Name: Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Keşfedin, nanomalzeme maruziyetinin genotoksisite etkilerini değerlendirmek için 3D Hep G2 sferoid modelini kullanarak uzun süreli in vitro test yöntemlerini. Bu yöntem hayvan deneylerine olan bağımlılığı azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu araştırmanın 760813 sayılı hibe anlaşması kapsamında AVRUPA Birliği'nin PATROLS projesi için Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldığını kabul etmek istiyor.

1.Culturing kriyoprezihed HepG2 hücreleri
NOT: Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) elde edilen HepG2 hücreleri, 1x Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) foetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin antibiyotik ile desteklenmiş 4.5g/L D-glikoz ve L-glutamin ile kültürlendi.
<ol><li>37 °C'lik su banyosunda 30 dakika boyunca önceden ısınan DMEM hücre kültürü ortamı (takviyeler dahil).</li>
	<li>Bir şişe HepG2 hücresini sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda 2-3 dakika boyunca çözün, hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde çözülmesini sağlamak için şişeyi hafifçe döndürün. Kirlenme potansiyelini azaltmak için şişeyi O-halkasının üzerine batırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Çözdükten sonra, şişeyi su banyosundan çıkarın ve steril, Sınıf II laminer doku kültürü başlığının altına yerleştirmeden önce şişenin dış yüzeyini arındırmak için% 70 etanol ile cömertçe püskürtün.</li>
	<li>HepG2 hücrelerinin kriyovyal içeriğini, önceden ısıtılmış DMEM hücre kültürü ortamının 9 mL'sini içeren bir santrifüj tüpüne (takviyelerle) dikkatlice pipetlayın.</li>
	<li>10 mL'lik bir striptiz kullanarak, hücre süspansiyonunun 10 mL'sini 25 cm2 tek kullanımlık hücre kültürü şişesine aktarın ve alt kültürden daha büyük bir 75cm 2 tek kullanımlık hücre kültürü şişesine geçmeden önce %5 CO2 ve 37 °C'de kültürü 3 gün boyunca (tohumlamadan) kuluçkaya yatırın.</li>
	<li><li><li></li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li><li><li><li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig1large.jpg" target="_blank"></a><ol start="7"><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61141/61141eq1.jpg"> </li><li> </li><li></li><li><li><ol><li></ol></li><li> </li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig2large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li></ol></li><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li></li><li><li></ol><ol><li><li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig3large.jpg" target="_blank"></a><ol start="5"><li><li><li> </li><li><li><li><li><li></ol><ol><li></li></ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig4large.jpg" target="_blank"></a><ol start="2"><li><li></li></ol>

<ol><li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).</li>
<li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Kgs.+Lyngby%2C+Denmark%3A+Technical+University+of+Denmark%22%5BJournal%5D)">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li>
<li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li>
<li>Shah, U. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li>
<li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li>
<li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li>
<li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines.+Test+489%3A+In+vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%22">OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay</a>. , (2016).</li>
<li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocytes%2C+HepG2+cells%2C+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li>
<li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li>
<li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019).</li>
<li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG%5BTitle%5D)+AND+%22European+Union+Grant+Agreement+n%C2%B0+2009%22%5BJournal%5D)">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).</li>
<li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+and+M1%3A+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214(2018).</li>
<li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1%3A+A+review+on+metabolism%2C+toxicity%2C+occurrence+in+food%2C+occupational+exposure%2C+and+detoxification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li>
<li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295(2019).</li>
<li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).</li>
<li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li>
<li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li>
<li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li>
<li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li>
<li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li>
<li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li>
<li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDD%3A+A+computational+model+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fiber+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).</li>
<li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

3D hepatik modeller için uygulamalar, hedeflenen belirli biyokimyasal uç noktaya veya olumsuz sonuç yoluna bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Her modelin, birincil insan hepatosit (PHH) modellerindeki interdonor varyasyondan hücre hattı tabanlı modellerde azaltılmış sitokrom p450 aktivitesine kadar yararları ve sınırlamaları vardır, ancak hepsi kendi başına değerlidir6,12,18,19. Genotoksisiteyi değerlendirirken, aktif çoğalma gerektiğinden, in vitro mikronükleus testi gibi düzenleyici onaylı uç noktalarla uyumluluk modellerinde sınırlamalar vardır. Genotoksisite değerlendirmesi, DNA onarımının geçici lezyonları düzeltmesi için fırsat olduğunda sabit DNA hasarının hücre sonrası bölünmesinin ölçülmesini gerektirdiğinden, bu gereklidir. Ne yazık ki, son derece farklılaştırılmış hepatosit (yani, HepaRG) bazlı küreseller veya PHH mikrotizeleri, en fizyolojik olarak ilgili karaciğer benzeri özellikleri sergilediği düşünülen statik (proliferatif olmayan) modelleroluşturur 12,19,20. Sonuç olarak, burada sunulan 3D HepG2 küresel model, genotoksisite testini destekleyebilecek uygun, alternatif bir model sağlar. HepG2 hücre hattı bazlı küreseller, albümin ve üre üretimi ve bazı CYP450 aktivitesi5,12,19gibi temel karaciğer benzeri özellikleri korurken, küresellerin dış yüzeyinde yeterince aktif olarak bölünen hücrelere sahiptir. Esas olarak bu in vitro karaciğer modeli mikronükleus testini tamamlamak için geliştirilmiştir, çünkü bu genotoksisite testi için pilde önerilen iki in vitro testlerden biridir8,10,11,21. Bununla birlikte, model DNA dizileme analizi ve gen ekspresyon (RNA) teknolojilerine kolayca uygulanabilirken, kuyruklu yıldız testi gibi diğer DNA hasar uç noktaları için daha fazla uyarlanıp kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, ENM parazitinin bazı uç nokta analizlerinde oynadığı rolü göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, akış sitometrisi bazlı analizler özellikle partikül paraziti nedeniyle ENM genotoksisite değerlendirmesi için uygun olmayabilir22.
Aktif olarak hücre bölünmesi geçiren küresel modellerin sınırlayıcı faktörlerinden biri boyutlarıdır. Modelin çoğalmaya devam etmesine izin veren yeterli hücre olması gerektiğinden, tohumlama yoğunluğunun optimizasyonu kritik öneme sahiptir; ancak çok yüksek olmayan bir hücre sayısı, bu da küreselin aşırı kompakt hale gelmesine neden olur ve nekrotik çekirdeğin artmasına neden olur. Bu nekrozun nedeninin sınırlı oksijen ve besin difüzyonu olduğuna inanılmaktadır, çünkü bu difüzyonun sınırının yaklaşık 100 – 150 μm doku23,24olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu hücre türüne, hücre numarasına, iskele etkileşimlerine ve kültür koşullarına bağlıdır25. O zamandan beri, yaklaşık 700 μm çapının C3A sferoidlerin merkezinde nekrozun erken başlamasını önlemek için sınır olduğu gösterilmiştir, küresel başına 4000 HepG2 hücresinin tohumlaması, maruz kalma sırasında modelin çapının ≤500 μm26olmasını sağlar. Ayrıca, Shah ve arkadaşları, küresel başına 5000 hücrenin üzerinde tohumlanan HepG2 hücrelerinin, kültürde 7 gün sonra canlılıkta% 25'lik bir azalma sergilediğini ve bunun ortalama 680 μm çapına ve 20 μL asılı damla5'tebesinlerin sınırlı mevcudiyetine bağlı olabileceğini tespit etti. Bunun üstesinden gelmek için, mevcut protokolde tasarlanan model, asılan damlanın küreselin ilk oluşumunu takiben agarose kaplı kuyulara aktarıldığı kritik bir adımdan geçer. Bu, küreseller içinde sürekli artan hücre sayısını sürdürmek için daha fazla kültür ortamının mevcut olmasını sağlar. Sonuç olarak, HepG2 küresel modeli kültürde 10 gün sonra% 70'in üzerinde uygulanabilir kalır ve uzun süreli tehlike değerlendirmesi in vitro içinkullanılabilir. 
HepG2 küresel modeli hem akut hem de uzun süreli maruz kalma rejimlerini destekleyebilirken, uzun kültür dönemlerinde hücre kültürü ortamının yenilenmesi, sferoidlerin potansiyel kaybı nedeniyle ortamın tamamen değiştirilmesi tavsiye edildiği için bu model için kısıtlanır. ENM maruziyetlerinde, homojen ENM dağılımlarının aglomera ve tortuya eğiliminin yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bununla birlikte, bir ENM çökeltilerinin parçacık parametrelerine (örneğin, boyut, şekil ve yoğunluk) bağlı olarak değişebileceği ve entrika sedimansasyonu, difüzyon ve dozimetri (ISDD) modeli veya enm (süspansiyon) maruziyeti ile ilgili olarak sıklıkla atıfta bulunulan son türevleri kullanılarak teorik olarak belirlenebileceği dikkat çekicidir27,28. Bu akılla, hücre kültürü ortamının sadece% 50'sinin hücre kültürünün yüzeyinden dikkatlice çıkarılması durumunda, ENM dozunun bozulması ve daha sonra çıkarılmasının teoride minimum olması gerektiği varsayılıyor. Bununla birlikte, Brownian hareketi söz konusu olduğunda, bu kesinlikle böyle olmayabilir ve test edilecek her bir ENM'nin birikmesi ve tortulması için daha fazla çalışma yapılmalıdır, doğru dozimetrinin uzun süreli maruz kalma rejimleri boyunca korunmasını sağlamak için27. Esas olarak bu, tekrarlanan dosing rejimlerini gerçekleştirirken göz önünde bulundurulacak potansiyel bir sınırlamadır, çünkü bu son, birikmiş konsantrasyon için kritik olabilir. Öte yandan, kimyasal bazlı maruziyetler, dikkate alınması gereken kendi sınırlamaları olmadan olmasa da, kimyasal maddelerin çözeltide kalma eğiliminde olduğu konusunda daha basit bir yaklaşım sunar ve böylece yeni eklenen konsantrasyona ek olarak orijinal kimyasal konsantrasyonun doğrudan değiştirilmesi, medya tazeleme sırasında kaybolan herhangi bir kimyasalın buna göre değiştirilmesini sağlar29. Gelecekteki uygulamalar, modelin uzun süreli kültür dönemlerinde tekrarlanan maruz kalma rejimlerine uygunluğunu değerlendirmeyi içerecektir, çünkü tekrarlanan dosing stratejileri, belirli bir organ sisteminin ksenobiyotik bir maddenin biyoakümülasyonundan kaynaklanan olumsuz etkileri iyileştirme veya üstesinden gelme yeteneğini değerlendirmek için çok önemlidir.
Sonuç olarak, bu 3D in vitro hepatik model, bir dizi gerçekçi maruz kalma senaryosunu değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece hem ENM'yi hem de kimyasal tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
to:
<img alt="Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

İnsan tabanlı çok sayıda uygulama (örneğin, gıda, kozmetik, giyim, spor ekipmanları, elektronik, ulaşım ve tıp) genelinde çeşitli mühendislik nanomalzemelerin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, insanların düzenli olarak ENM'ye maruz kalmaları kaçınılmazdır. Bununla birlikte, bu malzemeleri çok sayıda uygulamada avantajlı gören yeni, boyuta özgü fizyoterapi-kimyasal özelliklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde yan etkilere neden olabileceğine dair endişeler artmaktadır. Şu anda, bu ENM'lere fizyolojik olarak daha fazla maruziyeti aktif olarak yansıtmak ve bu malzemelerin akut, uzun süreli ve tekrarlanan düşük doz maruz kalma senaryoları üzerindeki potansiyel toksisitesini değerlendirmek için birçok uluslararası faaliyet uygulanmaktadır.
Karaciğerin MARUZ KALMA SONRASI ENM birikiminin önemli bir bölgesi olduğu yaygın olarak bilindiğinden, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti göz önüne alındığında anahtardır1,2. Ayrıca, karaciğer sistemik dolaşıma giren maddelerin metabolizması ve detoksifikasyonu için birincil organ sistemidir3. 2D hepatosit modellerinin karmaşık çok hücreli etkileşimlerin karmaşıklıklarını doğru bir şekilde taklit etmediğini veya in vivo olarak gözlenen metabolik aktiviteyi uygun şekilde temsil etmediğini kabul eden anlayışa dayanarak, in vivo ikame teknolojileri için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili in vitro 3D karaciğer modelleri geliştirmeye daha fazla odaklanılmıştır4,5. Gelişmiş 3D kültür teknolojilerinin kullanılması, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimlerinin araştırılmasını sağlayan in vitro hepatik modellerin uzun ömürlülüğünü artırır. Ek olarak, bu gelişmiş kültür formatı, safra canaliculi, aktif taşıyıcı süreçleri ve geliştirilmiş CYP450 ilaç metabolizasyon yetenekleri gibi gelişmiş fizyolojik, organotipik özelliklerin oluşumunu teşvik eder, böylece modellerin öngörülebilirliğini artırır6. Mono-kültürlerden (sadece hepatositler) veya ortak kültürlerden (nonparenkimal hücreli hepatositler) oluşan mevcut 3D in vitro hepatik modeller çeşitli biçimlerde mevcuttur, ultra yüksek yapışma plakalarındaki mikrotissues veya sferoidlerden, asılı damla sferoidlere, matrislere ve / veya iskelelere gömülü hücrelere ve mikroakışkan hücre kültürü platformlarına kadar, hepsi hepatik toksisite değerlendirmesi için etkili gelişmiş in vitro modeller olarak kabul edilir6,7. Bununla birlikte, bu model sistemlerinin çoğu yüksek bakım gerektirir, özel ekipman gerektirir ve pahalıdır. Ayrıca, bu modeller genellikle sabit DNA hasarını ölçen yöntemleri kullanarak genotoksisite testi gibi tehlike uç noktalarının değerlendirilmesinde kullanılmasını önleyen statiktir (yani bölünmeyen hücre modelleri). Genotoksisite, düzenleyici toksikolojide temel bir ön koşuldur ve herhangi bir toksik edicinin risk değerlendirmesinin hayati bir bileşenidir8. Eksojen bir maddeye maruz kalmadan sonra ortaya çıkabilecek tüm DNA hasarı biçimlerini ölçmek için uygulanabilecek tek bir test yoktur. Bununla birlikte, in vitro genotoksisite test pilinin temel bir bileşeni, brüt kromozomal hasarı ölçen güvenilir ve çok yönlü bir teknik olan mikronükleus testidir9. OECD Test Kılavuzu 487 tarafından açıklanan, in vitro DNA hasarını ve genotoksisiteyi değerlendirmek için kullanılan altın standart bir tekniktir ve düzenleyici tehlike değerlendirmesi10,11için test pili gereksiniminin bir parçasıdır.
İnsan hepatosellüler karsinom hücre hattı, HepG2, hücreler kolayca kullanılabilir, kaynağa nispeten ucuz, kültüre basit ve yüksek verim taramasına uygun olduğu için ilk tehlike değerlendirmesi taraması için yaygın olarak kullanılır12,13. 3D küresel yapılara kültürlendiğinde, karaciğer mikroçevresini iyi bir şekilde yeniden özetledikleri ve mikronükleus testini desteklemek için yeterli proliferatif yeteneklere sahip hepatik bir model sundukları gösterilmiştir3. HepG2 küresel modellerinin daha da geliştirilmesi, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimleri (≤14 gün) üzerinde genotoksisite tehlike değerlendirmesini desteklemek için modelin uzun ömürlülüğünü ve karaciğer benzeri işlevselliğini iyileştirmek için kurulmuştur. Böylece, 3R'lerin değiştirilmesi ilkeleri doğrultusunda, hayvan deneylerini azaltmak ve iyileştirmek için mevcut protokol, akut, uzun süreli ve tekrarlanan kimyasal ve ENM maruziyetlerini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde takip eden birden fazla toksikolojik uç noktayı (örneğin karaciğer işlevselliği, (pro)enflamatuar belirteçler, sitotoksiklik ve genotoksisite) güvenilir bir şekilde değerlendirebilen gelişmiş bir 3D in vitro hepatik model sağlamak için kurulmuştur.
Burada, akut veya uzun süreli, tekrarlanan ENM maruziyetlerini takiben genotoksisite tehlike değerlendirmesi için fizyolojik olarak ilgili 3D hepatosit hücre hattı tabanlı in vitro model sistemi kurmak için bir yöntem sunuyoruz. Protokol 6 temel aşamaya ayrılabilir: kriyoprezer korunmuş HepG2 hücrelerinin kült haline alınması; HepG2 küresel preparat; HepG2 sferoid asılı damladan agarose süspansiyona transfer; HepG2 küresel hasat; mikronükleus tahlil ve puanlama; ve veri analizi.

<table><tbody><tr><td>Aflotoksin B1</td><td>Sigma Aldrich, İngiltere</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma Aldrich, İngiltere</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav Bandı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albümin Testi</td><td>Sigma Aldrich, İngiltere</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Tozu</td><td>Sigma Aldrich, İngiltere</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Dondurma Yardımı</td><td>Thermo Fisher Bilimsel, Birleşik Krallık</td><td>5100-0001 - Bay Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, İngiltere</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Sitoloji Metal Klipsleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific, İngiltere</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>4.5g/L D-Glikozlu DMEM, L-Glutamin</td><td>GIBCO, Paisley, İngiltere</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, fenol kırmızısı, 4.5g/L D-Glikoz, Hepes ile L-Glutamin</td><td>GIBCO, Paisley, Birleşik Krallık</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Montaj Ortamı</td><td>FisherScientific, Birleşik Krallık</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>FisherScientific, Birleşik Krallık</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, Birleşik Krallık</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin</td> <td>için Filtre KartlarıFisherScientific, İngiltere</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu Cam Slaytlar</td><td>ThermoFisher Scientific, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa'nın Leke Geliştirilmiş R66 Çözümü, Gurr</td><td>VWR Chemicals, İngiltere</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Cam Lameller (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre ve Lamel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Daldırma Yağı Mikroskop</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminer Sınıf II Doku Kültürü Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık Mikroskobu</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>FisherScientific, İngiltere</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtresiz, Steril 200 & mikro; l ve 1000 & mikro; l Pipet uçları</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar</td><td>ThermoFisher Scientific, Danimarka</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 ve P200 mikropipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 ve P50 çok kanallı pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl2 ve CaCl2 Ücretsiz</td><td>GIBCO, Paisley, İngiltere</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Kalem / Strep</td><td>GIBCO, Paisley, İngiltere</td><td>15140-122, Penisilin / Strepmyosin 100X veya 10.000U / ml</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz Tampon Tabletleri</td><td>GIBCO, Paisley, İngiltere</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Hunileri Shandon Cytospin 4 Santrifüjleri için</td><td>FisherScientific, Birleşik Krallık</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" - Prob</td><td>Branson, ABD</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 ve T-75 Doku Kültürü Şişesi</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td>T-25 (690175) ve T-75 (660175)</td><td></td></tr> <tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich, İngiltere</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Üre Test Kiti</td><td>Sigma Aldrich, İngiltere</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Dezenfektan</td><td>DuPont, İngiltere</td><td>Retrust + On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu (37? C)</td> <td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tartı Terazisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070 %</td><td></td></tr><tr><td>0.05 Tripsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, İngiltere</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL ve 1.0mL Eppendorf Tüpleri</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 & mikro; m Filtre Ünitesi</td><td>Millex HA, MF-Millipore, İngiltere</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mL Şırınga</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, İngiltere</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20 mL LS Sintilasyon Cam Şişeleri, 22-400 Folyo Kaplı PP Kapaklar</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Almanya</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37? C ve %5 CO2 ISO Sınıf 5 Hepa Filtre İnkübatörü</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pastör Pipeti</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Konik Şahin Tüpleri</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL veya 100mL Cam Şişeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Etekli Şahin Tüpleri</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL ve 25 mL Pipetler</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Kare, Petri Kabı</td><td>Greiner-Bio-One, İngiltere</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

uzun süreli nanomalzeme maruziyetini takiben İn vitro genotoksisite testi için gelişmiş 3d karaciğer modelleri

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Çeşitli mühendislik nanomalzemelerinin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, ENM'ye maruz kalmak kaçınılmazdır ve sağlam, tahmine dayalı in vitro test sistemlerinin geliştirilmesi esastır. Karaciğer metabolik homeostaz ve detoksifikasyonda hayati bir rol oynamanın yanı sıra ENM birikimi sonrası maruziyetin önemli bir yeri olduğu için, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti düşünüldüğünde anahtardır. Buna ve 2D hepatosit modellerinin karmaşıklıkları doğru bir şekilde taklit etmediğinin kabul edilen anlayışına dayanarak, in vivo olarak gözlenen karmaşık çok hücreli etkileşimlerin ve metabolik aktivitenin karmaşıklıklarını taklit etmemektedir, enm tehlike değerlendirme amaçları için uyarlanmış fizyolojik olarak ilgili 3D karaciğer modellerinin geliştirilmesine daha fazla odaklanılmıştır. Hayvan deneylerini değiştirmek, azaltmak ve iyileştirmek için 3R'lerin ilkeleri doğrultusunda, hem genişletilmiş hem de tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini (≤14 gün) destekleyebilen kullanıcı dostu, uygun maliyetli bir sistem olan 3D HepG2 hücre hattı tabanlı bir karaciğer modeli geliştirilmiştir. Bu küresel modeller (çapı ≥500 μm) proliferatif kapasitelerini korur (yani hücre modellerini böler) genotoksisite in vitro'yu etkili bir şekilde değerlendirmek için 'altın standart' mikronükleus testi ile birleştirilmiş olmalarını sağlar. Bir dizi toksikolojik uç nokta (örneğin, karaciğer fonksiyonu, (pro-)inflamatuar yanıt, sitotoksiklik ve genotoksisite) hakkında rapor verme yetenekleri, hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimlerinde çeşitli ENM'ler kullanılarak karakterize edilmiştir. Bu 3D in vitro hepatik model, daha gerçekçi ENM maruziyetlerini değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece ENM tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.

Bu hücre hattı bazlı 3D karaciğer sferoid modelinin uzun süreli kültür ve genotoksik tehlike değerlendirmesi için uygunluğu, modelin kültürde 14 gün boyunca uygulanabilirliğini ve mikronükleus testine uygulanabilirliğini belirlemek için temel karakterizasyon yapılarak değerlendirildi.
3D HepG2 Karaciğer Küresel Modelinin Temel Karakterizasyonu Herhangi bir in vitro toksikolojik değerlendirmeden önce, agarose transferi veya kimyasal / ENM tedavisini gerçekleştirmeden önce 3D HepG2 sferoidlerinin düzgün bir şekilde oluşmuş olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Asılı bırakma yöntemi kullanılarak üretilen HepG2 küresellerinin, Şekil 5A-5C'degösterildiği gibi ortalama çapı 495,52 μm W x 482,69 μm H olan kompakt, küresel şekilli küresel sferoidler oluşturması genellikle tohumlama sonrası 2 - 3 gün sürer (4000 hücre/küresel). Doğru oluşmuş ve in vitro toksikolojik değerlendirmede kullanılması kabul edilebilir olan HepG2 sferoidleri, pürüzsüz bir yüzeye sahip ve görsel projeksiyonları olmayan kompakt, küresel şekilli bir yapıya sahip olmalıdır. Şekil 5, kaliteli (Şekil 5D-F) ve düşük kalite (Şekil 5G-I) sferoid örnekleri sağlar. İkincisi atılmalıdır. Tipik olarak, plaka başına oluşan küresellerin% 90-95'i doğru şekilde oluşacak ve daha fazla deney için uygun olacaktır.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Şekil 5: Asılı bırakma yöntemi ile oluşturulan HepG2 sferoidlerinin doğal morfolojisini gösteren ışık mikroskopi görüntüleri. (A-C) gösteri Gün 2 ve (D-I) Gün 4 HepG2 karaciğer sferoidleri tohumlama sonrası. (D-F) kaliteli HepG2 küresellerine örnektir, (G-I) ise kötü biçimlendirilmiş küreseller gösterir. Tüm görüntüler mikroskop kullanılarak X20 hedefiyle çekildi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">eder.</a>
HepG2 küresel canlılığını daha da doğrulamak için, karaciğer benzeri işlevlerini değerlendirmek için temel bir kolorimetrik Bromocresol Green Albumin (BCG) Tahlil veya Üre Tahlil yapılabilir. Karaciğer benzeri işlevsellik, karaciğer küresel modelinin uzun ömürlülüğünü belirlemek ve uzun süreli veya tekrarlanan ENM/ kimyasal bazlı tehlike değerlendirmesini destekleyip destekleyemeyeceğini belirlemek için 14 günlük bir kültür süresi boyunca Trypan Blue Exclusion Tahlil kullanılarak uygulanabilirlik doğrultusunda değerlendirildi (Şekil 6). Albümin konsantrasyonu kültür dönemi boyunca tutarlı kaldı. Üre üretimi, 7. 3D HepG2 sferoidlerde üretilen albümin ve üre seviyelerinin, 2D formatında kültürlenen aynı hücre hattında gözlemlenenden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu belirtmek önemlidir. Nitekim HepG2 hücrelerinin 2D kültürleri, pik albümin ve üre düzeyleri sırasıyla 0.001 mg/mL ve 0.010 ng/μL olarak sıralandı. Ayrıca, Shah ve ark. tarafından neredeyse aynı hepg2 sferoid sistemi kullanılarak yayınlanan önceki çalışmalarında, yazarlar 2D kültürlü HepG2 hücrelerine kıyasla 3D HepG2 in vitro model sistemlerinde metabolik aktivitede (CYP1A1 ve CYP1A2) önemli bir iyileşme olduğunu vurgulamaktadır5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Şekil 6: HepG2 karaciğer sferoidleri için 14 Günlük temel karakterizasyon verileri. Asılı düşüşten transfer edildiktan sonra, (A) HepG2 küresel modelinin 14 günlük bir süre boyunca uygulanabilirliğini vurgularken, (B) ve (C) sırasıyla karaciğer benzeri albümin ve üre işlevselliğini vurgular. SEM'± sunulan ortalama veriler, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Nekrotik bir çekirdeğin kaçınılmaz gelişimi, 3D karaciğer sferoid kültürlerinin bilinen bir sınırlaması ile, mikronükleus testini desteklemek için gereken proliferatif yeteneği korurken uzun süreli (5-10 gün) maruz kalma rejimlerini sürdürebildiğini göstermek için bu HepG2 tabanlı modelin uygulanabilirliği oluşturulmalıdır5. Gerçekten de, bu 3D karaciğer sferoid modelinin kültürde 10 gün boyunca p canlılığı koruduğu gösterilmiştir. Buna dayanarak ve ≥14 günlük kültür döneminde gözlenen sürekli karaciğer benzeri işlevsellikle birlikte, bu 3D karaciğer küresel modeli böylece 10 güne kadar uzun süreli, tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini destekleyebilir (yani, küresellerin yaşayabilirliği% 70'in altına düşmeden önce). Referans olarak, 4000 hücrede/sferoidde tohumlanan HepG2 sferoidleri için albümin seviyelerinin 20,0 ng/μL ≥ olması, üre üretiminin ise bu modelle in vitro toksikolojik değerlendirme yapmadan önce 0,25 ng/μL ≥ olması önerilir.
Mühendislik Nanomalzemelerinin Genotoksisite Değerlendirmesi Genotoksisite değerlendirmesi için mikronükleus tahlili hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) ENM maruziyetlerini takiben mikronüklei varlığını belirlemek için kullanıldı. Aflatoksin B1 bilinen bir karaciğer kanserojenidir16,17 ve mikronükleus tahlil için önerilen bir pozitif kontroldür. Optimizasyon deneyleri, 0.1 μM Alfatoksin B1'in 3D HepG2 karaciğer sferoidlerinde önemli bir pozitif (≥2.0 kat artış) genotoksik yanıt verdiğini ve bu nedenle bu modelle yapılan her mikronükleus testinde kullanıldığını göstermiştir. HepG2 küresel modeli kullanılarak yapılan mikronükleus test sonuçlarının geçerliliğini sağlamak için, bu 3D in vitro modelde kullanılan HepG2 hücreleri için arka plan mikronükleus frekansı% 0.6 –% 1.2 aralığında olmalıdır. Sonuç olarak, Alfatoksin B1, negatif kontrolde görülenden en az iki kat daha yüksek bir genotoksik yanıt vermelidir; böylece, 0.1 μM Alfatoksin B1% 1.5 -% 3.0 arasında bir mikronüklei frekansı indüklemelidir. Bu kontrol parametreleri kullanılarak, ENM ilişkili genotoksisite in vitro daha sonra güvenilir bir şekilde değerlendirilebilir. OECD Test Kılavuzu 487'ye dayanarak, bir ENM veya kimyasalı test ederken, seçilen konsantrasyonların% 55'ten fazla ±% 5 sitotoksisiteye neden olmaması gerektiğini belirtmek önemlidir (negatif kontrol ile ilgili olarak CPBI veya RVCC değerlerinde bir azalma ile gösterilir)11. Şekil 7, Aflatoksin B1 ve iki ENM (titanyum dioksit (TiO2)ve dilimleme (Ag)) HepG2 sferoidlerinde hem akut hem de uzun süreli maruziyetleri takiben değerlendirildiğinde ve daha sonra genotoksik potansiyel mikronükleus tahlili kullanılarak analiz edildiğinde elde edilen verileri göstermektedir. Değerlendirilen her iki ENM de akut (24 saat) maruz kalma ve uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimi üzerinden noncytotoxic, düşük dozda 5.00 μg/mL'de test edildi. Hem TiO2 hem de Ag ENM'lerde genotoksisite için benzer bir eğilim gözlenebilir, böylece 24 saat maruz kalmanın ardından ortaya çıkan yüksek genotoksisite yanıtı uzun süreli 5 günlük maruziyet sonrasında belirgin değildi. Bu, her iki zaman noktasında aflatoksin B1 pozitif kontrolünün neden olduğu sürekli genotoksisiteye rağmen oldu.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Şekil 7: TiO2 ve Ag ENM maruziyetini takiben Genotoksisite değerlendirmesi HepG2 karaciğer sferoidleriüzerinde. TiO2 ve Ag ENM'nin 5.00 μg/mL'sine uzun süreli (120 saat) maruziyette mikronükleus tahlil direği (A) akut (24 saat) ve(B) kullanılarak genotoksisite (mikronükleus sıklığı) değerlendirmesi. Negatif kontrol sadece bir ortamdır, pozitif kontrol ise 0.1 μM Aflatoksin B1'dir. SD. Negatif kontrolle ilgili olarak belirtilen anlam ± sunulan ortalama veriler (n=2) : * = s≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Bu Hep G2 modeli, hayvanlarda test ihtiyacını en aza indirmek amacıyla nanomalzemeye uzun süre maruz kaldıktan sonra sabit DNA hasarının potansiyel indüksiyonunu daha güvenilir bir şekilde değerlendirmek için ilgili bir alternatif in vitro test sistemi sağlar. Hep G2 küresel modeli, 14 günlük bir süre boyunca canlı ve işlevsel kalmanın yanı sıra uygun bir proliferasyon seviyesini sürdürme yeteneğine sahiptir. Bu, mikronükleus testi de dahil olmak üzere bir dizi biyokimyasal ve genotoksisite uç noktasının test edilmesini destekler.Bu protokolü denemeden önce, önce birkaç alıştırma yapmanızı öneririm. Hücre tohumlarken veya ortamı değiştirirken dikkatli olun, çünkü bunlar hassas bir yaklaşım gerektirir. 96 oyuklu bir kültür plakasının kuyucuklarına 100 mikrolitre steril oda sıcaklığında PBS ekleyerek başlayın.Plakanın kapağını ters çevirin ve 20 mikrolitrelik hücre süspansiyonu damlasını kapağın her bir kuyu oluğunun ortasına dikkatlice pipetleyin. Yerleştirmenin doğruluğunu sağlamak için her seferinde iki ila dört damla ekleyen çok kanallı bir pipet kullanın. Bir seferde sadece dört steroid tohumlayın ve başlamadan önce pipet uçlarının hepsinin hizalandığından emin olun.Çoklu kanalı tuttuğunuz açı, sferoidlerin oluşturulma biçiminde bir fark yaratacaktır. Damlaların kapaktaki kuyucukların olukları içinde ortalandığından emin olun, ardından kapağı plakanın üstüne yavaşça çevirin, böylece damlalar PBS ile kuyucukların üzerine asılır. Agaroz üzerine küresel transferden önce plakayı üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.İnkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve kapağı plakadan dikkatlice kaldırın, PBS'yi atın, kalan sıvıyı çıkarmak için plakaya hafifçe vurun ve plakaların iki ila üç dakika kurumasını bekleyin. Agarozu erittikten sonra, kabarcıkları çıkarmak için hafifçe döndürün ve her bir oyuğun tabanına 50 mikrolitre ekleyin. Plakayı iki dakika oda sıcaklığında bırakın, ardından her bir oyuktaki katı agaroz tabakasının üzerine 100 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin.Bu küresel damlacıkların bulunduğu kapağı, sferoidler tekrar asılı kalacak şekilde plakanın üzerine geri yerleştirin, ardından sferoidleri plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarmak için plakayı 200 kez G'de üç dakika santrifüjleyin. Kürelerin yerleşmesine izin vermek için plakayı 24 saat daha inkübe edin. Tasarlanmış nanomalzemelerin veya ENM'lerin dağılmasını takiben, bunları önceden ısıtılmış DMEM ile istenen nihai konsantrasyona seyreltin.Sferoidlerle her oyuktan 50 mikrolitre besiyeri aspire edin ve bunu ENM'li 50 mikrolitre besiyeri ile değiştirin. Sferoidleri hasat etmek için, agaroz ile temastan kaçınmaya dikkat ederek, 100 mikrolitre hücre kültürü ortamını her bir oyuktan küresel doku ile aspire etmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Sferoidleri steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.Küresel süspansiyonu beş dakika boyunca 230 kez G'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın ve daha fazla analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Sferoid peletini bir mililitre steril, oda sıcaklığında PBS'de yıkayın, ardından üç dakika boyunca 230 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Sferoidleri 500 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte altı ila sekiz dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, tripsinezlenmiş Hep G2 hücrelerini, bir mililitre DMEM ile nötralize etmeden önce tamamen ayrışmak ve yeniden süspanse etmek için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 230 kez G'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir küvet hunisi kurulumu oluşturmak için, hazırlanan mikroskop lamını metal desteğe yerleştirin, sürgünün üstüne bir filtre kartı yerleştirin, ardından küvet hunisini üstüne sabitleyin.Küvet hunilerini, huni yukarı bakacak şekilde sitosantrifüjde düzenleyin, böylece her birine doğrudan 100 mikrolitre hücre süspansiyonu eklenebilir. Ardından slaytları el yazması talimatlara göre sabitlemeye devam edin. Fosfataz tamponunda seyreltilmiş% 20'lik bir Giemsa boyama çözeltisi hazırlayın.Çözeltiyi karıştırmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından bir huni içinde katlanmış filtre kağıdı ile filtreleyin. Her slayttaki cytodot'a üç ila beş damla filtrelenmiş Giemsa solüsyonu eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın ve oda sıcaklığında sekiz ila 10 dakika bekletin. Slaytları art arda iki fosfataz tampon yıkamada yıkayın.Ardından, fazla lekeyi çıkarmak için soğuk su altında kısa bir süre durulayın ve kurumaya bırakın. Herhangi bir in vitro toksikolojik değerlendirmeden önce, 3D HepG2 sferoidlerinin düzgün bir şekilde oluşup oluşmadığını kontrol etmek önemlidir. Tohumlamadan dört gün sonra, pürüzsüz bir yüzeye sahip ve görsel çıkıntı olmayan kompakt küresel şekilli sferoidler oluşmamalıdır.Tohumlamadan dört gün sonra iyi kaliteli ve düşük kaliteli sferoidler burada gösterilir. Tipik olarak, plaka başına oluşturulan sferoidlerin %90 ila 95'i doğru şekilde şekillenecek ve daha fazla deney için uygun olacaktır. Karaciğer sferoid modelinin uzun ömürlülüğünü belirlemek ve uzun vadeli ENM veya kimyasal bazlı tehlike değerlendirmesini destekleyip destekleyemeyeceğini belirlemek için canlılık ve karaciğer benzeri işlevsellik 14 günlük bir kültür periyodu boyunca değerlendirildi.Albümin konsantrasyonu kültür periyodu boyunca tutarlı kalırken, sferoid başına üre üretimi 14. günde düşmeye başlamadan önce artmıştır. Genotoksisite değerlendirmesi için, akut ve uzun süreli ENM maruziyetlerini takiben mikronükleusların varlığını belirlemek için mikronükleus testi kullanıldı. Sferoidler, titanyum dioksit ve gümüş olmak üzere iki ENM'ye maruz bırakıldı.Her iki ENM'ye akut maruziyetten sonra genotoksisite için benzer bir eğilim gözlenmiştir, ancak yüksek genotoksisite tepkisi uzun süreli, beş günlük bir maruziyetten sonra belirgin değildi. Bu yöntemi takiben, hem süpernatan hem de sferoidler çok sayıda biyokimyasal uç nokta için hasat edilebilir. Bunlar arasında hücre canlılığı, karaciğer fonksiyon deneyleri, SID 450 analizi, zayıf inflamatuar belirteçler ve gen ekspresyonu bulunur.Bu teknik şu anda hem kimyasalların hem de nanomalzemelerin rutin jeotoksisite testine uygulamak isteyen bir dizi sözleşmeli araştırma laboratuvarında test edilmektedir. Bu, in vivo test yaklaşımlarına olan bağımlılığı azaltma potansiyeline sahiptir.

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

Sıçanlarda karaciğer fibrozunun bir hayvan modelini üretmek ve karaciğerin histolojik incelemesi ile fibroz derecesini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Model, karaciğer hastalığının gelişimini incelemek ve potansiyel anti-fibrotik ajanların etkinliğini test etmek için kullanılabilir.

Rat Dimethylnitrosamine Başlatılan Karaciğer Fibrozis Modeli

Decellularized bir sıçan karaciğerinin hücreselleştirilmiş hücre dışı matrisi, bir virüsün veya viral vektörün dağılımını ve transgen ekspresyonunu incelemek için insanlaştırılmış, üç boyutlu bir ex vivo model olarak kullanılabilir.

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Bu protokol, eşlik eden fibrotik stromal bölmeli 3D biyomimetik bir model sunar. Hücresel etkileşimlerin, tümör büyümesinin ve metastazın aktif bir arabulucu olan stromal hücre dışı matrisin biyo-fiziksel özelliklerini taklit eden oranlarda fizyolojik olarak ilgili hidrojellerle hazırlanmıştır.

Ayarlanabilir Biyo-Fiziksel Özelliklere Sahip 3D Ortamda Tümör-Stroma Etkileşimlerini İncelemek İçin Karaciğer Kanseri için Biyomimetik Model

Çift reçine döküm mikro hesaplamalı tomografi veya DUCT, organ mimarisinin 3D analizini kolaylaştırmak için aynı anda iki borulu sistemin görselleştirilmesini, dijitalleşmesini ve segmentasyonunu sağlar. DUCT, iki radyopak reçinenin ex vivo enjeksiyonunu ve ardından tomografik verilerin mikro bilgisayarlı tomografi taramasını ve segmentasyonunu birleştirir.

DUCT: Çift Reçine Dökümü ve ardından 3D Karaciğer Analizi için Mikro Bilgisayarlı Tomografi

Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

İlaca bağlı karaciğer hasarı (DILI) ilaç yetmezliğinin önemli bir nedenidir. Bir karaciğer mikrofizyolojik sistemi (MPS) kullanarak bir bileşiğin DILI sorumluluğunu doğru bir şekilde tahmin etmek için bir protokol geliştirilmiştir. Karaciğer modeli, tedaviye hücresel yanıtları değerlendirmek için primer hepatik hücrelerin kokültürüne ve translasyonel olarak ilgili son noktalara sahiptir.

İlaca Bağlı Karaciğer Toksisitesini In Vitro Olarak Değerlendirmek için İnsan Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Keşfedin, nanomalzeme maruziyetinin genotoksisite etkilerini değerlendirmek için 3D Hep G2 sferoid modelini kullanarak uzun süreli in vitro test yöntemlerini. Bu yöntem hayvan deneylerine olan bağımlılığı azaltır.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Daha fazla video keşfet