Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Genetik olarak izlenebilir tasarımda bir sonraki deneyin genel amacı, Caenorhabditis elegans, dokuya özgü şaperon etkileşimlerini tanımlamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, yeni dokuya özgü etkileşimleri ortaya çıkarmak için Golan AI'nın takılması ve davranışsal okumalar gibi kullanımı kolay tahlilleri birleştirmesidir. Stressiz bir embriyo senkronizasyonu için, yaklaşık 100 yumurtayı senkronize edilmemiş bir solucan plakasından yeni oturmuş bir NGM plakasına taşımak için bir solucan seçimi kullanın ve hayvanları uygun deney programına göre yetiştirin.

Hayvanlar yumurtlamanın ilk gününe ulaştığında, bakteri çimine uzak olan plakaya yavaşça bir mililitre M9 tamponu ekleyin ve plakayı, tampon plakayı tamamen kaplayacak şekilde döndürün. Sıvıyı çıkarmak ve hayvanları plakadan yıkamak için plakayı bir tarafa eğin. Tüm solucanlar plakadan yıkandıktan sonra, yumurtaların konsantre olduğu yerde bir kare Agar kesmek için standart bir plastik pipet ucu kullanın ve Agar parçasını yeni oturan bir NGM plakasına yerleştirin.

Yumurtaları aynı kültür koşulları altında yetiştirin. Kuluçka sonunda, plaka senkronize yumurtalarla kaplanmalıdır. Tüm hayvanları az önce gösterildiği gibi plakadan yıkadıktan sonra, bir mililitre taze M9 tamponu ekleyin ve yumurtaları plakadan çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Tüm yumurtalar ayrıldığında, santrifüjleme için tüm tampon hacmini plakadan konik bir tüpe aktarın. Tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, yumurtaları yeniden süspanse etmek için plakaya ve pipete bir mililitreye kadar taze M9 tamponu ekleyin.

Yumurtaları gösterildiği gibi beş kez daha yıkayın. Son yıkamadan sonra, yumurta peleti beyaz görünmelidir ve son 200 mikrolitre süpernatan hariç tümü çıkarılabilir. Bir deney için senkronize nematodları yetiştirmek için, bakteri çimine yakın yaklaşık 30 yumurtadan oluşan bir damla yerleştirin ve her bir girişim RNA'sı oturmuş plakaya ve yaklaşık 30 yumurtayı bakteri içeren boş vektörle oturmuş bir plakaya yerleştirin.

Daha sonra hayvanları deney protokolüne göre uygun kültür koşulları altında yetiştirin. Senkronize hayvanların embriyonik ölümcüllüğünü değerlendirmek için, hayvanlar yumurtlamaya başladığında, yaklaşık 100 yumurtayı boş bir tabağa aktarın ve sayımı basitleştirmek için yumurtaları sıralara yayın. 24 ila 48 saat sonra, yumurtadan çıkmamış yumurtaların yüzdesini puanlayın.

Referans olarak, deney hayvanı yumurtalarını boş vektör kontrol bakterileri ile tedavi edilen hayvanların yumurtalarıyla karşılaştırın. Bir felç testi oluşturmak için, hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar, ancak yumurtlama başlamadan önce, boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yaş senkronize hayvanları yetiştirin. Normal bir NGM Agar plakasının arkasına bir çizgi çizmek için ince bir işaretleyici kullanın ve işaretli çizginin üzerine beş ila on hayvan yerleştirin.

10 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın ve hatta felçli solucanlar olarak kalan hayvanların yüzdesini puanlayın. Referans olarak, bu verileri boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetiştirilen mutant hayvanların yüzdesiyle karşılaştırın. Protein Knockdown Validasyonu için, 250 ila 300 senkronize yumurtayı, ilgili çift sarmallı RNA eksprese eden veya bakteri içeren boş vektör ile oturtulmuş 60 milimetrelik bir NGM girişim RNA plakasına yerleştirin ve yumurtaları uygun deney süresi için yetiştirin.

Kuluçka süresinin sonunda, toplam 200 genç yetişkin hayvanı, hayvan yetiştirme sıcaklığında tutulan 200 mikrolitre PBST içeren 1,5 mililitrelik bir tüpün kapağına aktarın. Kapağı dikkatlice kapatın ve hayvanları 1 dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemenin sonunda, tüpe 800 mikrolitre taze PBST ekleyin ve solucanları tekrar santrifüjleyin.

Süpernatantın üst 900 mikrolitresini dikkatlice çıkarın ve nematodları az önce gösterildiği gibi 3 kez daha taze PBST'de yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatantın son 100 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın ve hayvanlara 25 mikrolitre 5X numune tamponu ekleyin. Numuneleri 92 santigrat derecede ve dakikada 1000 devirde 10 dakika ısıtın, ardından her numuneden 20 mikrolitre bir SDS sayfa jeline yükleyin.

Daha sonra, ilgilenilen proteinin nispi stabilitesini belirlemek için uygun antikorları kullanarak Western blot analizi yapın ve yasakların yoğunluğunu belirlemek için dansitometrik yazılım kullanın. Gelişim sırasında yere serilen HSP6, vahşi tip hayvanlarda güçlü bir gelişimsel durmaya neden olur. Aynı zamanda, HSP6 kas dokusunda vahşi tip RDE1'i eksprese eden kas spesifik bir girişim RNA suşu içinde yere serilmiş gelişimsel durmaya neden olmaz.

HSP6, bağırsak hücrelerinde vahşi tip RDE1'i eksprese eden bağırsağa özgü bir RNAI suşunu parçaladığında, güçlü bir gelişimsel arrest ve fenotip ile sonuçlanır. Bu nedenle, HSP6 MG585'te hafif bir büyüme gecikmesine neden olan bir mutasyon, bu mutasyona uğramış geni bağırsağa özgü bir girişim RNA suşuna geçirerek ve şaperon girişim RNA kütüphanesini tarayarak şaperon etkileşimlerini ağırlaştırmak veya hafifletmek için kullanılabilir. STI1, AHSA1 veya DAF41 girişim RNA'sı ile tedavi edilen miyozin organizasyonu ve UNC45 mutant hayvanları, dördüncü larva evresindeki yabani tip solucanlarınkine benzer.

Her ne kadar mutantlar yetişkinliğe ulaştıktan sonra bozulmuş sarkomerler sergileseler de. Buna karşılık, hem boş bir vektör kontrolü ile tedavi edilen UNC45 mutant hayvanları hem de vahşi tip hayvanlar etkilenmeden kalır. Genetik etkileşimler fiziksel etkileşimin göstergesi değildir.

Bu nedenle, tanımlanan etkileşimlerin doğasını doğrulamak ve doğrudan incelemek için genetik etkileşim ekranını kullanan takip deneyleri yapılmalıdır.