Tiobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Tahlil kullanılarak Biyolojik Örneklerde Oksidatif Stresin Değerlendirilmesi
12 Mayıs 2020
Tiyorbitürik asit reaktif madde tahlilinin amacı, 532 nm'de görünür dalga boyu spektrofotometrisi kullanarak, öncelikle malondialdehit olmak üzere lipid peroksidasyon ürünlerinin üretimini ölçerek biyolojik numunelerdeki oksidatif stresi değerlendirmektir. Burada açıklanan yöntem insan serumu, hücre lysates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlere uygulanabilir.
Bu nedenle, TBARS testi, biyolojik numunelerdeki oksidatif stresin laboratuvar içi genel değerlendirmesi için en iyi şekilde kullanılır, burada nispi TBARS seviyeleri, birlikte depolanan ve işlenen numuneler arasında doğrudan karşılaştırılır. Bu tahliller, yaklaşık 400'e mal olan ticari olarak mevcut kitlere kıyasla 96 numuneyi test etmek için yaklaşık 3 gibi son derece düşük bir maliyete sahiptir ve yalnızca tek bir parti numunenin analiz edilmesine izin verir. Burada açıklanan yöntem, biyolojik numuneler, stabilite çalışmaları ve analizden önce antioksidanların veya diğer numune koruyucularının eklenmesinin uygun veya zorunlu olduğu uygulamalar dahil olmak üzere spesifik uygulamalar için daha fazla uyarlanabilir.
Çok değişken sonuçlardan kaçınmak için, renk reaktifleri için pH'ın dörtten büyük olmadığından emin olarak taze reaktifler hazırlayın ve emilimi ölçmeden önce nidese şişme plakasındaki kabarcıkları çıkarın. % 0.8 sulu bir tiyobarbitürik asit çözeltisi hazırlayarak başlayın. Dört gram sodyum hidroksit boncuğunu 20 mililitre suda çözerek beş molar sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın.
Çözeltiyi plastik bir kapta saklayın. Her parti için taze olarak hazırlanmalıdır. 450 mililitre deiyonize suya dört gram tiyobarbitürik asit ekleyin ve nazikçe çözmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın.
100 mikrolitrelik artışlarla yaklaşık dört mililitre sodyum hidroksit çözeltisi yavaşça ekleyin ve tiyobarbitürik asit parçacıkları çözüldükçe pH'ı kontrol edin. Tüm parçacıklar çözülene kadar sodyum hidroksit eklemeye devam edin. Çözeltinin pH'ının bir pH şeridi ile dörtten yüksek olmadığını doğrulayın, ardından son hacmi deiyonize su ile 500 mililitreye getirin ve sulu tiyobarbitürik barbarik asit çözeltisini oda sıcaklığında saklayın.
İki mililitrelik geçmeli kapaklı polipropilen tüplerde MDA bis dimetil asetal standart eğri çözeltileri hazırlayın. 200 mikromolar stok çözeltisini metin el yazmasında anlatıldığı gibi suda seyrelterek. Örnekleri girdaplayın.
Analiz edilecek numuneler için cam tüpleri etiketleyin, ardından hazırlanan numuneden her tüpe 100 mikrolitre ekleyin. Her numuneye 200 mikrolitre %8,1 SDS ekleyin ve karıştırmak için cam tüpü dairesel hareketlerle hafifçe döndürün. Her numuneye 1,5 mililitre 3,5 molar sodyum asetat tamponu ekleyin, ardından 1,5 mililitre sulu %0,8 tiyobarbitürik asit çözeltisi ekleyin.
700 mikrolitre deiyonize su ekleyerek her tüpteki finali dört mililitreye getirin. Cam tüpleri sıkıca kapatın ve bir saat boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Yoğuşmayı önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün, ardından tüpleri bloktan çıkarın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, numuneleri ve standartları dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüjleyin. Her tüpten 150 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve pipet ucuyla hava kabarcıklarını giderin. Numunelerin absorbansını 532 nanometrede ölçün, ardından boş numunelerin ortalama emici okumasını diğer tüm emici okumalarından çıkarın.
Standart bir eğri oluşturun ve bunu bilinmeyen numune konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanın. Üç farklı biyolojik numunede testin tespit ve duyarlılık sınırlarını ve oksidasyon seviyelerini belirlemek için MDA bis dimetil asetol standart eğrileri oluşturulmuştur. Üç numune üzerinde farklı günlerde toplam 9 TBARS testi yapıldı.
Tespit sınırlarını belirlemek için, boş numunelerin absorbansı üç farklı günde ölçüldü. Algılanabilir bir gürültü emici olmayan sinyal vermek için gereken minimum TBARS madde konsantrasyonu 1.1 mikromolardır. Ve tahlilin hassasiyeti, konsantrasyondaki mikromolar artış başına yaklaşık 0.0016 emici birimdir.
TBARS testi, çeşitli biyolojik matrislerin lipid peroksidasyonundaki değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir. Bunu göstermek için, insan serumu HEPG2 hücre lizatlarının ve düşük yoğunluklu lipoproteinlerin invitro oksidasyonunu indüklemek için iki bakır klorür kullanıldı. EDTA içeren LDL numuneleri üzerinde bir TBARS testi yapıldı ve bakır iki muamele edilmiş ve muamele edilmemiş LDL numunesi arasında TBARS seviyeleri değişmedi.
Bununla birlikte, EDTA spin filtrasyonu ile uzaklaştırıldıktan sonra, LDL'ye bakır iki aracılı oksidasyon uygulandı. İnsan serumundaki TBARS testinin dinamik aralığını göstermek için, numunelere iki milimolar bakır iki iyon konsantrasyonu eklendi ve bu da TBARS'ta altı ila yedi kat artışa neden oldu. Bu protokolü denerken, numuneleri 10 dakikadan daha uzun süre buz üzerinde bırakmayın ve santrifüjlemeden sonra oda sıcaklığında bırakın.
Başlangıçta toplanmayan, işlenmemiş ve birlikte saklanmayan biyoörneklerin partileri veya alt kümeleri için, artefakt oksidasyonun sonuçlara katkıda bulunmadığından emin olmak için parti etkileri için veriler istatistiksel olarak değerlendirilmelidir. Düşük yoğunluklu lipoproteinden kasıtlı olarak ölçülebilir invitro oksidasyon, oksidasyonun işleyiş biyolojisini nasıl etkilediğini anlamayı mümkün kılar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Tiyobarbitürik asit reaktif maddeleri (TBARS) analizi, biyolojik numunelerde oksidatif stresi değerlendirmek için lipid peroksidasyon ürünlerini ölçerek maliyet-etkili bir yöntemdir. Bu yöntem, birlikte işlenen numunelerdeki göreceli TBARS seviyelerini karşılaştırmak için özellikle yararlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Oksidatif Stres Değerlendirmesi
- Analitik Kimya
Arka Plan
- TBARS analizi, oksidatif stresin bir göstergesi olarak malondialdehiti ölçer.
- İnsan serumu ve hücre lizatları dahil olmak üzere çeşitli biyolojik numunelere uygulanabilir.
- Bu analiz, ticari kitlere göre düşük maliyetlidir.
- Doğru sonuçlar için taze reaktifler ve spesifik pH koşulları kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Oksidatif stresi değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Benzer koşullar altında işlenen numuneler arasında TBARS seviyelerinin karşılaştırılmasını sağlamak.
- Yöntemi spesifik uygulamalara, stabilite çalışmaları da dahil olmak üzere, adapte etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tiyobarbitürik asidin %0,8'lik sulu çözeltisinin hazırlanması.
- Beş molar sodyum hidroksit çözeltisinin hazırlanması.
- Görünür dalga boyu spektrofotometri kullanarak 532 nm'de absorbans ölçümü.
- Reaktifler taze tutulur ve pH dörtten düşük tutulur.
Ana Sonuçlar
- TBARS analizi, oksidatif stres seviyelerinin doğrudan karşılaştırmasını sağlar.
- Maliyet-etkili testleme, birden fazla numunenin analizini sağlar.
- Çeşitli biyolojik uygulamalara uyarlanabilir.
- Taze reaktifler, sonuçlardaki değişkenliği en aza indirir.
Sonuçlar
- TBARS analizi, oksidatif stresi değerlendirmek için değerli bir araçtır.
- Ticari alternatiflere göre önemli maliyet tasarrufu sağlar.
- Güvenilir sonuçlar için uygun hazırlık ve kullanım şarttır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The TBARS assay provides a cost-effective, intra-laboratory method for relative oxidative stress assessment in biological samples, supporting early discovery workflows where comparative lipid peroxidation data informs target validation and mechanistic de-risking. Its low cost and adaptability enable reproducible screening of compound effects across sample sets, reducing false positives in lead identification. Proper reagent handling and pH control ensure data reliability for go/no-go decisions in preclinical prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lipid peroxidation changes in response to compound treatment.
- Operational Value: Supports pathway clarification through comparative TBARS levels in disease-relevant systems like human serum and cell lysates.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by identifying compounds that modulate oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by establishing baseline oxidative stress metrics.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fresh reagent preparation and pH ≤4 control.
- Scalability Value: Enables high-throughput screening readiness with 96-sample processing at ~$3 per batch.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detectable TBARS changes in LDL oxidation models upon EDTA removal.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying invitro oxidation effects on lipoprotein function.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions via dose-responsive TBARS increases (e.g., 6-7 fold with 2 mM Cu²⁺ in serum).
Pipeline & Workflow Integration
The TBARS assay fits within the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, providing oxidative stress readouts that help prioritize compounds before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring lipid peroxidation as a functional readout of pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, low-cost processing of biospecimens stored and processed together.
- Analytics: Generates quantitative absorbance measurements at 532 nm, enabling LOD of 1.1 µM and sensitivity of 0.0016 AU/µM for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling LDL oxidation to understand functional biological impacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for batch-wise oxidative stress assessment across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct comparison of oxidative stress levels.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fresh reagent preparation and controlled incubation (95°C, 1 hr).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in lipid peroxidation pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via detection of concentration-dependent TBARS changes in biological matrices.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reagent preparation, pH control, and spectrophotometric measurement.
- Needs heating block (95°C), centrifuge, and visible wavelength spectrophotometer.
- Demands cross-team standardization of sample storage and processing to avoid batch effects.
- Requires adaptation considerations for biospecimens with antioxidants or preservatives.
- Limited to relative comparisons; absolute quantification requires MDA-bis-acetal standard curves.
