Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Bu Hep G2 modeli, hayvanlarda test ihtiyacını en aza indirmek amacıyla nanomalzemeye uzun süre maruz kaldıktan sonra sabit DNA hasarının potansiyel indüksiyonunu daha güvenilir bir şekilde değerlendirmek için ilgili bir alternatif in vitro test sistemi sağlar. Hep G2 küresel modeli, 14 günlük bir süre boyunca canlı ve işlevsel kalmanın yanı sıra uygun bir proliferasyon seviyesini sürdürme yeteneğine sahiptir. Bu, mikronükleus testi de dahil olmak üzere bir dizi biyokimyasal ve genotoksisite uç noktasının test edilmesini destekler.

Bu protokolü denemeden önce, önce birkaç alıştırma yapmanızı öneririm. Hücre tohumlarken veya ortamı değiştirirken dikkatli olun, çünkü bunlar hassas bir yaklaşım gerektirir. 96 oyuklu bir kültür plakasının kuyucuklarına 100 mikrolitre steril oda sıcaklığında PBS ekleyerek başlayın.

Plakanın kapağını ters çevirin ve 20 mikrolitrelik hücre süspansiyonu damlasını kapağın her bir kuyu oluğunun ortasına dikkatlice pipetleyin. Yerleştirmenin doğruluğunu sağlamak için her seferinde iki ila dört damla ekleyen çok kanallı bir pipet kullanın. Bir seferde sadece dört steroid tohumlayın ve başlamadan önce pipet uçlarının hepsinin hizalandığından emin olun.

Çoklu kanalı tuttuğunuz açı, sferoidlerin oluşturulma biçiminde bir fark yaratacaktır. Damlaların kapaktaki kuyucukların olukları içinde ortalandığından emin olun, ardından kapağı plakanın üstüne yavaşça çevirin, böylece damlalar PBS ile kuyucukların üzerine asılır. Agaroz üzerine küresel transferden önce plakayı üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve kapağı plakadan dikkatlice kaldırın, PBS'yi atın, kalan sıvıyı çıkarmak için plakaya hafifçe vurun ve plakaların iki ila üç dakika kurumasını bekleyin. Agarozu erittikten sonra, kabarcıkları çıkarmak için hafifçe döndürün ve her bir oyuğun tabanına 50 mikrolitre ekleyin. Plakayı iki dakika oda sıcaklığında bırakın, ardından her bir oyuktaki katı agaroz tabakasının üzerine 100 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin.

Bu küresel damlacıkların bulunduğu kapağı, sferoidler tekrar asılı kalacak şekilde plakanın üzerine geri yerleştirin, ardından sferoidleri plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarmak için plakayı 200 kez G'de üç dakika santrifüjleyin. Kürelerin yerleşmesine izin vermek için plakayı 24 saat daha inkübe edin. Tasarlanmış nanomalzemelerin veya ENM'lerin dağılmasını takiben, bunları önceden ısıtılmış DMEM ile istenen nihai konsantrasyona seyreltin.

Sferoidlerle her oyuktan 50 mikrolitre besiyeri aspire edin ve bunu ENM'li 50 mikrolitre besiyeri ile değiştirin. Sferoidleri hasat etmek için, agaroz ile temastan kaçınmaya dikkat ederek, 100 mikrolitre hücre kültürü ortamını her bir oyuktan küresel doku ile aspire etmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Sferoidleri steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.

Küresel süspansiyonu beş dakika boyunca 230 kez G'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın ve daha fazla analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Sferoid peletini bir mililitre steril, oda sıcaklığında PBS'de yıkayın, ardından üç dakika boyunca 230 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Sferoidleri 500 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte altı ila sekiz dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, tripsinezlenmiş Hep G2 hücrelerini, bir mililitre DMEM ile nötralize etmeden önce tamamen ayrışmak ve yeniden süspanse etmek için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 230 kez G'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir küvet hunisi kurulumu oluşturmak için, hazırlanan mikroskop lamını metal desteğe yerleştirin, sürgünün üstüne bir filtre kartı yerleştirin, ardından küvet hunisini üstüne sabitleyin.

Küvet hunilerini, huni yukarı bakacak şekilde sitosantrifüjde düzenleyin, böylece her birine doğrudan 100 mikrolitre hücre süspansiyonu eklenebilir. Ardından slaytları el yazması talimatlara göre sabitlemeye devam edin. Fosfataz tamponunda seyreltilmiş% 20'lik bir Giemsa boyama çözeltisi hazırlayın.

Çözeltiyi karıştırmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından bir huni içinde katlanmış filtre kağıdı ile filtreleyin. Her slayttaki cytodot'a üç ila beş damla filtrelenmiş Giemsa solüsyonu eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın ve oda sıcaklığında sekiz ila 10 dakika bekletin. Slaytları art arda iki fosfataz tampon yıkamada yıkayın.

Ardından, fazla lekeyi çıkarmak için soğuk su altında kısa bir süre durulayın ve kurumaya bırakın. Herhangi bir in vitro toksikolojik değerlendirmeden önce, 3D HepG2 sferoidlerinin düzgün bir şekilde oluşup oluşmadığını kontrol etmek önemlidir. Tohumlamadan dört gün sonra, pürüzsüz bir yüzeye sahip ve görsel çıkıntı olmayan kompakt küresel şekilli sferoidler oluşmamalıdır.

Tohumlamadan dört gün sonra iyi kaliteli ve düşük kaliteli sferoidler burada gösterilir. Tipik olarak, plaka başına oluşturulan sferoidlerin %90 ila 95'i doğru şekilde şekillenecek ve daha fazla deney için uygun olacaktır. Karaciğer sferoid modelinin uzun ömürlülüğünü belirlemek ve uzun vadeli ENM veya kimyasal bazlı tehlike değerlendirmesini destekleyip destekleyemeyeceğini belirlemek için canlılık ve karaciğer benzeri işlevsellik 14 günlük bir kültür periyodu boyunca değerlendirildi.

Albümin konsantrasyonu kültür periyodu boyunca tutarlı kalırken, sferoid başına üre üretimi 14. günde düşmeye başlamadan önce artmıştır. Genotoksisite değerlendirmesi için, akut ve uzun süreli ENM maruziyetlerini takiben mikronükleusların varlığını belirlemek için mikronükleus testi kullanıldı. Sferoidler, titanyum dioksit ve gümüş olmak üzere iki ENM'ye maruz bırakıldı.

Her iki ENM'ye akut maruziyetten sonra genotoksisite için benzer bir eğilim gözlenmiştir, ancak yüksek genotoksisite tepkisi uzun süreli, beş günlük bir maruziyetten sonra belirgin değildi. Bu yöntemi takiben, hem süpernatan hem de sferoidler çok sayıda biyokimyasal uç nokta için hasat edilebilir. Bunlar arasında hücre canlılığı, karaciğer fonksiyon deneyleri, SID 450 analizi, zayıf inflamatuar belirteçler ve gen ekspresyonu bulunur.

Bu teknik şu anda hem kimyasalların hem de nanomalzemelerin rutin jeotoksisite testine uygulamak isteyen bir dizi sözleşmeli araştırma laboratuvarında test edilmektedir. Bu, in vivo test yaklaşımlarına olan bağımlılığı azaltma potansiyeline sahiptir.