Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem

Bu protokolü kullanarak, mikropların fillosferde nasıl bir araya gelip etkileşime girdiğine ilişkin önemli soruları yanıtlayabiliriz. Bu steril sebze ekstresi kullanarak, biz bitkisel fermantasyon sırasında işlevlerine phyllo küre toplulukların yapısını bağlayabilirsiniz ek yararı vardır. Bu teknikler bilim adamlarının mikropların filo küresinde nasıl etkileştiğini test etmelerini ve sonra bu filo küre topluluklarının fermantasyonu nasıl etkileyebildiğini izlemelerini sağlar.

Yüzey lahana tohumları sterilize etmek için, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp 100 tohum yerleştirerek başlar. Tüpe bir mililitre %70 etanol ekleyin ve beş dakika girdap layın. Sonra etanol atmak için bir pipet kullanın.

Beş dakika boyunca tüp % 50 çamaşır suyu ve girdap bir mililitre ekleyin, sonra çamaşır suyu atın. Tohumları dört kez durulayın, bir mililitre otoklaved deiyonize su ekleyerek tüpü girdap, sonra da suyu atın. Son duruladıktan sonra, ekimden önce tohum kat yumuşatmak için iki ila sekiz saat boyunca sterilleştirilmiş deiyonize suda tohumları ıslatın.

15'e 2,5 santimetrelik cam bir tüpe 10 gram temiz kalsiyum kil tartın. Kalsiyumlu kil kapsayacak şekilde her tüp için hazırlanan MS Suyu yaklaşık dokuz mililitre ekleyin. Gevşek 22 milimetre iki yönlü test tüpü kapakları ile cam tüpler kap.

Tüpleri 121 derecede 60 dakika boyunca otoklavlayın. Tüpleri otoklavdan çıkarırken, kapakları cam tüplerin üzerine iterek mühürleyin, ardından tüpleri kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar soğutun. Tüpler soğuduklarında, her tüpün ortasına hafifçe bir steril lahana tohumu yerleştirmek için ekstra uzun terpler kullanılır.

Yedi yönlü tepside tüpler Dantel ve 24 santigrat derece bir 16 saatlik ışık döngüsü ile hafif raflar altında tepsi yerleştirin. Tohumlar beş gün sonra ilk gerçek yaprak gelişecektir, hangi cotyledons oluşan sonra ilk vasküler yaprak. Bu rukumu kenarı vardır ve tricombs kaplıdır.

Sterilite için mikropiçermeyen lahanayı test etmek için, sterilize edilmiş forsepslerle bitkinin tabanını hafifçe tutun ve dışarı çekin. Lahanayı tüpten tamamen çıkarmadan önce, sterilize edilmiş diseksiyon makasla kökleri dikkatlice kesin. Sonra, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp içine lahana yaprakları kompakt.

Her mikro santrifüj tüpüne 400 mikrolitre PBS ekleyin ve lahanayı homojenize etmek için steril bir mikro havaneli kullanın. Bıçak 100 lahana mikrolitre agar plakaları üzerine homojen, geniş bir delik pipet ucu kullandığınızdan emin olun. Aşılama suşları gliserol stokları yapmak için, yavaşça aynı ortam iki veya üç yeni plakalar üzerine bireysel koloniler dışarı çizgi.

Kürek koloniler iki ila beş gün, sonra 15 mililitre konik tüp içine plakaları kazıyın 15 mililitre lik gliserol. Girdap iyice karıştırmak için tüp. Bir mikro santrifüj tüp içine karışık gliserol stok Aliquot bir mililitre ve gliserol stok kalan 14 mililitre ile birlikte kullanıma hazır olana kadar 80 santigrat derece saklayın.

Kullanmadan bir hafta önce, buz üzerinde bir mililitre aliquot eritme ve aşılama stok konsantrasyonu belirlemek için birkaç farklı seyreltme yerleştirin. Lahana aşılamak için hazır olduğunda, buz üzerinde gliserol stok eritme ve istenilen konsantrasyona seyreltin. Steril pompa şişesine seyreltilmiş stok 10 mililitre ekleyin ve büyük bir atık toplama kabına beş sprey pompalayın.

Lahana tüpünden kapağı çıkarın ve lahanayı sprey şişesine doğru yatırın. Sprey her lahana aşı çözeltisi üç pompaları ile, sonra gerçek giriş aşılama konsantrasyonu değerlendirmek için lahana bir alt kümesi hasat. Lahanahasığını almak için, sterilize edilmiş enfazla tüpten çıkarın.

Steril diseksiyonu makası ile kökleri kesin ve dikkatlice önceden tartılmış steril mikro santrifüj tüp yerleştirin. Gelecekteki hesaplamalar için lahananın ağırlığını kaydedin. Lahana ile her tüp e 400 mikrolitre PBS ekleyin ve bir mikro havaneli ile 30 kez eziyet, sonra geniş delik pipet ipuçları kullanarak lahana homojenate plaka.

Çıkarın ve lahana en dışyaprakları atın ve bir blender sığacak şekilde kalan tüm lahana doğrayın. İnce bir hamuru karıştırın ve lahana homojen tartMak. Lahana gram başına distile su iki mililitre ekleyin.

Sonra sepet kahve filtreleri iki kat ile lahana bulamaç süzün. Bulamacı santrifüj tüplere dağıtın ve 20.000 kez G'de 20 dakika veya büyük parçacıklar çözeltiden çıkana kadar santrifüj edin. Peletli lahana enkazını rahatsız etmemeye özen terek supernatant'ı çıkarın.

Standart tuz konsantrasyonları ile fermantasyon koşulları yeniden oluşturmak için, özü hacim sodyum klorür% 2 ağırlık ekleyin. Bir vakum bağlı bir 0.2 mikrometre filtre ile bilder sebze özü, steril tüpler içine dağıtmak ve eksi 80 santigrat derece dondurmak. Tohum sterilizasyon yöntemi birkaç Napa lahana ile test edildi ve hepsi benzer büyüme oranları gösterdi.

Ancak, brassica diğer türler bitkiler ya sterilizasyon sonra düşük çimlenme oranları vardı ya da kök hızla bir spindly sağlıksız bitki yapmak için uzadı çünkü sınırlı başarı verdi. Mikrobiyal izolasyonlar ya tek bir süzme izole olarak ya da başka bir izole ile birlikte aşılandı. Her tedavi için toplam 15 mikropsuz lahana test edildi ve aşıdan sonra dört gün veya 10 gün içinde hemen hasat edildi.

İzoleler Napa lahana sıvık filosferinde hızlı bir büyüme gösterdi. İki maya ve üç bakteri, kırmızı, yeşil ve Napa lahanasından yapılmış üç farklı steril sebze özü veya SVE türüne aşılandı. Inoküllerin büyümesi 14 gün boyunca mrs veya YPD agar plakaları üzerine her tedavinin beş mikrolitre lik nokta kaplaması ile kaydedildi.

Fermantasyon boyunca yapılan pH ölçümleri, laktik asit bakterilerinin SVE'yi pH 4'ün altındaki seviyelere asitleştirebildiğini ve bunun da tüketim için güvenli bir fermantasyon olduğunu gösterdiğini göstermiştir. Bu yöntemler özellikle lahana mikrobiyomu uygulanmıştır ancak diğer bitki sistemlerinde yararlı olabilir. Bu sistemi steril tutmak için zor olabilir, bizim anahat protokolleri ayrıntılı, ama biz her adım önemli bulundu.