzluğunda Fokus Ultrason aracılı kan-beyin bariyeri açılışına tezgah üstü bir yaklaşım sunar.