Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması
10 Mayıs 2020
Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.
İnsan pluripotent kök hücrelerinde genlerin düzenlenmesi zordur. Bu protokol, hedefleme vektörü ile birlikte eşleştirilmiş Cas-90 vakası kullanılarak bu hücrelerde genom düzenleme için ayrıntılı prosedür sağlar. Güvenilir ve takip etmesi kolaydır.
Bu protokolün temel avantajı, kesintisiz genomik düzenleme olmasıdır. İki aşamalı seçim, hedeflenen hücrelerin arttırılmasına yardımcı olur ve genotipleme taramasını daha verimli hale getirir. İnsan pluripotent kök hücrelerini mTeSR1 ortamında rekombinant laminin 21 kodlu yüzeylerde muhafaza edin.
Hücreler, bir ila üç bölünme oranından 72 saat sonra% 70 ila 85 birleşmeye ulaşmalıdır. Transfeksiyon gününde, 300 mikrolitre laminin 521 çözeltisi ile 24 oyuklu bir plakanın yeterli miktarda kuyusunu kaplayın ve plakayı en az iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kaplama çözeltisini nazikçe çıkarın ve hemen her bir oyuğa 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 300 mikrolitre taze mTeSR1 ortamı ekleyin.
Sonra plakayı tekrar inkübatöre koyun. Stok insan pluripotent kök hücrelerini inkübatörden çıkarın. Kullanılmış ortamı çıkarın ve hücreleri bir mililitre steril DPBS ile bir kez yıkayın.
Daha sonra her bir oyuğa bir mililitre yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri ayırmak için altı ila sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin kolayca ayrılabildiğinden emin olmak için plakaya hafifçe vurun. Ardından, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek kaldırmak için bir P1000 ucu kullanın.
Ayrışmayı sonlandırmak için ROCK inhibitörü ile iki mililitre mTeSR1 ortamı ekleyin. Süspansiyonu iyice karıştırın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri üç dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.
Daha sonra süpernatanı çıkarın ve hücreleri ROCK inhibitörü ile iki mililitre mTeSR1 ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. Her nükleofeksiyon reaksiyonu için 800.000 ila 1 milyon hücreyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.
Sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin. İnsan kök hücre nükleofeksiyon kitinden 100 mikrolitre karışık nükleofeksiyon çözeltisi içinde eşleştirilmiş Cas-9n tek kılavuz RNA ekspresyon plazmitlerinin üç mikrogramını ve beş mikrogram hedefleme vektör plazmitini karıştırın. Bir GFP kontrol plazmid karışımı da hazırlayın.
Hücreleri DNA karışımı ile yeniden süspanse edin ve hava kabarcıklarını önlemek için bir elektroporasyon küvetine aktarın. İnsan pluripotent kök hücreleri için optimize edilmiş koşulu kullanarak hücreleri nükleofeksiyon cihazı ile elektropoze edin. Elektroporasyonlu hücrelere hemen 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze ve ılık mTeSR1 ortamı ekleyin.
Daha sonra karışımı önceden hazırlanmış 24 oyuklu plakanın iki kuyucuğuna aktarın. Hücrelerin iyileşmesini sağlamak için plakayı% 5 karbondioksit ile sağlanan 37 santigrat derece inkübatöre koyun. Hücre bakım ortamını 12 ila 16 saat sonra değiştirin, hücreler hücreden hücreye temas kurarsa ROCK inhibitörünü geri çekin.
24 ila 48 saat sonra, kontrol hücrelerinde GFP ekspresyonunu inceleyerek nükleofeksiyon verimliliğini kontrol edin. Nükleofeksiyondan 48 saat sonra, mTeSR1 ortamını mililitre puromisin başına bir mikrogram ile takviye ederek hücreleri seçmeye başlayın. 72 saat sonra, ortamı mililitre puromisin başına 0.5 mikrogram ile destekleyin.
Hücre birleşmesi% 30'dan düşükse, ortamı 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile de destekleyin. Nükleofeksiyon geçişinden dört ila altı gün sonra, puromisine dirençli hücreler, kuyucuk başına 0.8 hücre konsantrasyonunda 10 ila 15 96 oyuklu plakaya. Ortamı ROCK inhibitörü ve puromisin ile takviye ettiğinizden emin olun.
Tek hücreli türetilmiş koloniler oluşturmak için hücreleri 10 ila 12 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 10 karbondioksitte tutun. Tohumlamadan yedi gün sonra ortamı doldurun. Tek bir koloni içeren kuyucukları işaretleyin ve ortamı, mililitre puromisin başına 0.5 mikrogram içeren, ancak ROCK inhibitörü içermeyen taze mTeSR1 ortamı ile değiştirin.
Hücreleri iki gün daha 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyütün. Daha sonra farklılaşmamış koloniler içeren kuyular için ortamı değiştirin. Kolonileri nazikçe sıyırın ve hücre süspansiyonunu bir koloniden ayrı 96 kuyucuklu plakalar üzerindeki iki yeni kuyuya aktarın.
Biri genotipleme için, diğeri bakım için. Genotipleme hücrelerinin birleşmesi% 50 veya üzerine ulaştığında, harcanan ortamı boşaltın ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın. Hücreleri Bradley Lysis Buffer ile parçalayın ve her kuyucuktan genomik DNA'yı izole edin.
Üç primer bağlantı PCR gerçekleştirdikten ve ürünleri sıraladıktan sonra, kolonileri doğru genotiple tutun ve geri kalanını atın. Sürekli puromisin seçimi altında doğru kolonileri genişletin ve mümkün olan en erken geçişte dondurun. Bu protokol, hepatosit nükleer faktör dört alfa geninin Ekson8'ine iki nokta mutasyonu eklemek için kullanıldı.
Doğru hedeflenmiş hücreleri taramak için üç primer tabanlı bir PCR yöntemi kullanıldı ve PCR sonuçlarını doğrulamak için Sanger dizilemesi yapıldı. Seçim kasetinin çıkarılmasından sonra, istenen nokta mutasyonlarının doğru şekilde yerleştirildiğini doğrulamak için modifiye edilmiş bölge tekrar sıralandı. Doğru genotipe sahip koloniler seçildi ve hücreler daha fazla analizden önce karakterize edildi.
Düzenlenen hücreler, ebeveyn hücrelerle aynı morfolojiye sahiptir ve transkripsiyon faktörleri Nanog ve Oct4'ün yanı sıra hücre yüzeyi belirteçleri, SSEA-4 ve TRA-160 dahil olmak üzere temsili insan pluripotent kök hücre belirteçlerini eksprese eder. Bu prosedürü denerken, ilk 24 saat boyunca puromisin seçiminden sonra hücre birleşmesini kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Medyanı ROCK inhibitörü ile takviye etmek esastır.
Hücre birleşmesi %30'dan düşüksehücrelerin devam etmesini sağlamak için. Genom düzenlenmiş pluripotent kök hücre hatları oluşturulduktan sonra, gen fonksiyonunu veya yönlendirilmiş farklılaşmayı incelemek için kullanılabilirler. Bu teknik, araştırmacıların genlerin spesifik işlevi veya genetik hastalık için hedeflenen gen düzeltmesi gibi farklı soruları incelemelerinin yolunu açıyor.
Genel Bakış
Bu makale, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 niktaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde sorunsuz gen düzenlemesi için detaylı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, insan embriyonik kök hücrelerindeki HNF4α lokusuna iki nokta mutasyonunu başarıyla tanıtmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen Düzenleme
- Kök Hücre Biyolojisi
- Genomika
Arka Plan
- İnsan pluripotent kök hücrelerinde gen düzenleme karmaşıktır.
- Eşli Cas9 niktaz güvenilir bir düzenleme yöntemi sağlar.
- Sorunsuz genomik düzenleme, hassas modifikasyonlar için avantajlıdır.
- Başarılı düzenleme için etkili genotipleme taraması kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- İnsan pluripotent kök hücrelerinde hassas gen düzenleme yöntemi geliştirmek.
- HNF4α geninde spesifik mutasyonları tanıtmak.
- Düzenlenmiş hücrelerin seçiminin verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Rekombinant laminin yüzeylerinde kök hücrelerin muhafazası.
- Hücrelerin Cas9 ve hedeflendirilmiş vektör plazmitleri ile nükleotransfeksiyonu.
- Başarılı düzenlemelerin yapıldığı hücreleri izole etmek için puromisin seleksiyonu kullanımı.
- Başarılı düzenlemeleri doğrulamak için genotipleme ve dizileme.
Ana Sonuçlar
- HNF4α lokusuna iki nokta mutasyonu başarıyla tanıtıldı.
- Hücreler düzenleme sonrası pluripotent özelliklerini korudu.
- Verimli seçim ve genotipleme yöntemleri kuruldu.
- Düzenlenmiş hücreler kilit pluripotent belirteçlerini ifade etti.
Sonuçlar
- Protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde hassas gen düzenlemesini sağlar.
- Gen fonksiyonu ve farklılaşma çalışmaları için bir temel sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar, gelişimdeki spesifik gen rollerini araştırmayı içerir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Seamless genome editing in human pluripotent stem cells enables precise interrogation of gene function and disease modeling at the earliest stages of drug discovery. The protocol's efficiency and reliability in introducing point mutations at the HNF4α locus support high-confidence target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical research, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise introduction of disease-relevant mutations for functional genomics studies.
- Supports robust target validation by generating isogenic cell lines with defined genetic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function in human cellular contexts.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined cell systems for assay development and compound screening.
- Ensures reproducibility and standardization through seamless editing and rigorous genotyping.
- Enables quantitative readouts by confirming precise genomic modifications via PCR and sequencing.
- Supports scalable generation of cell lines for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cell models with disease-relevant genotypes for translational biomarker studies.
- Maintains pluripotency and differentiation potential, supporting continuity into preclinical validation.
- Reduces biological risk by confirming genetic and phenotypic fidelity of edited lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated genetic models.
Pipeline & Workflow Integration
This genome editing protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless transition from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene modification.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell lines for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Provides robust genotyping and sequencing outputs for confident comparison of edited versus parental lines.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by generating models with disease-relevant mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating custom-edited pluripotent stem cell lines across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection, and molecular genotyping.
- Needs access to electroporation devices, high-quality plasmids, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell handling and selection protocols.
- Adaptation may be needed for different gene targets or cell line backgrounds.
- Cell viability and confluency must be closely monitored during selection and expansion phases.
