Name: Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Keşfedin ticari yumurtalardan mikropsuz piliç üretim yöntemini. Perasetik asit dezenfeksiyonu ve izolatör kullanımıyla Ross PM3 hattında mikrobiyota araştırmaları için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, döllenmiş yumurta temini için yetiştiricilere ve Boyé accouvage topluluğuna (La Boissière en Gâtine, Fransa) minnettardır. Bu çalışma, Fransa'daki Région Centre Val de Loire tarafından finanse edilen APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019) araştırma konsorsiyumunun himayesinde gerçekleştirilmiştir.

Hayvan bakım prosedürleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (86/609/EEC) ve hayvan deneylerine ilişkin Fransız yönetmelikleri tarafından belirlenen kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İzolatör preparatı
<ol><li>Gerekli malzemeleri pozitif basınç altında sert bir izolatöre yerleştirin: 50 mL tüpler, 5, 10 ve 25 mL plastik pipetler, ışınlanmış besleme, otoklavlanmış su ve steril sızdırmaz plastik kaplar.</li>
	<li>Transfer mikrop öldürücü tuzağı% 2'lik bir kuaterner amonyum çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>Metreküp(m3) başına 30 g potasyum permanganata ilave edilen 60 mL formalin (% 24 formaldehit) kullanarak izolatörün formaldehit buharı ile üç kez sterilize edilmesi. Tüm temas yüzeylerinin sterilizasyonunu sağlamak için izolatör içindeki malzemeleri her sterilizasyon arasında hareket ettirin.</li>
	<li>Yumurtaları sokmadan önce izolatör sıcaklığını en az 2 gün boyunca 37 ° C'ye ayarlayın. Higrometreyi, giriş gününde bağıl nemin% 65-70'ine (RH) ayarlayın.</li>
</ol>2. Yumurta toplama ve kuluçka
<ol><li>Yumurtaları, yumurtlayan tavukların iyi bir kuluçka oranına (yumurta üretiminin zirvesinde en az% 80) ve iyi sıhhi durumlarına (yani, yaygın kümes hayvanı patojenlerinin yokluğu ve sürü içinde hastalıkların yokluğu) dayanarak seçilen çiftliklerden toplayın. Koşu bandında görsel olarak temiz ve kusursuz yumurtalar seçin.</li>
	<li>Yumurta yüzeyini, oda sıcaklığında% 1.5'lik bir perasetik asit çözeltisine 5 dakika batırarak derhal dekontamine edin.</li>
	<li>Formaldehit buharı ile dekontamine edilmiş bir kutu kullanarak yumurtaları deney tesisine taşıyın.</li>
	<li>Yumurtaları 4 °C'de 24 saat saklayın. Adım 2.2'de açıklanan dekontaminasyon işlemini tekrarlayın ve 19 gün boyunca kuluçkalık bir inkübatöre (Gün 0) yerleştirin.</li>
</ol>3. Kuluçka
<ol><li>19. Günde, doğurganlığı, canlılığı (hareketliliği) ve embriyo gelişimini, steril koşullar altında hafif bir yumurta mum makinesi kullanarak konserve ederek doğrulayın. Steril kuluçkalık izolatörlere sadece canlı embriyonlanmış yumurtaları sürün.</li>
	<li>Seçilen yumurtaları, 30 s boyunca% 1.5 perasetik asit çözeltisi püskürterek veya her yumurtanın tüm yüzeyi kaplanana kadar dekontamine edin. Yumurtalar, izolatörlere transfer sırasında 16 dakika ve 30 s boyunca spreyle temas halinde kalacaktır.</li>
	<li>Yumurtaları steril kuluçka izolatörlerine aktarın ve kuluçka boşluğuna yerleştirmeden önce steril demineralize su ile durulayın. NOT: Hayvanlar yumurtadan çıkar ve steril izolatörlerde yetiştirilir. Gama ışınlaması ile sterilize edilmiş ticari bir diyetle ad libitum ile beslenirler ve su dağıtıcıları tarafından sağlanan otoklavlanmış musluk suyuyla sulanırlar.</li>
</ol>4. Bakteriyolojik durum analizi
<ol><li>Yumurtadan çıktıktan bir gün sonra, doğrudan farklı civcivlerin rektumundan bir dışkı örneği alın ve bu numuneyi belirli bir izolatör içindeki tüm hayvanları temsil etmek için sterilize edilmiş bir cam tüp içinde toplayın.</li>
	<li>Dışkı örnekleri az ya da çok sıvı olduğundan, resazurin ile 9 mL tiyoglikolat et suyuna 1 mL dışkı eşdeğeri ekleyin. Kalan dışkı örneğini 9 mL beyin kalp infüzyonu suyuna (BHI) ekleyin ve tüpleri 18 ila 48 saat boyunca sallamadan 37 ° C'de inkübe edin. Bu, çok çeşitli aerobik, fakültatif aerobik ve titiz olmayan anaerobik türlerin büyümesine izin verecektir. NOT: Resizmarinli tioglikolat et suyu, titiz olmayan anaerobik bakterilerin tespiti için tasarlanmıştır, ancak aynı zamanda aerobik bakterilerin tespitini de sağlar. Bu ortam, sterilite testi için Avrupa, Amerika ve Japon farmakopelerine uygundur18,19,20.</li>
	<li>Büyüme ortamındaki herhangi bir değişikliğin 18 saatlik inkübasyondan sonra meydana gelip gelmediğini görsel olarak gözlemleyin. 48 saat sonra, BHI dışkı-et suyu ortamından bir damla alın, bir cam slayta yerleştirin ve bakterilerin yokluğu veya varlığı için mikroskop altında (40X büyütme) gözlemleyin.</li>
	<li>Bakterilerin varlığına dair bir şüphe varsa, BHI kültüründen bir örnek alın ve BHI agar plakalarına tohumlayın. 18 ila 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Koloniler varsa, hassas mikrobiyal tanımlama için MALDI-TOF kütle spektrometresi gibi yüksek verimli teknikler uygulayın. NOT: 72 saat sonra, bakteriyolojik analizler negatifse, hayvanlar mikropsuz ilan edilir.</li>
</ol>

<ol><li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+microbiota%3A+importance+and+detection+echnology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5(2018).</li>
<li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li>
<li>Umesaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gnotobiotic+mice+to+identify+and+characterize+key+microbes+responsible+for+the+development+of+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy%2C+Ser.+B%2C+Physical+and+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system.</a> Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).</li>
<li>Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota%2C+gut+health+and+chicken+productivity%3A+what+is+the+connection%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Miyakawa.+Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection?</a> Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374(2019).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbial+communities+in+the+chicken+oviduct+and+the+origin+of+chicken+embryo+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota.</a> International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838(2019).</li>
<li>Hincke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+structural+barriers+and+innate+immune+components+during+incubation+of+the+avian+egg%3A+critical+interplay+between+autonomous+embryonic+development+and+maternal+anticipation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation.</a> Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).</li>
<li>Le Bars, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+protocol+for+obtaining+germ-free+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens.</a> Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).</li>
<li>Lafont, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+some+factors+limiting+%27competitive+exclusion%27+of+Salmonella+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li>
<li>Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li>
<li>Dozois, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+and+in+vivo+expression+of+F1+%28type+1%29+fimbrial+antigens+in+chickens+experimentally+infected+with+pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli.</a> Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).</li>
<li>Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+island+of+an+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain+enables+the+metabolism+of+fructooligosaccharides%2C+which+improves+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).</li>
<li>Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fructooligosaccharide+metabolism+on+chicken+colonization+by+an+extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain.</a> PLoS One. 7 (4), 35475(2012).</li>
<li>Kraimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+gut+microbiota+transfer+on+emotional+reactivity+in+Japanese+quails+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica).</a> of Experimental Biology. 222, (2019).</li>
<li>Stanley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+associated+with+differential+feed+conversion+efficiency+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens.</a> Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+gut+microbiota+composition+on+Campylobacter+jejuni+colonization+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 0038017(2017).</li>
<li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+dynamics+during+conventionalization+of+germ-free+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken.</a> mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).</li>
<li>Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li>
<li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22European+Pharmacopoeia+%28Ph.+Eur.%29%3A+Supplement+6.3%2C+Sterility%22">European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility</a>. , reference 01/2009:20601 (2009).</li>
<li>Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJapanese+Pharmacopoeia%2C++%22Japanese+Pharmacopoeia+%28JP%29%3A+The+4.06+Sterility+Test+as+it+appeared+in+the+partial+revision+of+the+JP+15th+edition%22">Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition</a>. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).</li>
<li>United States Pharmacopeia (USP). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeia+%28USP%29%3A+Sterility+Tests+as+presented+in+Pharmacopeial+Forum%2C+Interim+Revision+Announcement+No.+6%22">United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6</a>. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).</li>
<li>Harrison, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+chicks%3A+a+comparison+of+the+hatchability+of+eggs+sterilized+externally+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods.</a> Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).</li>
<li>Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+production+and+rearing+of+the+germ-free+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J-STAGE+home+Nihon+Chikusan+Gakkaiho%22%5BJournal%5D)">A simple method for production and rearing of the germ-free chick.</a> J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+and+establishment+of+gut+microbiota+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1967(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Mikropsuz tavuklar üretmek için çeşitli yöntemler daha önce tanımlanmıştır 7,21,22. Burada sunulanlar gibi basit yöntemler, yumurta yüzeyindeki ve izolatörlerdeki bakteri yükünü azaltmak için farklı dezenfektanlar kullanır. En sık kullanılan dezenfektanlar merkürik klorür, kuaterner amonyum, iyodoform, sodyum hipoklorit ve klor dioksit çözeltileridir. Sonuçlar genellikle tatmin edicidir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin erişilebilirliğine rağmen, az sayıda yapı yöntemi uygulayabilir ve hayvanları büyük ölçekte yetiştirebilir, böylece mikropsuz tavukların kullanımını, yalnızca çok özel bilimsel soruları ele almak için kullanılan, nispeten nadir bir yaklaşım haline getirir. Burada açıklanan yöntemler, malzemeler ve ekipmanlar, en az 3 hafta boyunca sağlıklı ve steril kalan mikropsuz piliçlerin yüksek verimli bir kuluçka oranına izin verir (üretildikleri bilimsel deneylerin süresi).
Sonuçlar, protokolün ticari kanatlı hayvan çiftliklerinde toplanan yumurtalardan mikropsuz civcivlerin üretimine uyarlanmasının başarılı olduğunu göstermektedir. SPF yumurta üretimi ile ilgili deneyimler, kuluçka verimliliğinin öncelikle yumurtlayan tavukların yaşına ve toplanan yumurtaların kalitesine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. Çiftlikler seçildiğinde ve yumurtalar toplanırken her iki parametre de dikkate alınmıştır. Aynı yöntemi kullanarak, mikropsuz piliçlerin ortalama kuluçka oranı, tesisimizdeki SPF yumurtlayan tavukların son üretiminde elde edilenden (% 79'a karşı% 35), hayvan sterilitesini etkilemeden (% 87'ye karşı% 83) elde edilenden çok daha iyidir. Bu farklılıklar, kuşların genetik arka planıyla (piliçlere karşı katmanlar) ve SPF hayvanlarının yumurtalarında daha kırılgan olması muhtemel olan yumurta kabuğunun kalitesiyle ilişkili olabilir. Ayrıca, 2 saatten fazla (çiftliklerden deney tesisine) taşımanın kuluçka verimliliğini ve kalitesini etkilemediğini de gösteriyoruz.
Kuluçkalık izolatörler için kullanılan sterilizasyon işlemi ve yumurta dekontaminasyonu protokolü optimize edilmiş olmasına rağmen, izolatörlerin yaklaşık% 10'u mikropsuz değildi. Kontaminasyonun kökenini anlamak için, yumurtadan çıkan izolatörlerin yumurta girişinden önce rutin sterilite kontrolünün yapılması çok önemlidir.
Kuşların sterilite durumu ile ilgili olarak, dışkı örneklerinden aerobik ve titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesine izin veren yöntemleri uygulamaya çalıştık, böylece canlı, canlı bakterileri tespit ettiğimizi sağladık. Bu yöntemler, sterilite testi için uluslararası farmakopelerle uyumludur ve rutin olarak kullanılacak hızlı, kolay ve maliyeti düşük teknikleri temsil eder. Bununla birlikte, 16S rRNA gen dizilimi gibi moleküler biyoloji teknikleri, bakteri canlılığı hakkında bilgi vermemekle birlikte, yetiştirilemeyen bakterilerin varlığının doğrulanması için uygulanabilir. Nitekim, yakın zamanda yapılan bir çalışma, maternal yumurta kanalı mikrobiyotasının bazı bakterilerinin yumurta akı yoluyla embriyoya aktarıldığını ve daha sonra embriyo bağırsak bakteri popülasyonunun çoğunu oluşturduğunu ileri sürmüştür5. Dahası, başka bir çalışma, erken embriyolarda barındırılan mikrobiyal kolonizatörlerin bir kısmının maternal tavuklardan miras alındığını ve bağırsak mikrobiyal bolluğunun ve çeşitliliğinin daha sonra gelişim sırasında çevresel faktörlerden ve konakçı genetiğinden etkilendiğini ileri sürdü23. Bununla birlikte, bu çalışmaların sonuçları, bu bakterilerin büyük bir kısmının yumurta akında (büyük ölçüde antimikrobiyal moleküllerle yüklü) ölü olabileceği veya çoğalamayacağı DNA dizi analizine dayanmaktadır. Thomas ve işbirlikçileri16 , BHI plakalarına dışkı damlatma yoluyla yetiştirilebilir aerobik ve fakültatif aerobik bakterilerin değerlendirilmesi yoluyla sterilite testi gerçekleştirdi ve böylece mikropsuz sterilite kontrolü için standart bakteriyolojik yöntemlerin verimliliğini vurguladı. Ayrıca, önerilen protokolde, titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesini tespit edebilmek için resazurin ile tiyoglikolat et suyunda büyüme izlemeyi kullandık.
Mikropsuz bıldırcınların ve tavukların üretimi için zaten kullanılan protokol, çoğu yuva yapan kuştan mikropsuz hayvanların üretimine uyarlanabilir ve bu hayvanların fizyolojisine mikrobiyota katkısının incelenmesi için perspektifler sunar. Bu modelin kümes hayvanı bağırsağındaki konakçı-mikrobiyota karşılıklı etkileşimlerini araştırmak için kullanılmasının yanı sıra, uygulamalı araştırmalar için de yararlı olabilir. Örneğin, hayvan sağlığını ve sağlamlığını iyileştirmek için tavuk bağırsağı komensal mikroorganizmalarından türetilen probiyotiklerin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bağırsak mikrobiyotasının hayvan sağlığına katkısı ile ilgili bilimsel ve popüler ilgide çarpıcı bir artış olmuştur. Hayvanın bağırsağında farklı nişlerde yaşayan bakteri, virüs, mantar ve arkelerden oluşan mikrobiyota, sadece memeli türlerini değil, aynı zamanda kümes hayvanları gibi hayvancılığı da etkileyen enflamatuar, bulaşıcı ve metabolik hastalıkların düzenlenmesinde doğrudan veya dolaylı olarak rol oynar1. Bağırsak mikrobiyotasının sağlık ve hastalığa katkısını daha iyi incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, mikropsuz ve gnotobiyotik hayvanlar, sırasıyla mikropların veya bilinen bir mikrobiyotanın tamamen yokluğunun, enfeksiyonların fizyopatolojisi üzerinde incelenmesine izin verir 2,3. Bununla birlikte, bu hayvanları üretmek ve sürdürmek, özel teknikler ve tesisler gerektirir ve onları korumak için gereken maliyetler, emek ve beceriler birçok araştırmacıya erişimlerini sınırlar. Gerçekten de, mikropsuz hayvanlar, bakteri yetiştirme yöntemleri, mikroskopi, seroloji, brüt morfoloji ve dizileme tabanlı tespit tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak olası kontaminasyon için düzenli olarak izlenmelidir. Benzer prosedürler, hayvanların genellikle daha büyük olduğu ve üreme ve bakımları için daha büyük tesisler gerektirdiği hayvancılık gibi diğer türler için de geçerlidir, bu da mikrobiyota üzerine araştırmaları bir dereceye kadar engelleyebilir.
Kümes hayvanları, daha spesifik olarak tavuklar, yılda 40 milyar kuşu aşabilen bir sürü nüfusu ile dünya çapında hayvancılık üretiminin temel taşıdır. Dünyadaki en önemli hayvansal protein kaynağıdır (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Dahası, tavukların yetiştirilmesi veya tüketilmesiyle ilgili kültürel veya dini tabular yoktur. Kanatlı hayvan bağırsak mikrobiyotası, diğer birçok besinsel, fizyolojik veya patolojik sürecin yanı sıra hayvanın büyümesinde, yem dönüşüm oranında, bağışıklığında, patojen direncinde önemli rol oynar4. Bu nedenle, mikrobiyota ve ev sahibi4 arasındaki diyaloğun altını çizmek için mikropsuz tavukların nesli vazgeçilmezdir. Mikrobiyal topluluklar tavuk yumurta kanalı5'te yaşıyor olsa bile, sağlıklı bir tavuk tarafından taze olarak serilmiş bir yumurtanın içeriği çoğunlukla mikroorganizmalardan arındırılmıştır, yumurta kabuğu ve mikroorganizma istilasını önlemek için mekanik bariyerlere sahip zarlar4. Ek olarak, civcivler, memelilerin aksine, steril koşullar altında ebeveyn yetiştiriciliği olmadan mikropsuz hayvanların üretilmesine izin veren akrabalarının yokluğunda kolayca yetiştirilir.
"Çiftlik, Model ve Vahşi Hayvanların Enfeksiyonu" deneysel tesisi (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Fransa, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12), Fransız Ulusal Altyapı Ağı EMERG'IN'in (https://www.emergin.fr/) bir parçasıdır. PFIE, 40 yıldan fazla bir süredir çeşitli deneysel çalışmalar yapmak için mikropsuz tavukların üretiminde ustalaşmıştır 7,8,9,10,11. Bu hayvanlar, 1970'lerden beri kapalı ıslahta yetiştirilen beyaz bir bacak boynuzu döşeme hattından spesifik patojensiz (SPF) yumurtalardan üretilmiştir. Esas olarak mikrobiyolojik çalışmalar için kullanılan 7,8,9 mikropsuz kuşlar, bağırsak mikrobiyotasının davranışa katkısı 13, besin kullanımı 14, bağışıklık gelişimi15 ve endokrin aktivite gibi sorularla ilginin yeniden canlandığını yaşamaktadır. Mikropsuz piliç hatları16 kullanılarak bazı çalışmalar yayınlanmış olsa bile, bu çalışmalar deneysel katman çizgileri kullanan çalışmalara kıyasla yeterince temsil edilmemektedir. Mikrobiyota ile kümes hayvanı sağlığı ve refahındaki ev sahibi arasındaki çapraz konuşmaya yönelik bilimsel soruların evrimi, tarihsel protokolümüzü, dünyanın en çok kullanılan piliç tavuğu hattı olan Ross PM3 hattının mikropsuz piliçlerini üretmek için uyarlamamıza yol açtı.

<table><tbody><tr><td>2 mL steril plastik pipetler</td><td>Yıldızlı</td><td>86.1252.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI agar plakaları</td><td>Thermo fisher teşhis</td><td>PO1198A</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kalp İnfüzyon suyu</td><td>Thermo fisher teşhis</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr>Evde <td>yapılan ve otoklavlama ile sterilize edilen</td> <td>9 mL BHI suyu</td><td></td><td></td> içeren cam tüpler</tr><tr>Evde <td>yapılan ve otoklavlama ile sterilize edilen</td> <td>resazurinli</td><td></td><td></td> 9 mL tiyoglikolat suyu içeren cam tüpler</tr><tr><td>Kuluçka kuluçka makinesi</td><td>Fieme</td><td>MG 576</td><td></td></tr><tr>Bakteriyolojik kültür için<td>kuluçka makinesi</td><td>Memmert</td><td></td><td>, 37 &°; C</td></tr><tr><td>Işınlanmış besleme</td><td>Güvenli</td><td>U8983G10R</td><td>40 kG ışınlanmış</td></tr><tr><td>İzolatörler</td><td></td><td></td><td>ev yapımı. Pozitif basınç altında 1 m3 sert izolatör</td></tr><tr><td>Mikrobiyolojik güvenlik kabini</td><td>Thermon Electron Corporation</td><td></td><td>modeli: Hera Güvenli</td></tr><tr><td>Mikroskop Visiscope serisi 300</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet yardımcısı</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril mühürlü kutular</td><td>Tuperware</td><td></td><td>çapı</td></tr><tr><td>Sterilize cam tüp</td><td></td><td></td> <td>"sovirel"</td></tr> <tr>Resazurin <td>Merck</td><td>90404-500G</td><td></td>ile <td>Tiyoglikolat Suyu</td></tr><tr>Su<td>banyosu</td><td>Fisher bilimsel</td><td></td><td>Model: Polystat 36, 100 ° C'de 10 dakika inkübe etmek için kullanılır; Ortamı yenilemek için 9 mL tiyoglikolat suyu ile resazurin içeren cam tüpleri C</td></tr></tbody></table>

mikrobiyota Çalışmaları için ticari bir hattan mikropsuz hızlı büyüyen piliçlerin Üretimi

Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Bağırsak mikrobiyotasının konakçı fizyolojisine ve immün yeterliliğine katkısı üzerine yapılan çalışmalar, altın standart olarak kabul edilen mikropsuz hayvan modellerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılmaktadır. Yuvalama kuşları, mikropsuz hayvanların üretimi için ideal modellerdir, çünkü akrabalarını steril koşullar altında yetiştirmeye gerek yoktur. Mikropsuz tavuklar esas olarak, ticari tavuk hatlarını zayıf bir şekilde temsil eden spesifik patojensiz (SPF) deney hatlarından üretilir. Burada önerilen yöntem, kanatlı hayvan endüstrisi tarafından yaygın olarak kullanılan hızlı büyüyen piliç hattı Ross PM3'ten mikropsuz tavukların üretilmesine izin verdi. Bir piliç yetiştiricisi çiftliğine döşendikten sonra yumurtalar hızla toplandı. Toplamadan steril bir yumurtadan çıkma izolatörüne girmeye kadar sıkı bir dekontaminasyon işlemine tabi tutuldular. Civcivler yumurtadan çıkmış ve sterilitelerini kontrol etmek için gerekli olan süre boyunca bu steril izolatörlerde tutulmuştur. Başlangıçta deneysel bir SPF beyaz bacak boynuzu hattı için geliştirilen mevcut protokol sadece Ross PM3 piliç hattına değil, aynı zamanda bıldırcınlara da uyarlanmıştır. Bu nedenle, diğer kanatlı hayvan türlerine ve ekonomik, biyolojik veya ekolojik açıdan yuva yapan kuşlara karşı sağlam ve kolayca uyarlanabilir bir prosedürü temsil eder.

İki farklı Fransız çiftliğinden gelen Ross PM3 yumurtaları ile altı adet mikropsuz civciv üretimi gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Toplam 853 yumurta toplandı ve iki dekontaminasyon adımından ve 19 günlük inkübasyondan sonra% 86.40'ı yaşayabilirdi. Bu canlı yumurtaların 490'ı üçüncü bir dekontaminasyon adımına tabi tutuldu ve ortalama% 79.80'lik bir kuluçka oranı için çeşitli kuluçka izolatörlerine sokuldu. Bu, toplanan ilk yumurta sayısına kıyasla% 68.94'lük bir kuluçka oranını temsil eder.
Bununla birlikte, kuluçka sonuçları, gerçekleştirilen seriye göre önemli ölçüde değişmektedir: toplanan yumurta sayısına kıyasla canlı civcivlerin% 41.67 ila% 88.16'sı. Bu varyasyonlar, aynı deney sırasında farklı kapaklar arasında da gözlendi. Tüm izolatörler tüm koşular için kullanılmadığından, izolatöre bağımlı bir etkiyi dışlamak zordur. Bununla birlikte, bu parti etkisi, yaşlı tavuklardan gelen yumurtaların daha az canlı olduğu yumurtlayan tavukların yaşı ile doğrudan ilişkiliydi (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td c=""></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Burada, ticari bir piliç hattı olan Ross PM3'ün yumurtalarından mikropsuz civcivlerin üretilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, diğer kanatlı hayvan türlerinden mikropsuz hayvanların üretimi için uyarlanabilir.

Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

Şimdiye kadar, mikropsuz kuşların üretimi, araştırma için hayvan ırkı ile sınırlıydı. Burada bunu ticari hayvanlarla yapmanın mümkün olduğunu gösteriyoruz. Bu teknik, çiftlik kuşlarının genetik arka planını kullanarak mikrobiyotanın etkisi ile ilgili çalışmalar yapmayı mümkün kılar.Bu protokolü denerken, seçilen türün standart koşullarda üremesini kontrol etmek ve izolatörlerde çalışma konusunda güçlü bir bilgiye sahip olmak önemlidir. Pozitif basınç altında sert bir yalıtkanda 50 mililitrelik tüpler, plastik pipetler, ışınlanmış besleme, otoklavlanmış su ve steril sızdırmaz plastik kaplar kurarak başlayın. Transfer antiseptik tuzağını %2'lik bir kuaterner amonyum çözeltisi ile doldurun ve tüm temas yüzeylerinin dezenfeksiyonunu sağlamak için izolatörü her sterilizasyon arasında izolatörün içindeki malzemeleri hareket ettirerek formaldehit buharı ile üç kez sterilize edin.Yumurtaları tanıtmadan en az iki gün önce, izolatör sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Giriş gününde, hidrometreyi bağıl nemin% 65 ila 70'ine ayarlayın. Temiz ve kusursuz yumurtaları seçtikten sonra, yumurta yüzeyini beş dakika boyunca %1,5 perasetik asit çözeltisine batırarak hemen dekontamine edin, ardından yumurtaları formaldehit buharı ile dekontamine edilmiş bir kutu kullanarak deney tesisine taşıyın.Yumurtaları 14 santigrat derecede 24 saat saklayın, ardından sterilizasyonu %1,5 perasetik asit ile tekrarlayın ve yumurtaları 19 gün boyunca kuluçkalık bir kuluçka makinesine koyun. 19. günde, steril koşullar altında hafif bir yumurta mumlayıcısı kullanarak embriyonun doğurganlığını, canlılığını ve gelişimini doğrulayın. Canlı, embriyonlu yumurtaları seçin ve üzerlerine %1,5 perasetik asit solüsyonu püskürterek 30 saniye veya her yumurtanın tüm yüzeyi kaplanana kadar dekontamine edin.Yumurtaları steril kuluçka izolatörlerine aktarın ve kuluçka alanına yerleştirmeden önce steril demineralize su ile durulayın. Yumurtadan çıktıktan sonra hayvanlar steril izolatörlerde tutulur, gama ışınlaması ile sterilize edilmiş ticari bir diyetle ad libitum ile beslenir ve otoklavlanmış musluk suyu ile sulanır. Yumurtadan çıktıktan bir gün sonra, doğrudan farklı civcivlerin rektumundan bir dışkı örneği alın ve bunları sterilize edilmiş bir cam tüpte toplayın.Resazurinli dokuz mililitre tiyoglikolat suyuna bir mililitre dışkı ekleyin ve kalan numuneyi dokuz mililitre Beyin Kalp İnfüzyonu veya BHI suyuna ekleyin. Tüpleri 18 ila 48 saat çalkalamadan 37 santigrat derecede inkübe edin. 18 saatte, büyüme ortamındaki herhangi bir değişiklik için tüpleri görsel olarak inceleyin.48 saat sonra, BHI dışkı suyu ortamından bir damla alın, bir cam slayt üzerine yerleştirin ve mikroskop altında gözlemleyin. Bakteri varlığından şüpheleniliyorsa, BHI kültüründen bir örnek alın ve bir BHI agar plakasına tohumlayın, ardından plakayı 18 ila 48 saat boyunca 37 derecede inkübe edin. Koloniler ortaya çıkarsa, MALDI-TOF kütle spektrometresi gibi yüksek verimli bir teknik kullanarak bakterileri tanımlayın.İki farklı Fransız çiftliğinden gelen ROSS PM3 yumurtaları ile altı kez mikropsuz civciv üretimi gerçekleştirildi. Toplam 853 yumurta toplandı ve iki dekontaminasyon aşaması ve 19 günlük inkübasyondan sonra %86.40'ı canlı bulundu. Canlı yumurtalardan 490'ı üçüncü bir dekontaminasyon adımına tabi tutuldu ve ortalama %79.80'lik bir kuluçka oranı için çeşitli kuluçka izolatörlerine sokulduBu, toplanan ilk yumurta sayısına kıyasla %68.94'lük bir kuluçka oranını temsil eder.Kuluçka sonuçları, toplanan yumurta sayısına kıyasla canlı civcivlerin %41.67 ila %88.16'sı arasında önemli ölçüde değişmektedir. Bu etki, yaşlı tavuklardan gelen yumurtaların daha az canlı olduğu yumurtlayan tavukların yaşı ile doğrudan ilişkiliydi. Altı çalışma, dört farklı tarama izolatörü kullanılarak gerçekleştirildi.Bakteriyolojik kontrolden sonra, 16 izolatörün 14'ünden alınan hayvanların mikropsuz olduğu doğrulandı, bu da %86,5'lik bir başarı oranına karşılık geliyor. Bu, dezenfeksiyon prosedürlerine uyulmasını ve hepsinden önemlisi, elemanların sıvı hava kilidi yoluyla girişinin kontrol edilmesini gerektirir. Bu prosedür, hayvanların mikrobiyotanın kuşların fizyolojisi ve sağlığı üzerindeki etkisini ölçmesini sağlar.Yumurtalara erişilebiliyorsa, diğer çiftlik kuşlarından veya vahşi yaşamdan mikrobiyotayı incelemek için uyarlanabilir ve kullanılabilir.

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Taylor, M.N., et.al. Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucan Verilerini Kullanma. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, mikropsuz, yaşları uyumlu Caenorhabditis elegans solucanlarının bağırsak kolonizasyonu için bir bakteri suşuna maruz kalmasını göstermektedir. Yapışmamış ve harici bakterilerin seçici olarak uzaklaştırılmasını açıklar ve miktar tayini için bağırsak epiteline yalnızca canlı bakteriler yapışır.

Mikropsuz C. elegans'de Bağırsak Bakteri Kolonizasyonunun Değerlendirilmesi

Mikropsuz Napa lahanaları yetiştirme yöntemi, araştırmacıların tek mikrobiyal türlerin veya çok türlü mikrobiyal toplulukların lahana yaprağı yüzeylerinde nasıl etkileşimde bulunduklarını değerlendirmelerini sağlar. Steril bir sebze özü de sebze fermantasyon sırasında toplum kompozisyon vardiya ölçmek için kullanılabilir sunulmaktadır.

Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem

Bu protokol, yumurta vakalarını (oothecae) kuluçkadan önce yüzey sterilize ederek gnotobiyotik Amerikan hamamböceği(Periplaneta americana)kurulmasında ve sürdürülmesinde kullanılır. Bu gnotobiyotik böcekler dikey olarak bulaşan Blattabacterium endombiyotlarını içerir, ancak eksenik bağırsaklara sahiptir.

Gnotobiyotik Amerikan Hamamböceklerinin Kurulması ve Bakımı (Periplaneta americana)

Aksenik bir böcek elde etmek için, yumurta yüzeyi sterilize edilir ve yumurtadan çıkan larva daha sonra aksenik yapraklar kullanılarak yetiştirilir. Bu yöntem, antibiyotik uygulamadan veya diğer yaprak yiyen böceklere de uygulanabilen yapay bir diyet geliştirmeden aksenik böcek preparatı için etkili bir yol sağlar.

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi

Yarı fermente steril diyetlerle axenic Delia antiqua yetiştirmek için basit bir prosedür tarif edilmiştir. PCR kullanılarak her bir aksenik D. antiqua instarında sadece bir Wolbachia suşu tespit edildi.

Axenic Delia antiqua'nın Yarı Fermente Steril Diyetlerle Yetiştirilmesi

Bu protokol, mikropsuz (GF) balık embriyoları elde etmek ve bunları larvalardan gençlik aşamasına kadar korumak için, örnekleme ve steril durumlarını tespit etme dahil olmak üzere birincil adımları özetlemektedir. Enfeksiyonlu GF modellerinin kullanılması, mikropların konak sağlığındaki rolünü anlamak için önemlidir.

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Protokol, anaerobik bağırsak bakterilerinin izolasyonunu iyileştirmek için iki metodoloji sunar. Birincisi, farklı kültür ortamları kullanılarak çok çeşitli bakterilerin izolasyonuna odaklanır. İkincisi, ekolojik önemini tam olarak anlamak için muhtemelen miyo-inositol'ü asimile eden belirli bir mikrobiyal grubun yetiştirme adımlarına odaklanır.

Tavuğun Gastrointestinal Sisteminden Anaerobik Bakteri Yetiştiriciliğini Geliştirme Stratejileri

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Burada, örnek olarak immünofenotipleme için kan örneklemesini kullanarak "Yabani fareler" için bir tesisin mikrobiyal muhafaza önlemleri de dahil olmak üzere yapısını ve işletme prosedürlerini açıklıyoruz.

Doğal Mikrobiyomlu Laboratuvar Fareleri için Bir Tesisin İşletilmesi ve Biyolojik Muhafaza Prosedürleri: İmmünofenotipleme Prosedürü

Bu protokol, steril koşulları korurken deneysel tek kafesli izolatörlere (izokafesler) mikropsuz fare transferi ve muhafazası için en iyi uygulamaları açıklar. Mikropsuz farelere dışkı nakli yöntemleri ve daha ileri uygulamalar için bu bağırsak "insanlaştırılmış" farelerden canlı bakterilerin toplanması tartışılmaktadır.

Mikropsuz Farelere İnsan Dışkı Nakli için Biyodışlama İzoPozitif Kafes Deneyinin Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Bu yöntem, tavuk embriyosunu, bakteriyel patojen L. monocytogenes'i yaşayabilir ancak kültürlenemeyen (VBNC) bir durumdan canlandırmak ve bakteri uyku hali mekanizmalarının anlaşılmasında potansiyel olarak daha fazla kullanım sağlamak için basit ve uygun maliyetli bir in vivo model olarak göstermektedir.

Canlı Ancak Kültürlenemeyen Patojenleri Canlandırmak için İn Vivo Model Olarak Tavuk Embriyosu

Keşfedin ticari yumurtalardan mikropsuz piliç üretim yöntemini. Perasetik asit dezenfeksiyonu ve izolatör kullanımıyla Ross PM3 hattında mikrobiyota araştırmaları için güvenilir bir protokol sunar.

Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet