Name: Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Keşfedin apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini yüksek verimli tarama için tasarlanmış hassas bir floresans analiziyle. Bu yöntem, yeni antibiyotik geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kemogenomik ve Biyolojik Tarama Platformu'ndan Fabrice Agou ve Alix Boucharlat'a, Institut Pasteur Paris'teki Teknolojik Kaynaklar ve Araştırma Merkezi'ne (C2RT) protokol hakkında yararlı öneriler için, BGPB Birimi'nin tüm üyelerine destek ve bilimsel tartışmalar için ve Simon Legood'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma, Carnot Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Carnot Mikropları ve Sağlığı Enstitüsü'nün Küresel Bakım Girişimleri (15 CARN 0017-01 ve 16 CARN 0023-01) tarafından finanse edilmiştir.

1. Enzim ve substrat hazırlama
<ol><li>Enzimin saflaştırılması
	<ol><li>Lnt enzimini daha önce tarif edildiği gibi deterjanda çözünür membranlardan üretin ve saflaştırın 4,8. Kısaca, Lnt-strep geninin ekspresyonunu indükleyin, Lnt'yi bir C-terminal Strep etiketi ile kodlayın, OD600'de 0.6'da 16 saat boyunca 37 ° C'de susuz tetrasiklin (200 ng / mL) ile.</li>
		<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini tampon WA'da (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) mL başına 100 OD600 birime kadar yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücreleri, 10.000 psi'de bir Fransız basınçlı hücre presinden iki geçitle kırın.</li>
		<li>Kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 20 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin. Süpernatantı saklayın ve peleti atın.</li>
		<li>Süpernatantı 60 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj yapın ve membran veziküllerini (yarı saydam kahverengi renkli pelet) toplayın. Süper natantı atın.</li>
		<li>Membran peletinden integral membran proteinlerini, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca tampon WA'da% 1 (w/v) n-Dodesil β-D-maltosid (DDM) ile çözündürün. Çözünmeyen malzemeyi 120.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın ve çıkarın. Saflaştırma için süpernatant fraksiyonu kullanın.</li>
		<li>Lnt-strep'i Nozeret ve ark.8 tarafından açıklandığı gibi bir afinite kromatografisi sütununda (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir S400 jel filtrasyon sütununda (bkz.</li>
		<li>Saflaştırılmış enzimi, -80 °C'de% 0.05 DDM ve% 10 gliserol içeren tampon WA'da saklayın. NOT: Enzim 5 yıldan fazla bir süredir stabildir.</li>
	</ol></li>
	<li>Alkin-fosfolipid ve biyotinile Fibroblast Uyarıcı Ligand (FSL-1-biotin) substratlarının hazırlanması
	<ol><li>Aliquot 100 μL özel sentezlenmiş alkin-POPE (1-hekzade-15-ynoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, bakınız Malzeme Tablosu) kloroformda 1.5 mL tüplere çözünür.</li>
		<li>Tüpleri bir şırınga ile delin ve kloroformu RT'de 2 saat boyunca bir hız boşluğunda buharlaştırın. Kuru fosfolipit örneklerini -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Kullanmadan önce alkin-PAPE'yi 500 μM'de% 0.1 Triton X-100'de çözün. Gerekirse alkin-POPE'yi çözündürmek için RT'de ultrasonik su banyosuna 3 dakikalık bir sonikasyon adımı ekleyin.</li>
		<li>FSL-1-biyotin'i suda 445 μM'de yeniden askıya alın. NOT: Her iki çözelti de -20 °C'de en az 2 ay saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tüp testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 1,5 mL tüplerde ayarlayın (adım 2.1) ve 96 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 2.2).
<ol><li>Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
	<ol><li>Standart bir Lnt testi için, 1,5 mL tüplerde 18 μL'lik son hacimde alkin-POPE (500 μM stoktan son 50 μM) ve FSL-1-biyotin (445 μM stoktan 50 μM nihai konsantrasyon) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %1 BSA içeren %0.1 Triton X-100) karıştırın. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Substrat karışımını (adım 2.1.1'de hazırlanan) ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin ve Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 2.1.3). NOT: MTSES (sodyum (2-sülfonatoetil)metanetiosülfonat), tiol-spesifik bir reaktif, Lnt8'i inhibe eder. Negatif kontrol numuneleri olarak kullanılmak üzere reaksiyon tüplerine (adım 2.1.1) 10 mM MTSES (% 100 DMSO'da 100 mM stok çözeltisi) ekleyin. Lnt reaksiyon tamponunun ses seviyesini toplam hacim 18 μL olacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Aktif (1 ng/μL, 17,2 nM'ye karşılık gelir) veya inaktif Lnt (C387S) (%0,05 DDM içeren tampon WA'da 10 ng/μL'lik 2 μL) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle indirerek substratlarla (adım 2.1.2) karıştırın.</li>
		<li>Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>96 kuyu plakasının Streptavidin kaplaması
	<ol><li>H2O'da 2 mg / mL'de bir streptavidin stok çözeltisi hazırlayın. NOT: Bu çözelti -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.</li>
		<li>Stok çözeltisinden, çalışma çözeltisi olarak suda 10 μg / mL streptavidin hazırlayın. 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna 100 μL çözelti ekleyin. Kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 °C'de inkübe ederek streptavidin'i plakaya bağlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 2.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 2.4) ve floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 2.5).
<ol start="3"><li>Klik-kimya reaksiyonu
	<ol><li>Azido-FAM (DMSO'da 5 mM), TCEP (Tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; suda hazırlanan 50 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 2 mM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H2O (H2O'da taze hazırlanmış 50 mM) stok çözeltileri hazırlayın.</li>
		<li>Adım 2.1.4'te hazırlanan Lnt reaksiyon karışımını içeren 1,5 mL'lik tüplerde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyerek klik-kimyası gerçekleştirin: 0,2 μL stok Azido-FAM (nihai konsantrasyon 50 μM), 0,4 μL stok TCEP (nihai konsantrasyon 1 mM), 0,2 μL stok TBTA (nihai konsantrasyon 0,02 mM).</li>
		<li>Vorteks 5 s için çözüm. Daha sonra 0,4 μL stok CuSO4 (son konsantrasyon 1 mM) ekleyin. 5 s için tekrar vorteks. Örnekleri karanlıkta RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı plakalara bağlanması
	<ol><li>Streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını, 2.2.2 3x adımından bir gecede inkübasyondan sonra 200 μL PBS-T1 (% 0.05 Ara-20 içeren PBS) ile yıkayın. NOT: Streptavidin plakalar hemen kullanılabilir veya 4 °C'de kuru olarak saklanabilir.</li>
		<li>Klik-kimya karışımından 18 μL'yi adım 2.3.3'ten 96 kuyu streptavidin kaplı bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve N-açil-FSL-1-biyotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için 100 μL PBS-T1 ekleyin.</li>
		<li>Streptavidin bağlama ve floresan okuması için pozitif kontrol olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3.1 m'lik bir stoktan 0.26 μM) kullanın.</li>
		<li>RT'deki plakaları karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin, 300 rpm'de sallayın.</li>
		<li>96 kuyucuk plakasının manuel yıkama adımlarını çok kanallı elektronik pipetle aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 200 μL PBS-T2 ile altı yıkama (%1 Ara-20 içeren PBS), pipetle üç yıkama, 200 μL PBS ile üç yıkama, pipetle üç yıkama.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan algılama ve analizi
	<ol><li>200 μL PBS ekleyin ve floresanı bir floresan mikroplaka okuyucusuna 520 nm'de kaydedin. Sonuçları e-tablo yazılımına kaydedin. NOT: Biotin-floresein, streptavidin bağlama ve 520 nm'de floresan tespiti için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. 0.26 μM biyotin-floresein ile 30.000-40.000 A.U.'nun tekrarlanabilir bir okuması beklenmektedir. Tüm numuneler, kontroller de dahil olmak üzere üçlü olarak analiz edilir.</li>
		<li>İstatistiksel bir yazılım kullanarak eşleşmemiş t-testini kullanarak her reaksiyon için standart sapmayı ve negatif kontroller ve pozitif numuneler için P-değerlerini hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Çok kuyulu plaka testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 384 kuyu plakasında (adım 3.1) ayarlayın ve 384 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 3.2).
<ol><li>Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon NOT: Reaktiflerin ve enzimin miktarı, tüp testine kıyasla azaltılır ve Lnt reaksiyonu doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirilir. Bu, daha az malzeme kullanılmasına ve daha da otomatikleştirilebilecek adımların azaltılmasına izin verir.<ol><li>Substratları aşağıdaki gibi karıştırın: alkin-POPE (500 μM stoktan son konsantrasyon 50 μM) ve FSL-1-biyotin (500 μM stoktan son 50 μM) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl,% 1 BSA içeren% 0.1 Triton X-100) 384 kuyu plakası formatında kuyu başına reaksiyon başına 13.5 μL hacimde. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin. Gerçekleştirilecek reaksiyon sayısı için gereken toplam reaktif miktarını hesaplayın (yani, bir 384 kuyu plakası için 5.184 μL).</li>
		<li>Substrat karışımını ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin.</li>
		<li>384 kuyucuklu bir plakada kuyu başına substrat karışımının Aliquot 13.5 μL'si. NOT: Negatif kontrol olarak, kuyu başına 10 mM MTSES (%100 DMSO'da 625 mM stok çözeltisi) eklenebilir. 13,5 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için Lnt tamponunun ses seviyesini (adım 3.1.1) ayarlayın.</li>
		<li>Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 3.1.5).</li>
		<li>3.1.3. adımdan itibaren reaksiyon karışımını içeren her bir kuyucuğa Lnt reaksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %0.1 Triton X-100, %1 BSA) 0,5 ng/μL (8,6 nM'ye karşılık gelen) aktif Lnt enzimi veya inaktif varyant (C387S) (% 0,05 DDM içeren tampon WA'daki 5 ng/μL stoktan 1,5 μL) ekleyin. Reaktifleri yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın. Toplam reaksiyon hacmi 15 μL'dir.</li>
		<li>Çok kuyulu plakalar için plakayı plastik folyo ile kapatın.</li>
		<li>Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin kaplama 384 kuyu plakaları<ol><li>384 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için 2.2.2 adımından itibaren 75 μL streptavidin (H 2 O'da 10 μg / mL) kullanın. Streptavidin, kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek plakaya bağlanmasına izin verin.</li>
	</ol></li>
</ol>NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 3.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 3.4), floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 3.5).
<ol start="3"><li>Klik-kimya reaksiyonu<ol><li>Azido-FAM (DMSO'da 1.2 mM), TCEP (tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; H 2 O'da hazırlanan 24 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 0.48 mMM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H 2 O(H2O'da taze hazırlanmış24mM) stok çözeltilerini hazırlayın.</li>
		<li>Üç klik-kimya reaktifini birleştirin: Azido-FAM (son konsantrasyon 50 μM), TCEP (1 mM final) ve TBTA (0.02 mM final) karışımı, her biri kuyucuk başına 2.25 μL'lik son hacimde 0.75 μL'de. 384 kuyu plakası başına gerekli hacmi hesaplayın (yani, 384 kuyu plakasının tüm kuyuları kullanıldığında 864 μL kullanın). Kuvvetlice karıştırın.</li>
		<li>3.1.7 adımından itibaren 384 kuyu plakasındaki tamamlanmış Lnt reaksiyonuna kuyu başına 2,25 μL reaktif çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.</li>
		<li>CuSO4 (1 mM nihai konsantrasyon için 24 mM stoktan 0,75 μL) ekleyin ve çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.</li>
		<li>RT'de karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı 384 kuyu plakalarına bağlanması
	<ol><li>Streptavidin kaplı plakaların kuyularını, 3.2.1 1x adımından 85 μL PBS-T1 ile gece boyunca inkübasyondan sonra yıkayın.</li>
		<li>N-asil-FSL-1-biotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için inkübasyon plakasının her bir kuyucuğundan 3.3.6 adımından streptavidin kaplı plakaya adım 3.4.1'den 11 μL klip-kimya reaksiyonunun 11 μL'sini aktarın.</li>
		<li>64 μL PBS-T1 arabellek ekleyin.</li>
		<li>Streptavidin kaplı kuyucuklara bağlanma kontrolü olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3,1 m'lik bir stoktan 0,19 μM) ekleyin.</li>
		<li>RT'deki 384 kuyu plakasını karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde 300 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.</li>
		<li>Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak plakaları aşağıdaki gibi yıkayın: 85 μL PBS-T2 ile 10 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır; 85 μL PBS ile 5 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan algılama ve analizi
	<ol><li>PBS (85 μL) ekleyin ve floresan mikroplaka okuyucusuna 535 nm'de floresan kaydedin.</li>
		<li>Verileri açıklandığı gibi analiz edin (adım 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li>
<li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li>
<li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li>
<li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li>
<li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147(2017).</li>
<li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+%28Lnt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978(2019).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecules+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198(2016).</li>
<li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li>
<li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952(2017).</li>
<li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Triasillenmiş ürünün floresan tespitine dayanan burada açıklanan Lnt testi protokolü hassas ve tekrarlanabilirdir. Biotin'in streptavidin'e spesifik ve verimli bağlanması, tahlilde kilit bir unsurdur. Lnt reaksiyonunun tamamlanmasından sonra bırakılan alkin-POPE substratı da FAM ile floresan olarak etiketlenir, ancak streptavidin plakalarına çoklu yıkama adımlarıyla bağlandıktan sonra verimli bir şekilde çıkarılır. Ayrıca, DMSO'nun eklenmesi Lnt aktivitesini etkilemez ve tahlil üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Hem substrat...

Bakteriyel lipoproteinler, amino terminlerinde kovalent olarak bağlanmış yağ asitleri ile karakterize edilir ve bu asitler 1,2 membranlarına sabitlenir. Proteinin olgun kısmı yapı ve işlev bakımından oldukça çeşitlidir, böylece lipoproteinlerin bakteriyel hücre zarfındaki çeşitli biyolojik süreçlerdeki rolünü açıklar.
Lipoproteinler, sitoplazmik membrana yerleştirildikten sonra fosfolipid kaynaklı yağ asitleri tarafından modifiye edilir. Prolipoproteinler, asillenmiş hale gelen değişmez bir sistein kalıntısı ve olgun proteindeki ilk amino asit içeren bir imza motifi olan lipobox içerir. Bu yolun ilk adımı, diasilgliseril grubunu fosfatidilgliserolden prolipoproteine diyasilgliseril ve sistein arasındaki bir tiyoeter bağlantısı yoluyla prolipoproteine aktaran prolipoprotein fosfatidilgliserol::d iasilgliseril transferaz (Lgt) tarafından katalize edilir. Sinyal peptidaz II (Lsp), sinyal peptidini diasilgliseril prolipoproteinden ayırır ve diasilgliserl moiety yoluyla membrana demirlenen bir apolipoprotein ile sonuçlanır. Üçüncü ve son adım, fosfolipitin sn-1 pozisyonundan apolipoprotein üzerine bir yağ asidi ekleyen ve triasile olgun lipoprotein ile sonuçlanan apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir (Şekil 1)3. Lnt reaksiyonu, kararlı bir tiyoester açil enzim ara ürününün oluştuğu iki aşamalı bir pinpon reaksiyonudur. Lizofosfolipid yan ürünü, reaksiyonun ikinci adımında apolipoprotein substratının asilasyonundan önce salınır.
Fosfolipid substrat özgüllüğü, yüksek oranda Tris-Trisin Üre SDS-PAGE4 üzerinde N-açil diasilgliseril peptidin hareketlilik kaymasına dayanan bir Lnt testinde belirlenir. Küçük polar kafa gruplarına sahip, doymuş [sn-1] ve doymamış [sn-2] fosfolipitler tercih edilen substratlar4'tür. Jel kayma testi, apolipoprotein N-asiltransferazın kapsamlı kinetik çalışmaları veya HTS'nin inhibitör molekülleri tanımlaması için uygun değildir. Alkinli yağ asitlerini kullanan tıklama kimyası, bakteri5'te lipoprotein modifikasyonunu ve ökaryotlarda yağ asidi metabolizmasını incelemek için başarıyla kullanılmıştır6. Son zamanlarda, inhibitörleri7 tanımlamak için Ras palmitoylasyonunun in vitro bir testinin bildirildiği bildirilmiştir.
Burada açıklanan yöntemde, deterjandaki saflaştırılmış aktif Lnt, daha sonra floresan spektrometrisi ile tespit edilen alkin-triasile peptid oluşturmak için karışık misellerdeki substratlarla inkübe edilir.

<table><tbody><tr><td>&Auml; kta Arıtıcı FPLC sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Saflık: NA Lnt arıtma</td></tr><tr><td>alkin-POPE</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>900414P</td><td>Saflık: >99% Lnt substrat</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Saflık: % 100 (saf) Reaktifi tıklayın</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Saflık: NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Plaka yıkayıcı</td><td>seçin BioTek</td><td>N&deg; serie 115800, n&deg; malzeme 405 Saflık Seçin</td><td>: NA Yıkama adımları</td></tr><tr><td>biotin-floresein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Saflık: &ge; % 90 Floresan kontrolü</td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat pentahidrat</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Saflık: &ge; %98 Tıklama reaktifi</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Saflık: &ge; %99 &beta;+&alfa;; < %15 &alfa; Lnt saflaştırma için deterjan</td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Saflık: susuz Solbilizasyon Tıklama reaktifi</td></tr><tr><td>Elektronik pipet Voyager 8 kanal 0,5-12,5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Saflık: NA Reaktiflerin taşınması</td></tr><tr><td>Fransız Basınç Hücresi</td><td>N/A</td><td>N/A Saflık</td><td>: NA Hücre bozulması</td></tr><tr><td>FSL-1-biotin</td><td>EMC mikro koleksiyonları</td><td>L7030</td><td>Saflık: NA Lnt substrat</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384 kuyulu standart CELLSTAR polistiren mikroplaka</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Saflık: NA Şeffaf alt ile siyah (yukarı veya alt okuma)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96 kuyulu steril polistiren plaka, yüksek bağlayıcılık</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Saflık: NA Şeffaf alt kısımlı siyah (yukarı veya alt okuma)</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu Sonsuz M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Saflık: NA Floresan algılama</td></tr><tr><td>MTSES (sodyum (2-sülfonaetil)metanetiosülfonat)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Saflık: ~% 100 Tiyol spesifik inhibitör</td></tr><tr><td>Optik Olarak Şeffaf Yapışkan Conta Levhaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Saflık: NA Çok kuyulu plakayı kapatmak için folyo</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 jel filtrasyon kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Saflık: NA Lnt saflaştırma</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %IBA</td> <td>Biyoteknoloji</td><td>2-1201-010</td><td>Saflık: NA Lnt arıtma</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Saflık: &ge; 13 birim / mg protein Biyotin bağlayıcı</td></tr><tr><td>TBTA (tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil] amin</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Saflık: %97 Tıklama reaktifi</td></tr><tr><td>TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Saflık: &ge; %98 Tıklama reaktifi</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Saflık: NA Floresan algılama</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Saflık: NA Floresan algılama</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Saflık: NA Isıtmalı kapak</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Saflık: H2O içinde %10 Lnt reaksiyon tamponu</td></tr><tr><td>Ultra santrifüj</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Saflık: NA Hücre fraksiyonasyonu</td></tr></tbody></table>

enzim karakterizasyonundan yüksek verimli taramaya kadar apolipoprotein n-asiltransferaz için click-kimya tabanlı florometrik analiz

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Proteobakterilerden lipoproteinler, üç integral membran enziminin etkisiyle membran fosfolipitlerinden türetilen yağ asitleri tarafından posttranslasyonel olarak modifiye edilir ve triasile proteinlerle sonuçlanır. Lipoprotein modifikasyon yolundaki ilk adım, bir diasilgliseril grubunun fosfatidilgliserolden prolipoproteine transferini içerir ve bu da diasilgliseril prolipoprotein ile sonuçlanır. İkinci adımda, prolipoproteinin sinyal peptidi bölünür ve bir fosfolipitten türetilen üçüncü bir yağ asidi tarafından modifiye edilen bir apolipoprotein oluşturulur. Bu son adım apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir. Lipoprotein modifikasyon yolu, çoğu γ-proteobakteride esastır ve bu da onu yeni antibakteriyel ajanların gelişimi için potansiyel bir hedef haline getirir. Burada açıklanan, küçük inhibitör moleküllerin yüksek verimli taraması ile uyumlu olan Lnt için hassas bir testtir. Enzim ve substratlar membrana gömülü moleküllerdir; bu nedenle, in vitro bir testin geliştirilmesi kolay değildir. Bu, aktif enzimin deterjan varlığında saflaştırılmasını, alkin-fosfolipitlerin ve diasilgliseril peptid substratlarının mevcudiyetini ve karışık misellerdeki reaksiyon koşullarını içerir. Ayrıca, aktivite testini yüksek verimli bir tarama (HTS) kurulumunda kullanmak için, reaksiyon ürününün doğrudan okunması, birleştirilmiş enzimatik reaksiyonlara göre tercih edilir. Bu florometrik enzim testinde, alkin-triasile peptid ürünü, bir tıklama-kimya reaksiyonu yoluyla floresan haline getirilir ve çok kuyulu bir plaka formatında tespit edilir. Bu yöntem, fosfolipitler ve açil-CoA dahil olmak üzere yağ asidi içeren substratlar kullanan diğer asiltransferazlar için geçerlidir.

Lnt reaksiyonunda, fosfolipitlerden gelen sn-1 yağ asidi bir diasilgliseril peptid üzerine aktarılır ve olgun triasile peptid8 ile sonuçlanır. Burada tarif edilen in vitro Lnt testi, substrat olarak bir alkin yağ asidi (alkin-POPE) ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipitleri kullanmak üzere tasarlanmıştır ve bu da alkin-FSL-1-biyotin oluşumuna neden olur. Azido-FAM ile bir tıklama-kimya reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenmeli ve floresan spektrometri ile tespit edilmelidir (<...

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Bu protokol iki önemli hususu, esansiyel bir integral membranın karakterizasyonunu, bakterilerin apolipoprotein asiltransferazını ve enzimin inhibitörlerini taramak için testin HDS formatında geliştirilmesini ele alır. Yöntem çok hassastır ve tarama amaçlarına uygundur. Potansiyel yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.Bu video, homojen olmayan lipit ve deterjan içeren süspansiyonlarla çalışırken karıştırma, girdaplama, sonikasyon gibi bu protokolün kritik adımlarını vurgulamaya yardımcı olacaktır. Prosedürü gösteren Karine Nozeret, Aurelia Pernin olacak, ikisi de grubumdaki arkadaşlar. Apolipoprotein ve asiltransferaz veya LNT testi için reaktif karışımını hazırlayarak başlayın.Alkin POPE ve FSL-1-biotin'i LNT reaksiyon tamponu ile 1.5 mililitrelik tüplerde 18 mikrolitrelik bir son hacimde karıştırın. Test edilen tüm koşullar için üçlü reaktif karışımları hazırlayın. Reaktif karışımlarını ultrasonik bir su banyosunda üç dakika boyunca sonikasyon yapın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ardından, mikrolitre başına bir nanogramlık nihai konsantrasyona aktif veya aktif olmayan LNT ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Reaksiyonu, ısıtılmış kapaklı bir termal karıştırıcıda 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, mililitre streptavidin başına iki miligramlık bir stok çözeltisi hazırlayın.Ve çalışan bir çözelti oluşturmak için mililitre başına 10 mikrograma kadar seyreltin. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre çözelti ekleyin. Daha sonra, plakayı kapaksız olarak 37 santigrat derecede inkübe ederek kuyuları gece boyunca havayla kurutun.Ertesi gün, beş milimolar Azido-FAM, 50 milimolar TCEP, iki milimolar TBTA ve 50 milimolar bakır sülfat pentahidrat stok çözeltileri hazırlayın. 1,5 mililitrelik LNT reaksiyon tüplerine 0,2 mikrolitre stok Azido-FAM, 0,4 mikrolitre stok TCEP ve 0,2 mikrolitre stok TBTA ekleyerek tıklama kimyası gerçekleştirin. Çözeltiyi beş saniye boyunca girdaplayın.Ardından 0,4 mikrolitre stok bakır sülfat ekleyin. Beş saniye daha girdap yapın ve reaksiyonu karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Tıklama kimyası karışımı inkübe edilirken, streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını 200 mikrolitre PBST1 ile üç kez yıkayın.Tıklama kimyası karışımının 18 mikrolitresini streptavidin kaplı bir kuyuya aktarın ve N-asil-FSL-1-biotin FAM ürününü plakaya bağlamak için 100 mikrolitre PBST1 ekleyin. Streptavidin bağlanması ve floresan okuması için pozitif bir kontrol olarak plakaya biyotin floresein ekleyin. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında karanlıkta bir saat boyunca 300 RPM'de çalkalayarak inkübe edin.İnkübasyondan sonra, plakayı 200 mikrolitre PBST2 ile altı kez manuel olarak yıkamak için çok kanallı bir elektronik pipet kullanın. Pipetle üç kez yıkayın. 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve üç kez daha yıkayın.Her oyuğa 200 mikrolitre PBS ekleyin ve bir mikroplaka okuyucuda 520 nanometrede floresanı tespit edin. Tüm sonuçları bir elektronik tabloya kaydedin, ardından her reaksiyon için standart sapmanın yanı sıra eşleşmemiş bir T testi ile negatif kontroller ve pozitif numuneler için P değerlerini hesaplayın. Burada açıklanan in vitro LNT testi, alkin FSL-1-biotin oluşturmak için substrat olarak bir alkin yağ asidi ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipidleri kullanır.Azido-FAM ile bir tıklama kimyası reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenir ve floresan spektrometrisi ile tespit edilebilir hale gelir. Reaksiyon koşulları, 520 nanometrede maksimum floresan okuması için optimize edildi. Negatif kontroller, enzimsiz, enzimin aktif olmayan bir varyantı veya tiyol spesifik inhibitörü MTSES ile reaksiyonları içeriyordu.Biyotin floresein, maksimum floresan sinyali için dahili bir kontrol olarak kullanıldı. Yüksek verimli bir tarama testi geliştirmek için, reaksiyonlar doğrudan 384 kuyulu plakada gerçekleştirildi. Yıkama adımları otomatikleştirildi ve reaktif miktarı azaltıldı.Reaksiyon hassastı ve negatif kontrol ile aktif enzim arasında floresan sinyalinde önemli bir fark ile tekrarlanabilirdi. Yüksek verimli tarama için, Z asal faktörü, bir testteki bir yanıtın tarama amaçları için yeterince büyük olup olmadığını belirler. 384 kuyucuklu bir formatta gerçekleştirilen LNT testi için ortalama Z asal faktörü 0,6'dan büyüktü ve bu da olağanüstü olduğunu düşündürdü.Bu videodaki tüp testi, HDS ile uyumlu çok plakalı bir formatta geliştirilmiştir. Çeşitli organizmalardan diğer asiltransferazları incelemek için kullanılabilir.

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

İlaç yüklü proteini şablon olarak kullanan ultra küçük floresan altın nanokümelerinin (Au NC'ler) yerinde sentezine dayanan küçük moleküler ilaç taraması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, protein şablonlu Au NC'lerden yayılan görünür bir floresan sinyali ile ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemek için basittir.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.

Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Keşfedin apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini yüksek verimli tarama için tasarlanmış hassas bir floresans analiziyle. Bu yöntem, yeni antibiyotik geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz (Video) | JoVE Journal

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Daha fazla video keşfet