Name: Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Keşfedin endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin sıçan kalbinin ventriküler serbest duvarından izolasyon yöntemini. Bu protokol yüksek saflıkta hücre sağlar ve kalp hastalıklarındaki hücre tipine özgü mekanizmaları araştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Dr. Lingli Wang'ı hayvan protokolüne yardımlarından ve Stanford'daki Pediatri Bölümü'ne altyapı desteği için çok teşekkür ediyor. Bu çalışma NIH/NHLBI K99 HL135258 (M.G.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Paneli (APLAC31608) tarafından onaylanmıştır.
1. Tamponların hazırlanması
<ol><li>Tablo 1'delistelenen reaktifleri kullanarak sindirim tamponu hazırlayın.<ol>
<li>DNase I stok çözeltisini hazırlayın: 2.000 birim/mL (1 mg/mL) stok çözeltisi için RNase içermeyen suda DNase I'i çözün. Aliquot ve stok çözeltisini -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Liberaz çözeltisini hazırlayın: 5 mg/mL'lik bir stok çözeltisi için rnase içermeyen su ile liberaz çözün. 30 dk. Aliquot için 4 °C'de bir rulo üzerinde döndürün ve stok çözeltisini -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,5 M ethylenediaminetetraastic asit (EDTA) ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile %10 büyükbaş serum albumin (BSA) stok çözeltisini 2 mM EDTA ve %0,5 BSA'lık son konsantrasyoniçin seyrelterek sıralama tamponunu hazırlayın.</li>
</ol>2. Kalp koleksiyonu
NOT: Bu protokolde 50-100 g ağırlığında altı Adet Sprague Dawley sıçanı kullanıldı. Cinsiyet farkı gözlenmedi.
<ol><li>Co2 ile sıçan ötenazi ve bir diseksiyon platformu üzerinde bir supine pozisyonda yerleştirin. Ekstremiteleri aşağı pin ve% 70 etanol ile hem karın ve göğüs sterilize.</li>
	<li>Karnı makasla açın ve bağırsakların arkasında bulunan arka vena kava kısmına 21 G iğne yerleştirin. Şırınga pistonunu geri çekin, karaciğer daha açık görünene kadar vendeki kanı geri çekin ve yeterli kan alınmasını gösteren daha fazla kan çekilememiştir.</li>
	<li>Makas kullanarak, akciğer ve kalbe zarar vermemek için göğsü dikkatlice açın. Forseps ile aort kemer / atriyum kaldırın ve aort, pulmoner arter, pulmoner venler ve vena kava kurtarmak ve kalp kaldırmak için kesti.</li>
	<li>Aşırı kanı gidermek için kalbi 50 mL soğuk 1x Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) tampon3x ile yıkayın.</li>
	<li>Mikrodises mikroskobu altında, sağ ventrikülsüz duvarı, Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) içeren 5 mL'lik bir tüpe çıkarın (Şekil 1A,B).<ol>
<li>Onun düz, arka yüz sol ve sağ tarafı tanımlamak için kalp lay.</li>
		<li>Pulmoner arter bulun, venlerin ve arterlerin en ön kalbin üst dallanma ve sağ ventrikül odasına aşağı pulmoner arter ile kesti. Kalbin ön yüzünde, tepe ulaşana kadar septum boyunca kesilmiş. Pulmoner arter ve sağ ventrikül oda kavşak noktasına kadar septum boyunca kalbin arka tarafında apeks kesmeye devamedin (Şekil 1A).</li>
		<li>Pulmoner arter ve sağ ventrikül kavşak noktasından başlayarak, sağ ventrikül serbest duvarı kalbin geri kalanından kurtarılıncaya kadar, kalbin hem ön hem de arka tarafını bir önceki diseksiyona dik olarak ve septumdan uzaklaştırın (Şekil 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrodisesmikroskop altında, sol ventrikül serbest duvarını DMEM içeren 5 mL'lik bir tüpe çıkarın (Şekil 1C,D).<ol>
<li>Pulmoner arter arkasında kalbin üst dallanma, aort bulun ve sol ventrikül serbest duvar kesmek için adım 2.5 açıklanan yöntemi tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AET sindirim
<ol><li>Hem sağ hem de sol ventrikülsüz duvar dokularını iç yüzeyi düz, aşağı bakacak şekilde 60 cm'lik bir kültür kabına yerleştirin(Şekil 2). NOT: İç yüzey, Şekil 2A,C' de gösterildiği gibi hafif içbükey şekilli ventriküliç yüzüdür.</li>
	<li>Tabağa 0,5-1 mL sindirim tamponu ekleyin ve pipetin ucunu doğrudan dokunun altına yerleştirin. Sadece iç yüzey batırılana kadar devam edin.</li>
	<li>Yemeği %5 CO2, 37 °C inkübatörde 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Sindirimi durdurmak için kültür yemeğine EC ortamı ekleyin. NOT: SINDIRIM tamponu miktarını 1:5 oranı olarak EC ortamına saklayın.</li>
	<li>Ventriküllerin iç yüzeyini EC ortamıile yıkamak için 1 mL'lik pipet kullanın ve akıntıyı 40 mm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir toplama tüpüne aktarın(Şekil 2E). Aşağı saflaştırma için buz üzerinde koleksiyonları tutun.</li>
</ol>4. CEC sindirim
<ol><li>İç tabakadan(Şekil 2B,D)kirlenmeden sol ventrikülün dış yüzeyini kesin ve her birini sindirim tamponunun 1 mL'lik içeren ayrı bir 5 mL tüpüne yerleştirin. NOT: Sol ventrikül kalın ventrikül olarak tanımlanabilir ve dış yüzey biraz içbükey ventrikül dış yüzü olarak belirlenebilir.</li>
	<li>Diseksiyon makası kullanarak ventriküler duvarı küçük, 1 mm3 adet ebathalinde doğuz.</li>
	<li>Tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda yaklaşık 15-20 dk. Girdap her 2-3 dakikada bir kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Pipet 4 mL EC orta 5 mL tüp içine sindirim sona erdirmek için.</li>
	<li>Çözeltiyi 5 mL serolojik pipetle 40 mm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir tüpe aktarın(Şekil 2E). Aşağı saflaştırma için buz üzerinde koleksiyonları tutun.</li>
</ol>5. Hücre toplama
<ol><li>Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika (RT) için 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>Pelet kırmızı görünüyorsa, 1x kırmızı kan hücresinin (RBC) 1-2 mL'lik lysing tamponu(Şekil 2F)peletini yeniden askıya alın. NOT: RBC yoksa, adım 6'ya geçin.</li>
	<li>Tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Pipet 10 mL PBS 50 mL tüpler içine lysis durdurmak için.</li>
	<li>Tüpleri RT'de 10 dk için 300 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
</ol>6. AT sıralama
<ol><li>50 mL tüplere 90 μL sıralama tamponu ve 10 μL anti-CD31 PE antikor ekleyin.</li>
	<li>Tüpleri girdap ve sonra 4 ° C buzdolabında 10 dakika kuluçka.</li>
	<li>Tüpleriçine tampon sıralama 10 mL ekleyin, iyice karıştırın ve sonra RT 10 dakika için 300 x g santrifüj.</li>
	<li>Supernatant aspire ve sıralama tampon 80 μL ve anti-PE mikroboncuklar 20 μL pelet resuspend.</li>
	<li>Girdap tüpler ve 15 dakika boyunca 4 °C'de kuluçka.</li>
	<li>Tüplere 10 mL'lik tampon ekleyerek hücreleri yıkayın, iyice karıştırın ve rt'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant aspire ve sıralama tampon 500 μL pelet resuspend.</li>
	<li>Süperparamanyetik küreleri içeren bir sütunu manyetik ayırıcıya yerleştirin ve 3 mL sıralama arabelleğiyle sütunu durulayın.</li>
	<li>Sütun "akış durdurma" sonra, pipet 500 μL hücre süspansiyon sütunlar içine ve sonra sıralama tampon ile sütunları yıkayın. Yıkama 3x, her 3 mL sıralama tampon(Şekil 2G)ile tekrarlayın.</li>
	<li>Kolonları ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir 15 mL toplama tüpünün üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Pipetle, sütunlara 5 mL EC orta ekleyin ve bir sütun pistonkullanarak çözümü itin.</li>
	<li>Toplama tüplerini RT'de 10 dk için 300 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uygun olarak, Bir kit kullanarak EEC ve CEC örneklerinin hücre peletinden RNA'yı ayıklayın. En az 500 ng RNA elde edilebilir. NOT: RNA ekstraksiyonundan sonra numune -80 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak rastgele bir astar ve kit kullanarak cDNA almak için 500 ng RNA'yı ters yazır.</li>
	<li>Endokardiyal ve endotel popülasyonlarının doğrulanması için nicel PCR gerçekleştirin (Şekil 2H). Astar dizileri Tablo 2'delistelenmiştir.<ol>
<li>384 qPCR plakanın kuyularına 5 μL EEC veya CEC cDNA (1 ng/μL) ekleyin. Astar sayısı başına üç kuyu olması için Yeterli kuyulara EEC veya CEC cDNA'sını ekleyin.</li>
		<li>6 μL 2x qPCR SYBR yeşil arabelleği, her 10 μM astarın 0,5 μL'si ile karıştırın ve bunları her aday genine karşılık gelen tek bir kuyuya ekleyin.</li>
		<li>Plakayı rt'de 300 x g'da 1 dk plastik film ve santrifüj ile kapatın.</li>
		<li>Plakayı bir qPCR makinesine yerleştirin ve ardından programı 95 °C'de 3 dk, ardından 15 s için 95 °C'de ve ardından 55 °C'de 60 s. Sonraki iki adımı 45 devir için tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+and+Atlantic+cod+%28Gadus+morhua%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development%2C+Diseases+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li>
<li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li>
<li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li>
<li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome%3A+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

MED'ler ve EEC'ler kökenleri, belirteçleri ve işlevleri farklıdır ve bu nedenle gelişim ve hastalıkta benzersiz roller oynayabilir. Endotel hücre izolasyonu için mevcut protokoller makrovasküler dokularla sınırlıdır, EEC'lerin toplanması ihmal, böylece CeC çalışma kısıtlayan- ve EEC özgü fonksiyonların. Bu bilgi, gelecekteki çalışmalar için iPSC'lerin MSK ve AEC'lere farklılaşması için bir referans sağlayacak ve çeşitli kalp hastalıkları için potansiyel terapötik hedefler için bu hücre popülasyonlarının incelenmesini kolaylaştıracağı için, bu iki popülasyonu bağımsız olarak izole etmek ve incelemek esastır. Bu yeni protokol, yetişkin sıçanların ventriküler serbest duvarının dış yüzeyinden EMC'lerin iç yüzeyden ve MED'lerin izolasyonu için bir yöntem özetlendir.
Bu protokoldeki her adımın zamanlamasını tam olarak denetlemek çok önemlidir. EEC sayısı sıçan kalp dokusunda çok sınırlı olduğundan, biz hücresel hasarı önlemek için kalbin iç tabakasının sindirim süresini en aza indirdi ve daha da önemlisi, CEC kontaminasyon. Enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için EC orta çözeltisinin hemen eklenmesi de yüksek hücre canlılığını korumak için çok önemlidir. Hücre koleksiyonunu takip eden kırmızı pelet, RBC kontaminasyonmiktarına bağlı olarak çok sayıda RBC'nin varlığını göstermektedir, RBC'lerin bozulması için 1-2 mL RBC lysis tamponu eklenebilir. Mevcut protokolü kullanarak,105 AÇ'ı altı fare kalplerinden izole edebildik. Bu hücreler daha fazla genişleme ve karakterizasyon için bir hücre kültür çanak üzerine tohumlu olabilir.
Serbest duvar toplama için doku hazırlanırken, kalp hbss ile kalan RBC'lerin çoğunluğu kaldırmak için yıkandı. Sindirim tamponunun bileşimi endotel hücrelerinin yeterli şekilde serbest kalmasını sağlar, liberase sindirim enzimi maruz hücrelerin doku şeritler nerede, DNase I DNA'nın yapışkan kalitesi ile inhibe edilebilir hücre detachment teşvik etmek için ölü hücrelerden DNA ortadan kaldırır, HEPES tampon pH dengeler, ve DMEM daha iyi hücre bakımı için amino asitler ve vitaminler daha yüksek konsantrasyon ile değiştirilmiş bir bazal orta ve liberase etkinleştirmek için gerekli kalsiyum içerir.
İnsan15 ve fare kalp10elde edilen tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) göre, belirli AT popülasyonlarına atfedilen çeşitli belirteçler bildirilmiştir. İzole edilmiş EEC'lerin (yani, Npr3, Cdh11ve Hapln1)ve AÇC'lerin (yani Mgll, Fabp4ve Cd36)saflığını incelemek için en zengin genlerden bazılarını seçtik. Β β-Actin, Npr3, Cdh11ve Hapln1 belirteçlerine göre EMC'lerde MDC'lere göre ekspresyon artışı gösterilmiştir. Benzer şekilde, Mgll, Fabp4ve Cd36 belirteçlerinin ekspresyonu, EEC'lere göre CEC'lerde daha fazlaydı. Her örnek için benzersiz olarak ifade edilmiş işaretler, sırasıyla AÇ'lar ve CeC'ler için karakteristik işaretlerle uyumludur ve başarılı yalıtımı gösterir.
Ancak mevcut protokol, izolasyon sırasında iki AK popülasyonu arasındaki çapraz kontaminasyonu, dikkatle kontrol edilen sıralı sindirimlerle bile ekarte edemez. Bu nedenle, bazı hücre yüzey işaretleri daha fazla arıtma için uygulanabilir. Örneğin, NPR3 genellikle endokardiyum10'uetiketlerken, APJ CEC'lerin16'sınınçoğunluğunu izleyebilir. Bu iki belirteç hücre yüzeyinde ifade edildiğinden, floresan aktif hücre sıralama (FACS) ve farklı EC popülasyonlarını daha da arındırmak için kullanılan antikorlar için kullanılabilirler. Buna ek olarak, insan15 ve fare10 kalp scRNA-seq AÇC'larda Npr3 zenginleştirme teyit edebilir, ve Cd36 potansiyel OLARAK CEC arıtma için kullanılabilir.
Sonuç olarak, sunulan protokol, AÇC'lerin ve MSK'ların fare kalbinden bağımsız olarak izole edilmesinin ana hatlarını ortaya koyuyor. Hücre yalıtımı ile etkinleştirilen hücresel özelliklerin kapsamlı tanımlanması, önemli downstream uygulamaları için kullanılabilir.

Bu makalede, sıçan kalplerinden endokardiyal endotelyal hücrelerin (EECs) ve koroner endotel hücrelerinin (MK) diseksiyonu ve sonraki izolasyonu için ayrıntılı bir protokol (Gladka ve ark.1'denmodifiye) verilmektedir. Bu hücre popülasyonlarını bağımsız olarak araştırma yeteneği, potansiyel tedavi hedefleri olarak hizmet verebilecek çeşitli kalp hastalıklarının altında yatan hücre tipine özgü mekanizmaların araştırılmasını sağlayacaktır. Ancak, bu hücre popülasyonlarının bağımsız olarak toplanması için başarılı bir yöntem henüz yayınlanmamıştır.
Cecs kökeni açısından AÇCs farklıdır, belirteçleri, ve kalp gelişimi ve hastalık sırasında fonksiyonları1,2,3,4,5,6,7., EEC'ler kardiyak mezoderm3ventral yüzeyinden kaynaklanmaktadır. Onlar VEGF ve HIF sinyalyanıt olarak Flk1+ progenitor hücrelerinden ortaya çıkar ve gelişmekte olan kalbin üç ayrık bölgelerin en iç tabakasını oluşturur: atriyum, ventrikül, ve sinüs venöz3,6. Genetik soy takibi sinüs venöz pluripotent endokardiyal hücrelerin subepikardiyal tabaka oluşturmak için göç venöz hücreleri türetmek düşündürmektedir3. Daha sonra, subepikardiyal tabaka koroner arterler ve damarlar içine farklılaşır, CECs de dahil olmak üzere, hangi periferik ventriküler serbest duvar boyunca kalır3,4. Endotel yolu bu endokardiyal VEGFC, ELA / APJ ve SOX17 sinyal3,4,,6,8,9tarafından düzenlenir. Ventriküler endokardiyum bilinmeyen birmekanizma3 tarafından interventriküler septum daha az MDCs türetilmiştir . Daha sonra, EECs ve CECs arasında lokalize farklılaşma mglldahil olmak üzere bu iki hücre popülasyonları, özel belirteçleri tarafından önerilmektedir, Fabp4, ve CD36 ifade MDCs, veya Npr3, Cdh11, ve AçCs Hapln1 ifade3,5,10.
EEC'ler ve MCD'ler kardiyak fonksiyonda farklı roller oynarlar. Mezenkimal geçiş için endokardiyal, kapak oluşumu, oda olgunlaşması, çıkış yolu regülasyonu ve atriyoventriküler kanal gelişimi EECs6'yabağlıdır. Alternatif olarak, CECs vazomotor sesi ve koroner arterlerin iltihabı katkıda11. Fonksiyondaki bu varyanslar hastalık gelişiminde bireyselleştirilmiş rollere nedenolur 4,12. Örneğin, kanıtlar, arızalı EEC'lerin konjenital kapak hastalığına yol açabileceğini düşündürmektedir6,nonkompansyon olmayan miyokardiyum6, atriyoventriküler septal etki6, endokardiyal fibroelastoz13, hipoplastik sol kalp sendromu13, ventriküler hipoplazi13, ve kardiyak hipertrofi12. Benzer şekilde, çalışmalar anormal MK koroner arter hastalığı katkıda bulduk14 ve tromboz11.
Hem araştırma hem de klinik ortamlarda kullanılabilen bu iki hücre popülasyonu hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmak için EDC ve MED'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi gerekmektedir. Bu hücre popülasyonlarının büyüme ve farklılaşma faktörlerinin belirlenmesi, endotel alt tiplerinin indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) farklılaşmasıiçin bir referans sağlayacaktır. Ayrıca, AÇK'ların ve CeC'lerin gelişimi, düzenlenmesi ve işlevindeki varyansların tam olarak tanımlanması, hücre tipine özgü bir şekilde çok sayıda kalp hastalığından sorumlu genomik ve epigenomik faktörlerin anlaşılması için hayati önem taşımaktadır. Bu makalede, ECO'ların ve MSK'ların bağımsız olarak başarılı bir şekilde toplanması için adımlar özetlenmiştir ve hücre tipine özgü belirteçlerin gen ifade düzeylerini değerlendirerek ayrışma kanıtı sağlar.

<table><tbody><tr><td>4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1M</td></tr><tr><td>15ml Tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>0030122151</td><td></td></tr><tr><td>50ml Tüpler</td><td>Nunc</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>5ml Tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Tamponu</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-115-505</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>%10</td></tr> <tr><td>CFX384 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-rad</td><td>1855485</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LK için 003172</td><td>suda 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10313021</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EC Orta</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik Asit (EDTA)</td><td>İnvitrojen</td><td>15575020</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) X1</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Sert Kabuklu 384 Kuyulu PCR Plakaları, ince duvarlı, etekli, şeffaf/beyaz</td><td>Bio-rad</td><td>HSP3805</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Uygulanan Biyosistemler</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Liberaz TM</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5401119001 5 mg / mL</td></tr><tr><td>MACS LS Kolonu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>EC izolasyonu için</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>EC izolasyonu için</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapışkan, optik</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>MSB1001 qPCR</td></tr><tr><td>Dar Model Forseps</td><td>için FST</td><td>11002-12</td><td>Kalp hasadı için</td></tr><tr><td>Naylon Steril Süzgeç</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 mm</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS) X1</td><td>Gibco</td><td>1001023</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Quick-RNA Microprep Kiti</td> için A25780 <td>RNA ekstraksiyonu için</td><td>Zymo Research</td><td>R1050</td></tr><tr><td>S & T Forseps - SuperGrip Uçları</td><td>F.S.T</td><td>00632-11</td><td>Kalp hasadı için</td></tr><tr><td>Şaşılık Makası - Tungsten Karbür</td><td>F.S.T</td><td>14574-11</td><td>Kalp hasadı için</td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas - Mikro tırtıklı</td><td>F.S.T</td><td>15007-08</td><td>Kalp hasadı için</td></tr></tbody></table>

endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin sıçan kalbinin ventriküler serbest duvarından İzolasyon

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Endokardiyal endotel hücrelerinin (EECs) ve koroner endotel hücrelerinin (MK) kökeni, gelişimi, belirteçleri ve fonksiyonları arasında farklılık gösterdiği gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu iki hücre popülasyonları kalp hastalıklarında benzersiz rol oynamaktadır. İzole endotel hücrelerini içeren güncel çalışmalar, hem EEC'lerden hem de MED'lerden oluşan hücre popülasyonlarını araştırmaktedir. Bu protokol, hücreye özgü karakterizasyonu için bu iki hücre popülasyonunu bağımsız olarak yalıtmak için bir yöntem özetler. Sol ve sağ ventrikül süzme duvarın toplanmasının ardından, dış yüzeyve iç yüzeyden gelen endotel hücreleri sindirim tampon çözeltisi kullanılarak ayrı ayrı serbest bırakılır. Dış yüzeyin ardışık sindirimi ve iç endokardiyal tabaka iki endotel hücre popülasyonunun ayrılmasını korumuştur. AÇK'ların ve MDC'lerin ayrı ayrı yalıtımı, her popülasyona özgü işaretçilerin tanımlanması yla daha da doğrulanır. Fare kalbinde daha önce yayınlanan tek hücreli RNA profilleme dayanarak, Npr3, Hapln1, ve Cdh11 gen ekspresyonu EECs benzersizdir; Fabp4iken , Mgll, ve Cd36 gen ekspresyonu CECs benzersizdir. qPCR verileri, bu karakteristik belirteçlerin kendi örneklerinde zenginleştirilmiş ifadesini ortaya çıkardı, başarılı EEC ve CEC izolasyonunun yanı sıra hücre fenotipinin bakımını göstererek hücreye özgü fonksiyonel analizin daha da artmasını sağladı.

AET ve CEC yalıtımı süreci Şekil 2'deaçıklanmıştır. AçS ve MED'lerin başarılı izolasyonu pan-endotel hücre belirteçlerinin yanı sıra iki alt tip popülasyona farklı olanların varlığı değerlendirilerek belirlendi. Tahmin edildiği gibi, qPCR β-actingöreli , EMC endokardiyal belirteçleri Npr3daha yüksek düzeyde ifade , Hapln1, ve Cdh11 CECs göre(Şekil 3A). Aynı şekilde, CEO'lar eecs(Şekil 3B)ile karşılaştırıldığında koroner belirteçleri Fabp4, Mgllve Cd36 yüksek düzeyde ifade . Ayrıca, hem EMC'ler hem de CECs pan-EC marker gen Cdh5ifade , CEC biraz daha yüksek düzeyde(Şekil 3C).
 <img alt="Kalp anatomisi diyagramı; etiketli aort, ventriküller, arterler; kan akış yolu çalışması." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 1: Kalp diseksiyonu diyagramı. (A) Sağ ventrikülsüz duvarı septumdan ayırmak için yapılan ilk kesim. (B) Sağ ventrikülü tamamen serbest leştirmek için yapılan ikinci kesik. (C) İlk kesim septum sol ventrikül serbest duvar ayırmak için yapılır. (D) Sol ventrikülü tamamen serbest leştirmek için yapılan ikinci kesik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
 <img alt="Sindirim, RBC lizisi, MACS sıralama ve qPCR analizi ile kardiyak hücre izolasyon diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 2: CeC'lerin ve EEC'lerin sindirim düzeninin diyagramı ve hücre sıralamaiçin aşağıdaki düzenleme. (A) En innermost serbest ventriküler duvar ve (B) en dışta ventriküler serbest duvar (C) sindirim tamponu batırılmış veya (D) sırasıyla sindirim tamponu sindirilir. (E) Hücre çözeltilerinin toplanması ve filtrasyonu ile(F) kırmızı kan hücresi (RBC) lysis ve (G) manyetik aktive hücre sıralama (MACS) CD31 antikor kullanarak. (h) Saflaştırılmış eK'ler qPCR kullanılarak gen ekspresyonu doğrulaması için işlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
 <img alt="Npr3, Cdh11, Hapln1, Mgll, Fabp4, Cd36 için EEC ve CEC'yi gösteren gen ekspresyonu karşılaştırma tablosu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: MDC ve EEC'lerin izolasyonunun doğrulanması na qPCR verileri. (A) AET belirteçlerinin Gen ekspresyonu düzeyleri Npr3, Cdh11, ve Hapln1 AÇC'lerde ve MK'lerde gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü. (B) EEC'lerde ve CEC'lerde MGLL, Fabp4ve Cd36'nın gen ekspresyonu düzeyleri gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü. (C) Pan-EC işaretçisi Cdh5, AÇM'larda ve CEC'lerde gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü. (her grupta n = 3). Çubuklar ortalama ± SEM. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 vs EEC, eşleşmemiş t-testi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tablo 1. Sindirim Tampon (1.5ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Hisse Senedi Con.</td>
			<td>Son Con.</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liberase TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0.5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Sindirim tamponu tarifi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tablo 2. Astar Dizileri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gen Adı</td>
			<td>Ileri</td>
			<td>Ters</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCGCAGCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGACTGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGGCCCTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTCAGCTTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGCCTTGGGTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36</td>
			<td>GCAAAACGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACAGACCCCGAC</td>
			<td>TGTGGAACGTACTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-aktin</td>
			<td>TCTGTGTGTGGATTGGTGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Astar Dizileri

Biz bir sindirim tampon ardışık doku sindirim yoluyla sıçan kalplerinden endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin izolasyon için bir protokol sunmak, tekrarlayan santrifüj döngüleri hücre toplama, ve anti-sıçan CD31 mikroboncuklar kullanarak hücre arıtma.

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Burada, endokardiyal hücre ve koroner endotel hücrelerinin kalpten ayrı olarak izole edilebilmek için ayrıntılı bir protokol sunarak insanların hücre tipine özgü gen ekspresyonu ve işlevini anlamalarına yardımcı oluyoruz. Bu yöntemin başlıca avantajları, izole edilmiş AET ve CeC'lerin yüksek saflık ve canlılığı dır ve hücrelerin izole edilip fizyolojik özelliklerini korumalarıdır. MSK'lar ve EEC'ler birçok açıdan farklılık gösterirler, bu nedenle bu hücre popülasyonlarını bağımsız olarak araştırma yeteneği çeşitli kalp hastalıklarında hücre tipine özgü mekanizmaların araştırılmasını sağlar.Bu yöntem, hücre tipine özgü bir şekilde çok sayıda kalp hastalığından sorumlu transkriptomik ve epigenetik faktörlerin incelenmesini kolaylaştırabilir. Bu yöntemin en zor kısımları farklı kalp kısımları belirlenmesi ve doğru hücre tipi kontaminasyonu önlemek için sindirim zamanlama vardır. Prosedürü gösteren Yifei Miao, benim laboratuarımdan bir araştırma bilim adamı olacak.Altı 50 ila 100 gram Sprague Dawley sıçan kalpleri hasat sonra, herhangi bir fazla kan kaldırmak ve bir kalp diseksiyon mikroskop altında yerleştirmek için soğuk HBSS beş0 mililitre ile üç kez organları yıkayın. Dokuyun sol ve sağ taraflarını belirlemek ve pulmoner arteri bulmak için kalbi düz posterior yüzüne yerleştirin. Sağ ventrikül odasına pulmoner arter ile kesmek için makas kullanın ve apeks ulaşıncaya kadar septum boyunca kesti.Pulmoner arter ve sağ ventrikül odası nın kavşak ulaşınına kadar septum boyunca kalbin arka tarafında apeks kadar kesme ye devam edin. Bu noktadan başlayarak, kalbin ön ve arka taraflarını bir önceki diseksiyon noktasına dik olarak ve sağ ventrikül serbest duvarı kalbin geri kalanından kurtarılana kadar septumdan uzaklaştırın. Daha sonra sağ ventrikülserbest duvarDMEM beş mililitrelik tüp içine yerleştirin ve sadece gösterildiği gibi aynı şekilde sol ventrikül serbest duvar toplama kolaylaştırmak için tekrar aort bulmak.Tüm ventriküler serbest duvarlar toplandığında, doku örneklerini iç yüzeyleri çanakta yüzüstü yatan 60 santimetrelik bir kültür yemeğine aktarın. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, dokuların sadece iç yüzeyleri batırılır kadar doğrudan doku parçaları altında çanak sindirim tampon 0,5 ila bir mililitre ekleyin. İstenmeyen hücre kontaminasyonunu önlemek için, ventrikülün sadece iç yüzeyinin sindirim tamponuna daldırılması ve tam olarak beş dakika boyunca sindirilmiş olması önemlidir.Hücre kültürü kuluçka beş dakika sonra, endotel hücre orta hacmi beş kat hacmi ile sindirim durdurmak. Daha sonra her ventriküliç yüzeyini temiz bir ortamla yıkamak için bir mililitrelik pipet kullanın ve akıntıyı 40 mikrometrelik bir süzgeçten buz üzerinde 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarın. Koroner endotel hücre sindirimi için, iç tabakadan kontaminasyon olmadan sol ventrikül dış yüzeyi boyunca kesilmiş ve sindirim tampon bir mililitre içeren ayrı bir beş mililitretüp her tüp yerleştirin.EBM'lerden kaynaklanan kirlenmeyi önlemek için, sadece ventrikülün dış yüzeyinden kesilmek önemlidir. Diseksiyon makası kullanarak, küçük bir milimetrelik parçalar halinde ventriküler duvar kıyma ve her iki ila üç dakikada bir girdap ile 15-20 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu tüpler yerleştirin. Kıyılmış parçalar küçük ama görünür olduğunda, tüpe dört mililitre endotel hücreli ortam ekleyin ve çözeltinin tüm hacmini 40 mikrometrelik bir süzgeçten buz üzerinde 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarmak için beş mililitrelik serolojik pipet kullanın.CD31 pozitif hücre popülasyonlarını sindirimden sonra izole etmek için, hücreleri santrifüj ile peletleyin ve süpernatantları aspire edin. Herhangi bir pelet kırmızı ise, 37 derece santigrat su banyosunda beş dakikalık bir kuluçka için tüp başına kırmızı kan hücresi lisis tampon bir ila iki mililitre hücreleri yeniden askıya. Kuluçka sonunda, 10 mililitre PBS ile lysis durdurmak ve ikinci bir santrifüj ile hücreleri toplamak.Daha sonra, hücrelerin her tüpüne 90 mikrolitre sıralama tamponu ve 10 mikrolitre anti-CD31 PE antikor ekleyin. Girdap tan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, iyice karıştırma ile tüplere sıralama tampon 10 mililitre ekleyin ve santrifüj ile hücreleri toplamak.Tüp başına tampon sıralama 80 mikrolitre pelet resuspend, anti-PE mikroboncuklar 20 mikrolitre eklenmesi takip. Girdap sonra, 15 dakika boyunca dört derece santigrat tüpler yerleştirin, sadece gösterildiği gibi santrifüj tarafından sıralama tampon 10 mililitre yıkama takip. 500 mikrolitrelik sıralama tamponundaki peletleri buz üzerinde yeniden askıya alın ve süper paramanyetik küreler içeren bir sütunu manyetik ayırıcıya yerleştirin.Sütunu üç mililitre sıralama arabelleğiyle durulayın. Sütun boşaltıldığında, kolona endokardiyal endotelyal hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini ekleyin ve ardından yıkama başına üç mililitre sıralama tamponu ile dört yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, sütunu yeni bir 15 mililitrelik toplama tüpüne aktarın ve CD31 pozitif hücreleri kolonun dışına, toplama tüpüne atmak için sütun pistonlu ve beş mililitre taze endotel hücreli orta kullanın.Sonra santrifüj ile boncuk izole endotel hücreleri toplamak. Tahmin edildiği gibi, kantitatif PCR beta aktin göreli olduğunu ortaya koymaktadır, endokardiyal endotel hücreleri endokardiyal belirteçleri Npr3, Hapln1 daha yüksek düzeyde ifade, Ve Cdn1 koroner endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında. Aynı şekilde, koroner endotel hücreleri endokardiyal endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında koroner belirteçleri Fabp4, Mgll ve Cd36 daha yüksek düzeyde ifade.Ayrıca, her iki hücre tipi de koroner endotel hücrelerinde gözlenen biraz daha yüksek düzeyde pan-endotel hücre marker geni Cdh5 ifade. Hücreleri FACS ve hücre popülasyonlarına özgü antikorlar kullanarak daha da arındırabiliriz. Örneğin, EEC'leri sıralamak için Anti-Npr3'u ve MDC'leri sıralamak için anti-Cd36'yı kullanabiliriz.Bu teknik, araştırmacıların AET ve Mm'lerin kalp gelişimi ve hastalıktaki rolünü hücre tipine özgü bir şekilde keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

isolation-endocardial-coronary-endothelial-cells-from-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. VEC tüberkülü veya broşürün her iki taraftan da izole edilmiş ve hemen şu olabilir, altta yatan interstisyel hücre (VIC) izolasyonu basittir.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Kalp kapakçığı endotel hücrelerini (VEC'ler) izole etme yeteneği, kapak gelişimi, bakımı ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.  Burada, VEC'lerin gelişimsel ve hastalık süreçlerine katkısını belirleyen çalışmalara izin verecek FACS kullanarak embriyonik ve yetişkin Tie2-GFP farelerinden VEC'lerin izolasyonunu açıklıyoruz.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Keşfedin endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin sıçan kalbinin ventriküler serbest duvarından izolasyon yöntemini. Bu protokol yüksek saflıkta hücre sağlar ve kalp hastalıklarındaki hücre tipine özgü mekanizmaları araştırmaya olanak tanır.

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

Daha fazla video keşfet