Name: Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi ve çok kanallı mikrospektroskopi kullanarak tek hücreli doğuştan floresan imzalarını yeniden yapılandırmayı. Bu yöntem, bakteri, mantar ve maya hücrelerinde fenotipik çeşitliliği etiketsiz analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Japonya Eğitim, Kültür, Spor ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (18K04843) Y. Yawata'ya, JST ERATO'dan (JPMJER1502) N. Nomura'ya bilimsel araştırmalar için bir hibe ile desteklendi.

1. Numunenin hazırlanması
<ol><li>Cam bir kaydırağın üzerine kuyulu 1 mm kalınlığında silikon conta yerleştirin.</li>
	<li>Silikon contanın kuyusuna 1 mm kalınlığında %0,8 (w/v) agarose levha yerleştirin.</li>
	<li>Rastgele bir mikrobiyal hücre kültürünün hücre yoğunluğunu 600 nm (OD660) = 1.0 optik yoğunluğa seyreltin.</li>
	<li>Agarose levhasına 5 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.</li>
	<li>Cam bir kapakla hafifçe örtün.</li>
</ol>2. Mikroskop kurulumu
NOT: CRIF tekniği konfokal yansıma mikroskopisi (CRM) ve çok kanallı konfokal mikspektoskopiyi birleştirir. CRM, hücresel morfoloji ve hücresel doğuştan gelen floresan bağımsız mekansal lokalizasyon için bilgi kaynağı olarak hizmet vermektedir. Çok kanallı konfokal mikspektif, hücresel doğuştan gelen floresan spektral bilgilerini sağlar. Aşağıdaki protokolde CRM veya konfokal floresan mikspektroskopi ile elde edilen herhangi bir görüntüye sırasıyla CRM görüntüsü veya çok kanallı konfokal mikspektroskopi görüntüsü denir.
<ol><li>Descanned spektral kanallara sahip bir konfokal mikroskobu fotomultiplier tüpe (PMT) veya GaAsP dedektörüne bağlayın. NOT: Bu kurulumlar çeşitli üreticilerden edinilebilir.</li>
	<li>Mikroskobu yüksek sayısal diyafram açıklığı (NA) hedefiyle yeterli büyütme ile donatın. NOT: Bakteri hücrelerini analiz etmek için NA &gt; 1.4 ile 63x hedefi önerilir.</li>
	<li>Hücre morfolojisini görselleştirmek için olay ışığının hücresel dağılımını sağlayan CRM'ye uyum sağlamak için mikroskobu yarı yansıma aynası (örneğin NT 80/20) ile donatın.</li>
	<li>Çok kanallı konfokal mikrospektroskopi için mikroskobu dikroik aynalarla donatın. Örneğin, sırasıyla 405, 458, 488, 514 veya 633 nm heyecan vericileri için MBS InVis405, MBS458, MBS488/514, MBS488/543/633 ışın ayırıcılarını kullanın.</li>
	<li>Lazer güç ölçer kullanarak her bir heyecan dalga boyu için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Uyarılma dalga boyları aracılığıyla mikroskop altındaki çıkışı sabit tutun (örneğin, 63x hedefiyle 50 μW kullanın).</li>
</ol>3. Görüntü alımı
<ol><li>Mikroskop yazılımını kullanarak iğne deliği boyutunu 1 AU olarak ayarlayın.</li>
	<li>Her heyecan dalga boyu için piksel bekleme süresini (yani tarama hızını) ayarlayın. NOT: Aşırı uzun piksel bekleme süresi hücrelere zarar verebilir. Hücrelere fotodamajı en aza indirmek için aşırı uzun piksel bekleme süresinden kaçının. Bakteriyel numuneler için, bir piksel bekleme süresi &lt;55.6 μs/μm2 (mikroskop altındaki ışınım çıkışı ~17 μW/cm2 olduğunda) genellikle büyüme inhibisyonunu önlemek için uygundur. Bu parametre organizmalara ve deneysel kurulumlara bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Tarama çözünürlüğünü ayarlayın. Bakteri gibi küçük hücreler için 1.024 x 1.024 tarama alanı kullanın.</li>
	<li>Z tarama aralığını, ilgi alanı kapsanması için ayarlayın. NOT: Agarose levha üzerine dağıtılan bakteriyel ve maya hücre örnekleri için genellikle ~15 μm'lik bir Z tarama aralığı yeterlidir.</li>
	<li>Descanned dedektörünü görünür dalga boyu aralığını (örneğin, 416−691 nm) yakalayacak şekilde ayarlayın. 8−10 nm'lik bir spektral pencere kullanın.</li>
	<li>Floresan görüntülerin Z yığınlarını oluşturmak için en uzundan en kısa heyecan dalga boylarına kadar bir dizi sırayla çok kanallı konfokal mikspestoskopi görüntüleri elde edin.</li>
	<li>CRM görüntülerini alın.</li>
	<li>Alınan görüntüleri 16 bit tiff dosyaları olarak bir dizine kaydedin. XXX'in heyecan dalga boyu olduğu, YY'nin dedektör kanal numarası, ZZ'nin Z dilim numarası ve "c" ve "z" dedektör numarası ve Z-dilim numarası için sırasıyla önekler olduğu XXXcYYzZZ.tif adlandırma kuralını kullanarak dosyaları adlandırın.<ol>
<li>Örneğin, çok kanallı konfokal mikrospektroskopi görüntüsü, dedektör dizisinin 1. dedektör kanalı olan 405 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ile alınırsa ve Z.tif yığınının 5. CRM görüntüleri için XXX yerine "CRM" dizesini kullanın (örneğin, "CRMc01z05.tif"). NOT: 2D veya 3D segmentasyonun görüntü verileri için en uygun olup olmadığına karar verin. Küçük hücrelerin 2D düzlemle sınırlandırıldığı durumlarda (örneğin, cam yüzeye yapışmış bakteri popülasyonu) bir 2D segmentasyon yöntemi kullanın. Hücre popülasyonunun üç boyutlu bir alana dağıtıldığı durumlarda (örneğin, biyofilmler ve doku örnekleri) veya hücre boyutlarının optik dilimin kalınlığından (örneğin, maya hücreleri, memeli hücreleri) daha büyük olduğu durumlarda 3D segmentasyon yöntemini kullanın. 2D segmentasyon için bölüm 4'e bakın; 3D segmentasyon için bölüm 5'e bakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 2D görüntü analizi
<ol><li>Bir iş istasyonunu görüntü analiz yazılımıyla donatın (örneğin, MATLAB).</li>
	<li>Hücre segmentasyonunu ve tek hücreli doğuştan gelen floresan imzalarının yeniden yapılandırılmasıni gerçekleştirin.<ol>
<li>Görüntü analiz yazılımını açın.</li>
		<li>Sağlanan "Script2D.m" komut dosyalarından birini çift tıklatın ve açın.</li>
		<li>Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'ı tıklatın. Bir klasör seçim penceresi görünmelidir.</li>
		<li>3.8. adımda oluşturulan dizini seçin ve devam etmek için Aç'ı tıklatın. Segmentasyon parametresinin girişini soran bir iletişim kutusu otomatik olarak görüntülenir. NOT: Test amacıyla sağlanan veri kümesini seçin ("Sample_2D"). Örnek veri kümesi sıkıştırılmış bir dosya olarak sağlanır ve önceden ayıklanmalıdır.</li>
		<li>Segmentasyon parametrelerini girin: Görüntü Binarizasyonu için Görüntü Binarizasyon Eşiği (0−1) = 0,45, Hücre Bölgesi için Üst Eşik (piksel cinsinden) = 200, Hücre Bölgesi için Alt Eşik (piksel cinsinden) = 10 ve Dedektör Sayısı = 32. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın. NOT: Bu parametreler görüntü kalitesine bağlı olarak ayarlama gerektirebilir.</li>
		<li>CRM görüntüsü sunan yeni bir görüntü penceresi görünmelidir. Arka plan çıkarma için kullanılacak rasgele bir arka plan bölgesi (örneğin, hücrelerin bulunmadığı alan) seçin. Fare sürükleyerek CRM görüntüsü içinde bir dikdörtgen çizin. Seçimi onaylamak için seçili bölgede çift tıklatın.</li>
		<li>4.2.4 adımında seçilen aynı dizinde İmza adlı yeni bir dizin bulun. NOT: Sağlanan kod otomatik olarak bu dizini oluşturur. "İmza" dizini, bir popülasyondaki her mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını, ortak bir "İmza" önekinden sonra seri olarak numaralanan dosyaları .png olarak depolar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D görüntü analizi
<ol><li>Bir iş istasyonunu görüntü analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) ile donatın.</li>
	<li>Hücre segmentasyonunu ve tek hücreli doğuştan gelen floresan imzalarının yeniden yapılandırılmasıni gerçekleştirin.<ol>
<li>Görüntü analiz yazılımını açın.</li>
		<li>Sağlanan "Script3D.m" komut dosyasını çift tıklatın ve açın.</li>
		<li>Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'ı tıklatın. Bir klasör seçim penceresi görünmelidir.</li>
		<li>3.8. adımda oluşturulan dizini seçin ve devam etmek için Aç'ı tıklatın. Segmentasyon parametrelerinin girişini soran bir iletişim kutusu otomatik olarak görüntülenir. NOT: Test amacıyla sağlanan veri kümesini seçin ("Sample_3D"). Örnek veri kümesi sıkıştırılmış bir dosya olarak sağlanır ve önceden ayıklanmalıdır.</li>
		<li>Segmentasyon parametrelerini girin: Görüntü binarizasyonu için Görüntü Binarizasyon Eşiği (0–1) = 0,01, Hücre Birimi için Üst Eşik (piksel cinsinden) = 1.000, Hücre Bölgesi için Alt Eşik (piksel cinsinden) = 20, X Piksel Boyutu [μm/piksel] = 0,26, Y Piksel Boyutu [μm/piksel] = 0,26, Z piksel Boyutu [μm/piksel] = 0,42 ve Dedektör Sayısı = 32. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın; heyecan dalga boylarının sayısını soran bir iletişim kutusu görüntülenir. NOT: Bu parametreler görüntü kalitesine bağlı olarak ayarlama gerektirebilir.</li>
		<li>Görüntü alma için kullanılan dalga boylarının sayısını girin (örneğin, 405, 488, 561, 630 kullanılıyorsa, diyalog kutusuna 4 girin). Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Heyecan dalga boylarını diyalog kutularına en kısadan (yani kutu adı: Heyecanlandırma No. 1) ile en uzun dalga boyuna kadar bir sırayla girin. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın; CRM görüntüsü sunan yeni bir görüntü penceresi açılmalıdır.</li>
		<li>Arka plan çıkarma için kullanılacak rasgele arka plan bölgesini (örneğin, hücrelerin bulunmadığı alan) seçin. Fare sürükleyerek CRM görüntüsü içinde bir dikdörtgen çizin. Seçimi onaylamak için seçili bölgede çift tıklatın.</li>
		<li>5.2.4 adımında seçilen dizinde İmza adlı dizini bulun. NOT: Sağlanan kod otomatik olarak bu dizini oluşturur. "İmza" dizini, bir popülasyondaki her bir mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını, ortak bir "İmza" önekinden sonra seri olarak numaralanan dosyaları .png olarak depolar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. İstatistiksel analiz
NOT: Hücre popülasyonlarının hiperspektrumlarının dağılımını görselleştirmek için boyutsal azaltma teknikleri (örneğin, ana bileşen analizi [PCA]) gerçekleştirin. Sağlanan komut dosyası (PCA.py) iki hücre popülasyonu (yani iki sınıf) için PCA yürütür.
<ol><li>Bir iş istasyonunu programlama dili ve beraberindeki kütüphaneler ve modüllerle donatın (Malzeme Tablosu).</li>
	<li>C sürücüsünde (veya eşdeğerinde) boş bir dizin oluşturun ve dizini "Parent_directory" (örneğin, C:/ Parent_ dizini).</li>
	<li>İki hücre popülasyonunun her birinin floresan imzalarını (örneğin, adım 4.2.7'de oluşturulan .png dosyaları) iki ayrı dizinde depolayın. NOT: İki dizin de "Parent_directory" içinde bulunmalıdır. C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">İmza01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">İmza02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">İmza01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">İmza02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>PCA.py "Parent_directory" içine indirin.</li>
	<li>İş istasyonunun komut satırı arabirimini açın.</li>
	<li>Komut satırı arabirimine "python C:/Parent_directory/PCA.py" yazın.</li>
	<li>'Hedef dizini seç' mesajı görüntülendikten sonra "Parent_directory" seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>"C:/Parent_directory"nde, ortaya çıkan bir PCA çizimi içeren "PCA.png" bulun.</li>
</ol>

<ol><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li>
<li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Then+and+now%3A+use+of+16S+rDNA+gene+sequencing+for+bacterial+identification+and+discovery+of+novel+bacteria+in+clinical+microbiology+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.</a> Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).</li>
<li>Amman, R., Fuchs, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+identification+in+microbial+communities+by+improved+fluorescence+in+situ+hybridization+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques.</a> Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).</li>
<li>Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacterial+species+by+fluorescence+spectroscopy+and+classification+through+principal+components+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis.</a> Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).</li>
<li>Leblanc, L., Dufour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+identity+of+bacteria+using+their+intrinsic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence.</a> FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).</li>
<li>Hou, X., Liu, S., Feng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescence+characteristics+of+bacterial+intracellular+and+extracellular+substances+during+the+operation+of+anammox+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor.</a> Scientific Reports. 7, 39289(2017).</li>
<li>Ramanujam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diagnosis+of+cervical+intraepithelial+neoplasia+using+337-nm-excited+laser-induced+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence.</a> Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).</li>
<li>Zhang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+cellular+fluorescence+reflects+alterations+in+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).</li>
<li>Gosnell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+non-invasive+cell+characterisation+and+discrimination+based+on+multispectral+autofluorescence+features%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features.</a> Scientific Reports. 6, 23453(2016).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecies+variability+of+single-cell+innate+fluorescence+signature+of+microbial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).</li>
<li>Nelson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.+Third+edition%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition</a>. , Springer. Germany. (2006).</li>
<li>Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+state+using+NADH+and+NADPH+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence.</a> Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging%3A+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yöntemde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yakından takip edilmesi gereken iki kritik nokta vardır: 1) mikroskop altındaki lazer güç çıkışını uyarım dalga boyları ve deneyleri ile tutarlı tutmak ve 2) doğru hücre segmentasyonu gerçekleştirmek.
İlk nokta, farklı deneyler arasında doğuştan gelen floresan imzasını karşılaştırırken özellikle önemlidir. Maksimum güç çıkışı lazer hatları arasında büyüklük sırasına kadar farklılık gösterebilir, çünkü aynı "çıkış yüzdesi" ayarlarını heyecan ...

Bir hücre içinde çeşitli biyomoleküller1 otofluoresans sinyalleri yayar ve bir hücrenin doğuştan gelen floresan imzası bu sinyallerin montajından oluşur. Bu imza floresan çeşitli hücresel özellikleri ve fizyolojik durum farklılıklarını yansıtır. Doğuştan gelen floresan analizi minimal invazivdir ve hafif metabolik modifikasyondan hücre yıkımına kadar bir dizi iz bırakan geleneksel, daha invaziv mikrobiyolojik probları tamamlayabilir. DNA veya hücre içeriği ekstraksiyonu2,3, floresan in situ hibridizasyon4 ve floresan muhabir genlerinin genoma girmesi gibi geleneksel teknikler hücre tipinin veya fizyolojik durumun belirlenmesinde etkili olsa da, genellikle hücrelerin manipülasyonunu veya invaziv etiketlemeyi gerektirir.
 Toplu mikrobiyal kültür süspansiyonları5,6, aktif çamurlar7, memeli dokuları8,9 ve memeli hücreleri1,10 dahil olmak üzere çeşitli canlı ve bozulmamış mikrobiyal kolonilerin doğuştan gelen floresan çalışmaları, doğuştan gelen floresan analizinin hücre tiplerinin ve fizyolojik durumun etiketsiz analizini kolaylaştırdığını göstermiştir. Doğuştan gelen floresan imzalar geleneksel olarak tek hücre düzeyinde değil, nüfus düzeyinde analiz edilmiştir ve bu nedenle klonal bir kültür gerektirmektedir. Buna karşılık, burada açıklanan confokal reflection mikroskopi destekli tek hücreli innate fluoresans analizi (CRIF) tekniği11, her bir canlı mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen hücresel floresan imzasını yeniden yapılandırır ve kataloglar. Ayrıca CRIF, üç boyutlu (3B) bir alanda dağıtılan bir popülasyondaki tek bir mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını sistematik olarak harmanlayabilir.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Wako Chemicals</td><td>312-01193</td><td></td></tr><tr><td>Işın ayırıcılar</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 veya MBS 488/543/633 ışın ayırıcılar (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)</td></tr><tr><td>Kapak kızakları</td><td>Matsunami Glass</td><td>C024601</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Matsunami Cam</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Yarım yansıma aynası</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>NT80/20</td></tr><tr><td>Lazer güç ölçer</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>PM400 (güç ölçer konsolu) ve S175C (sensör)</td></tr> <tr><td>LB Broth</td><td>Nacalai tesque</td><td>20066-95</td><td>Bakteri kültürü için</td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>MATLAB sürüm 2019a veya üstü, Görüntü İşleme Araç Kutusu gereklidir</td></tr><tr><td>Mikroskop objektifi</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td>440762-9904</td><td>örneğin 63x planı Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>Mikroskop yazılımı</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>ZEN (Carl Zeiss),NIS elemanları (Nikon)</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako Chemicals</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Programlama dili</td><td></td><td></td><td>Python ve kütüphaneler, modüller (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) sağlanan PCA betiğini çalıştırmak için gereklidir.</td></tr><tr><td>Silikon conta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P24744</td><td></td></tr><tr><td>İş İstasyonu</td><td></td><td></td><td>Ayrı GPU'lara sahip yüksek performanslı bir iş istasyonu önerilir.</td></tr><tr><td>Maya özütü-pepton-dekstroz (YPD) agar ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1500-250G</td><td>Maya kültürü için</td></tr><tr><td>YPD ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücreli doğuştan gelen floresan İmzalarının konfokal mikroskopi ile yeniden yapılandırılması

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Burada açıklanan konfokal yansıma mikroskopi destekli tek hücreli doğuştan gelen floresan analizi (CRIF), üç boyutlu (3D) bir alanda dağılmış bir popülasyondaki her bir canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzasını yeniden oluşturmak için minimal invaziv bir yöntemdir. Bir hücrenin doğuştan gelen floresan imzası, hücre içindeki çeşitli biyomoleküllerin yaydığı floresan sinyallerinin bir koleksiyonudur. Önceki çalışmalar, doğuştan gelen floresan imzaların fizyolojik durumdaki çeşitli hücresel özellikleri ve farklılıkları yansıttığını ve hücre karakterizasyonu ve tanımlanması için zengin bir bilgi kaynağı olduğunu ortaya konmuştur. Doğuştan gelen floresan imzalar geleneksel olarak nüfus düzeyinde analiz edilmiş, klonal bir kültür gerektirmiştir, ancak tek hücre düzeyinde değildir. CRIF özellikle 3D çözünürlük ve/veya bireysel hücrelerden floresan sinyallerinin seçici olarak çıkarılmasını gerektiren çalışmalar için uygundur. Floresan imzası bir hücrenin doğuştan gelen bir özelliği olduğundan, CRIF, sağlam ve tek hücrelerin türünün ve/veya fizyolojik durumunun etiketsiz tahmini için de uygundur. Bu yöntem, heterojen popülasyondaki her bir hücrenin fenotipinin hücre etiketlemesi olmadan bir mikroskop altında otofluoresans imzası ile doğrudan değerlendirilebileceği aerodinamik hücre analizi için güçlü bir araç olabilir.

Şekil 1A, geleneksel spektrum grafiği (üstte) ve ısı haritası (ortada) olarak sunulan bakteri hücresinin tipik tek hücreli floresan imzasını göstermektedir. Şekil 1B, toprak bakterisi popülasyonunun orijinal CRM görüntüsünün üzerine yerleştirilmiş doğru bir 2B hücre segmentasyonunun sonucunu göstermektedir (Pseudomonas putida KT2440)12. Popülasyon için ortaya çıkan floresan imzaları Şekil 1D'de bir ı...

Burada, üç boyutlu bir alanda dağıtılan her canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzalarının (yani hücresel otofluoresans) optik olarak çıkarılması ve kataloglanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, bakteri, mantar, maya, bitki ve hayvanlardan gelen hücreler de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerin doğuştan gelen floresan imzasını tek hücreli çözünürlükte incelemek için uygundur.

Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Bu teknik, invaziv etiketlemeye ihtiyaç duymadan hücrenizin kimliğini veya fizyolojik özelliklerini tek hücre düzeyinde kanıtlamak için benzersiz bir araştırma sunar. Bu tekniğin temel avantajları, analiziniz için tek hücre düzeyinde uzamsal çözünürlüğü kolaylaştırması ve arka plan süreci arasında ayrım yapılmasına izin vermesidir. Dolayısıyla bu teknik, patojenik mikropların tanımlanmasına ve fenotipik analizine potansiyel olarak katkıda bulunabilir.Bu teknik aynı zamanda fenotipik heterojenliğin incelenmesine veya ilgilenilen mikrobiyal popülasyonun fizyolojik durumunun izlenmesine de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yardımcı doçent olan Kyosuke Takabe olacak. Konfokal yansıma mikroskobu ve çok kanallı konfokal mikrospektroskopi kurulumu.Taranmamış spektral kanallara sahip konfokal mikroskobu bir fotoçoğaltıcı tüpe bağlayın. Mikroskobu, yeterli bir büyütme ile yüksek sayısal açıklık objektifi ile donatın. Ve hücre morfolojisini görselleştirmek için gelen ışığın hücresel saçılımına dayanan konfokal yansıma mikroskobunu barındırmak için mikroskobu bir yarı yansıma aynası ile donatın.Çok kanallı konfokal mikrospektroskopi için, mikroskobu dikroik aynalarla donatın ve her uyarma dalga boyu için aydınlatma yoğunluğunu ayarlamak için bir lazer güç ölçer kullanın. Ardından mikroskop altındaki çıktıyı, uyarma dalga boyları boyunca sabit olacak şekilde ayarlayın. Bakterileri mikroskopta görüntülemek için, mikroskop yazılımında iğne deliği boyutunu 1.0 alan birimine ayarlayın ve her uyarma dalga boyu için piksel bekleme süresini ayarlayın.Tarama çözünürlüğünü ayarlayın. Bakteriler gibi küçük hücreler için 1024'e 1024'lük bir tarama alanı kullanın. Z-Tarama aralığını, ilgilenilen bölge kapsanacak şekilde ayarlayın.Ve sekiz ila 10 nanometrelik bir spektral pencere kullanarak, D-Scan dedektörünü görünür dalga boyu aralığını yakalayacak şekilde ayarlayın. Ardından, floresan görüntülerinin ve konfokal yansıma mikroskobu görüntülerinin Z-Yığınlarını oluşturmak için en uzundan en kısa uyarma dalga boylarına kadar bir sırayla çok kanallı konfokal mikrospektroskopi görüntüleri elde edin ve görüntüleri 16 bit tiff formatında kaydedin. Hücre segmentasyonunu ve tek hücreli doğuştan gelen floresan imzaların yeniden yapılandırılmasını gerçekleştirmek için uygun bir görüntü analizi yazılım programı açın ve sağlanan komut dosyalarından birini açmak için çift tıklayın.Düzenleyici sekmesi altında, çalıştır'a tıklayın. Bir klasör seçim penceresi görünecektir. Z-Stack görüntülerinin kaydedildiği dizini seçin ve aç'ı tıklatın.Segmentasyon parametresinin girilmesini isteyen bir iletişim kutusu otomatik olarak görünecektir. Görüntü ikili oluşturma eşiğini 0-1 olarak, görüntü ikili oluşturmayı 0,45 olarak, bir hücre bölgesi için üst eşiği 200 olarak, bir hücre bölgesi için alt eşiği 10 olarak ve dedektör sayısını 32 olarak ayarlayın. Uyarma dalga boylarının sayısı için giriş isteyen bir iletişim kutusu görünecektir.Görüntü alımı için kullanılan dalga boylarının sayısını girin ve Tamam'a tıklayın. Uyarma dalga boyları için giriş isteyen bir iletişim kutusu görünecektir. Uyarma dalga boylarını en kısadan en uzuna doğru sırayla girin ve Tamam'ı tıklayın.Konfokal yansıma mikroskobu görüntüsü sunan yeni bir görüntü penceresi görünecektir. Arka plan çıkarma işlemi için kullanılacak rastgele bir arka plan bölgesi seçin ve konfokal yansıma mikroskobu görüntüsünün içinde bir dikdörtgen çizin. Seçimi onaylamak ve imza adlı yeni bir dizini bulmak için seçilen bölgeye çift tıklayın.Boyutsal indirgeme tekniklerini gerçekleştirmek için boş bir dizin oluşturun ve dizini parent_directory adlandırın. İki hücre popülasyonunun her birinin floresan imzalarını iki ayrı dizinde saklayın ve iş istasyonunun komut satırı arayüzünü açın. Komutu girin.Hedef dizini seç görüntülendiğinde, parent_directory seçin. Ardından parent_directory klasöründe PCA'yı bulun. Elde edilen temel bileşen analizi grafiğini içerecek olan PNG dosyası.Burada, geleneksel bir spektrum grafiği ve bir ısı haritası olarak sunulan bir bakteri hücresinin tipik bir tek hücreli floresan imzası gösterilmektedir. Bu şekilde, bir toprak bakterisi popülasyonunun orijinal konfokal yansıma mikroskobu görüntüsünün üzerine bindirilmiş yanlış 2D hücre segmentasyonu gözlemlenebilir. Popülasyon için ortaya çıkan doğuştan gelen floresan imzalar bir ısı haritası olarak sunulur.Başarılı hücre segmentasyonunu takiben popülasyon içi değişkenliğin nispeten küçük olduğunu unutmayın. Burada, yanlış hücre segmentasyonunun bir örneği, daha önce gösterildiği gibi aynı P.putida popülasyonuna süper olarak uygulanmış olarak gösterilmiştir. Yanlış hücre segmentasyonunun popülasyonun doğuştan gelen floresan imzaları üzerindeki etkisi, ilgili ısı haritasında gözlemlenen önemli sayıda aykırı değerden kolayca anlaşılabilir.Yanlış hücre segmentasyonu, doğru hücre segmentasyonunu takiben elde edilen tip kümesine kıyasla, temel bileşen analizinden sonra daha gevşek bir küme ile sonuçlanır. Bireysel bakteri suşlarında gözlemlenen doğuştan gelen floresan imzanın küçük değişkenliklerine rağmen, her popülasyon temel bileşen analizi grafiğinde ayrı bir küme oluşturur. Bu şekilde, tomurcuklanan bir maya Saccharomyces cerevisiae YM4271 popülasyonunun orijinal konfokal yansıma mikroskobu görüntüsünün üzerine bindirilmiş yanlış 3D hücre segmentasyonu gözlemlenebilir.Aykırı değerlerin eksikliğine ve popülasyon için ortaya çıkan doğuştan gelen floresan imzalara dikkat edin. Konfokal mikroskopi ile mümkün olduğunca temiz bir görüntü elde etmek ve gürültü sonraki analizin doğruluğunu bozabileceğinden sinyal yoğunluğu doygunluğundan kaçınmak önemlidir. Sınıflandırma veya tahmin görevlerinde kullanılmak üzere doğuştan gelen Western imza veri kümesiyle makine öğrenimi modellerini eğitebilir, etiketsiz bir popülasyon analizi ve fenotipik tahmin sunabilirsiniz.

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Hedef reseptörleri hücre yüzeyinde bağlanan antikorlar uyum ve küme değişikliklerini görüşmek. Bu dinamik değişiklikler ilaç geliştirme hedef hücrelerdeki karakterize konusunda da etkileri vardır. Bu iletişim kuralı confocal mikroskobu ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile hücre yüzeyinde kümeleme reseptör kapsamını ölçmek için ImageJ/FIJI kullanır.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&amp;B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Spektral Yinelemeli Ağartma Çoklamayı Genişletir (IBEX), spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı ekleyerek ve otofloresansı bastırmak için hesaplamalı karıştırma ile spektral algılamadan yararlanarak temel IBEX tekniğini temel alır. Bu yaklaşım, arka plan kaynaklarını azaltırken görüntü elde etmeyi hızlandırır ve sağlam, çok yönlü, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlere olanak tanır.

Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Öğrenin, konfokal mikroskopi ve çok kanallı mikrospektroskopi kullanarak tek hücreli doğuştan floresan imzalarını yeniden yapılandırmayı. Bu yöntem, bakteri, mantar ve maya hücrelerinde fenotipik çeşitliliği etiketsiz analiz etmeyi sağlar.

Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması

Daha fazla video keşfet