Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması

Bu teknik, invaziv etiketlemeye ihtiyaç duymadan hücrenizin kimliğini veya fizyolojik özelliklerini tek hücre düzeyinde kanıtlamak için benzersiz bir araştırma sunar. Bu tekniğin temel avantajları, analiziniz için tek hücre düzeyinde uzamsal çözünürlüğü kolaylaştırması ve arka plan süreci arasında ayrım yapılmasına izin vermesidir. Dolayısıyla bu teknik, patojenik mikropların tanımlanmasına ve fenotipik analizine potansiyel olarak katkıda bulunabilir.

Bu teknik aynı zamanda fenotipik heterojenliğin incelenmesine veya ilgilenilen mikrobiyal popülasyonun fizyolojik durumunun izlenmesine de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yardımcı doçent olan Kyosuke Takabe olacak. Konfokal yansıma mikroskobu ve çok kanallı konfokal mikrospektroskopi kurulumu.

Taranmamış spektral kanallara sahip konfokal mikroskobu bir fotoçoğaltıcı tüpe bağlayın. Mikroskobu, yeterli bir büyütme ile yüksek sayısal açıklık objektifi ile donatın. Ve hücre morfolojisini görselleştirmek için gelen ışığın hücresel saçılımına dayanan konfokal yansıma mikroskobunu barındırmak için mikroskobu bir yarı yansıma aynası ile donatın.

Çok kanallı konfokal mikrospektroskopi için, mikroskobu dikroik aynalarla donatın ve her uyarma dalga boyu için aydınlatma yoğunluğunu ayarlamak için bir lazer güç ölçer kullanın. Ardından mikroskop altındaki çıktıyı, uyarma dalga boyları boyunca sabit olacak şekilde ayarlayın. Bakterileri mikroskopta görüntülemek için, mikroskop yazılımında iğne deliği boyutunu 1.0 alan birimine ayarlayın ve her uyarma dalga boyu için piksel bekleme süresini ayarlayın.

Tarama çözünürlüğünü ayarlayın. Bakteriler gibi küçük hücreler için 1024'e 1024'lük bir tarama alanı kullanın. Z-Tarama aralığını, ilgilenilen bölge kapsanacak şekilde ayarlayın.

Ve sekiz ila 10 nanometrelik bir spektral pencere kullanarak, D-Scan dedektörünü görünür dalga boyu aralığını yakalayacak şekilde ayarlayın. Ardından, floresan görüntülerinin ve konfokal yansıma mikroskobu görüntülerinin Z-Yığınlarını oluşturmak için en uzundan en kısa uyarma dalga boylarına kadar bir sırayla çok kanallı konfokal mikrospektroskopi görüntüleri elde edin ve görüntüleri 16 bit tiff formatında kaydedin. Hücre segmentasyonunu ve tek hücreli doğuştan gelen floresan imzaların yeniden yapılandırılmasını gerçekleştirmek için uygun bir görüntü analizi yazılım programı açın ve sağlanan komut dosyalarından birini açmak için çift tıklayın.

Düzenleyici sekmesi altında, çalıştır'a tıklayın. Bir klasör seçim penceresi görünecektir. Z-Stack görüntülerinin kaydedildiği dizini seçin ve aç'ı tıklatın.

Segmentasyon parametresinin girilmesini isteyen bir iletişim kutusu otomatik olarak görünecektir. Görüntü ikili oluşturma eşiğini 0-1 olarak, görüntü ikili oluşturmayı 0,45 olarak, bir hücre bölgesi için üst eşiği 200 olarak, bir hücre bölgesi için alt eşiği 10 olarak ve dedektör sayısını 32 olarak ayarlayın. Uyarma dalga boylarının sayısı için giriş isteyen bir iletişim kutusu görünecektir.

Görüntü alımı için kullanılan dalga boylarının sayısını girin ve Tamam'a tıklayın. Uyarma dalga boyları için giriş isteyen bir iletişim kutusu görünecektir. Uyarma dalga boylarını en kısadan en uzuna doğru sırayla girin ve Tamam'ı tıklayın.

Konfokal yansıma mikroskobu görüntüsü sunan yeni bir görüntü penceresi görünecektir. Arka plan çıkarma işlemi için kullanılacak rastgele bir arka plan bölgesi seçin ve konfokal yansıma mikroskobu görüntüsünün içinde bir dikdörtgen çizin. Seçimi onaylamak ve imza adlı yeni bir dizini bulmak için seçilen bölgeye çift tıklayın.

Boyutsal indirgeme tekniklerini gerçekleştirmek için boş bir dizin oluşturun ve dizini parent_directory adlandırın. İki hücre popülasyonunun her birinin floresan imzalarını iki ayrı dizinde saklayın ve iş istasyonunun komut satırı arayüzünü açın. Komutu girin.

Hedef dizini seç görüntülendiğinde, parent_directory seçin. Ardından parent_directory klasöründe PCA'yı bulun. Elde edilen temel bileşen analizi grafiğini içerecek olan PNG dosyası.

Burada, geleneksel bir spektrum grafiği ve bir ısı haritası olarak sunulan bir bakteri hücresinin tipik bir tek hücreli floresan imzası gösterilmektedir. Bu şekilde, bir toprak bakterisi popülasyonunun orijinal konfokal yansıma mikroskobu görüntüsünün üzerine bindirilmiş yanlış 2D hücre segmentasyonu gözlemlenebilir. Popülasyon için ortaya çıkan doğuştan gelen floresan imzalar bir ısı haritası olarak sunulur.

Başarılı hücre segmentasyonunu takiben popülasyon içi değişkenliğin nispeten küçük olduğunu unutmayın. Burada, yanlış hücre segmentasyonunun bir örneği, daha önce gösterildiği gibi aynı P.putida popülasyonuna süper olarak uygulanmış olarak gösterilmiştir. Yanlış hücre segmentasyonunun popülasyonun doğuştan gelen floresan imzaları üzerindeki etkisi, ilgili ısı haritasında gözlemlenen önemli sayıda aykırı değerden kolayca anlaşılabilir.

Yanlış hücre segmentasyonu, doğru hücre segmentasyonunu takiben elde edilen tip kümesine kıyasla, temel bileşen analizinden sonra daha gevşek bir küme ile sonuçlanır. Bireysel bakteri suşlarında gözlemlenen doğuştan gelen floresan imzanın küçük değişkenliklerine rağmen, her popülasyon temel bileşen analizi grafiğinde ayrı bir küme oluşturur. Bu şekilde, tomurcuklanan bir maya Saccharomyces cerevisiae YM4271 popülasyonunun orijinal konfokal yansıma mikroskobu görüntüsünün üzerine bindirilmiş yanlış 3D hücre segmentasyonu gözlemlenebilir.

Aykırı değerlerin eksikliğine ve popülasyon için ortaya çıkan doğuştan gelen floresan imzalara dikkat edin. Konfokal mikroskopi ile mümkün olduğunca temiz bir görüntü elde etmek ve gürültü sonraki analizin doğruluğunu bozabileceğinden sinyal yoğunluğu doygunluğundan kaçınmak önemlidir. Sınıflandırma veya tahmin görevlerinde kullanılmak üzere doğuştan gelen Western imza veri kümesiyle makine öğrenimi modellerini eğitebilir, etiketsiz bir popülasyon analizi ve fenotipik tahmin sunabilirsiniz.