Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Bu protokol iki önemli hususu, esansiyel bir integral membranın karakterizasyonunu, bakterilerin apolipoprotein asiltransferazını ve enzimin inhibitörlerini taramak için testin HDS formatında geliştirilmesini ele alır. Yöntem çok hassastır ve tarama amaçlarına uygundur. Potansiyel yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Bu video, homojen olmayan lipit ve deterjan içeren süspansiyonlarla çalışırken karıştırma, girdaplama, sonikasyon gibi bu protokolün kritik adımlarını vurgulamaya yardımcı olacaktır. Prosedürü gösteren Karine Nozeret, Aurelia Pernin olacak, ikisi de grubumdaki arkadaşlar. Apolipoprotein ve asiltransferaz veya LNT testi için reaktif karışımını hazırlayarak başlayın.

Alkin POPE ve FSL-1-biotin'i LNT reaksiyon tamponu ile 1.5 mililitrelik tüplerde 18 mikrolitrelik bir son hacimde karıştırın. Test edilen tüm koşullar için üçlü reaktif karışımları hazırlayın. Reaktif karışımlarını ultrasonik bir su banyosunda üç dakika boyunca sonikasyon yapın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, mikrolitre başına bir nanogramlık nihai konsantrasyona aktif veya aktif olmayan LNT ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Reaksiyonu, ısıtılmış kapaklı bir termal karıştırıcıda 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, mililitre streptavidin başına iki miligramlık bir stok çözeltisi hazırlayın.

Ve çalışan bir çözelti oluşturmak için mililitre başına 10 mikrograma kadar seyreltin. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre çözelti ekleyin. Daha sonra, plakayı kapaksız olarak 37 santigrat derecede inkübe ederek kuyuları gece boyunca havayla kurutun.

Ertesi gün, beş milimolar Azido-FAM, 50 milimolar TCEP, iki milimolar TBTA ve 50 milimolar bakır sülfat pentahidrat stok çözeltileri hazırlayın. 1,5 mililitrelik LNT reaksiyon tüplerine 0,2 mikrolitre stok Azido-FAM, 0,4 mikrolitre stok TCEP ve 0,2 mikrolitre stok TBTA ekleyerek tıklama kimyası gerçekleştirin. Çözeltiyi beş saniye boyunca girdaplayın.

Ardından 0,4 mikrolitre stok bakır sülfat ekleyin. Beş saniye daha girdap yapın ve reaksiyonu karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Tıklama kimyası karışımı inkübe edilirken, streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını 200 mikrolitre PBST1 ile üç kez yıkayın.

Tıklama kimyası karışımının 18 mikrolitresini streptavidin kaplı bir kuyuya aktarın ve N-asil-FSL-1-biotin FAM ürününü plakaya bağlamak için 100 mikrolitre PBST1 ekleyin. Streptavidin bağlanması ve floresan okuması için pozitif bir kontrol olarak plakaya biyotin floresein ekleyin. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında karanlıkta bir saat boyunca 300 RPM'de çalkalayarak inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, plakayı 200 mikrolitre PBST2 ile altı kez manuel olarak yıkamak için çok kanallı bir elektronik pipet kullanın. Pipetle üç kez yıkayın. 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve üç kez daha yıkayın.

Her oyuğa 200 mikrolitre PBS ekleyin ve bir mikroplaka okuyucuda 520 nanometrede floresanı tespit edin. Tüm sonuçları bir elektronik tabloya kaydedin, ardından her reaksiyon için standart sapmanın yanı sıra eşleşmemiş bir T testi ile negatif kontroller ve pozitif numuneler için P değerlerini hesaplayın. Burada açıklanan in vitro LNT testi, alkin FSL-1-biotin oluşturmak için substrat olarak bir alkin yağ asidi ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipidleri kullanır.

Azido-FAM ile bir tıklama kimyası reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenir ve floresan spektrometrisi ile tespit edilebilir hale gelir. Reaksiyon koşulları, 520 nanometrede maksimum floresan okuması için optimize edildi. Negatif kontroller, enzimsiz, enzimin aktif olmayan bir varyantı veya tiyol spesifik inhibitörü MTSES ile reaksiyonları içeriyordu.

Biyotin floresein, maksimum floresan sinyali için dahili bir kontrol olarak kullanıldı. Yüksek verimli bir tarama testi geliştirmek için, reaksiyonlar doğrudan 384 kuyulu plakada gerçekleştirildi. Yıkama adımları otomatikleştirildi ve reaktif miktarı azaltıldı.

Reaksiyon hassastı ve negatif kontrol ile aktif enzim arasında floresan sinyalinde önemli bir fark ile tekrarlanabilirdi. Yüksek verimli tarama için, Z asal faktörü, bir testteki bir yanıtın tarama amaçları için yeterince büyük olup olmadığını belirler. 384 kuyucuklu bir formatta gerçekleştirilen LNT testi için ortalama Z asal faktörü 0,6'dan büyüktü ve bu da olağanüstü olduğunu düşündürdü.

Bu videodaki tüp testi, HDS ile uyumlu çok plakalı bir formatta geliştirilmiştir. Çeşitli organizmalardan diğer asiltransferazları incelemek için kullanılabilir.