Name: Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Keşfedin sıfır mod dalga kılavuzlarının nanoküre litografisi ile imalatını. Bu düşük maliyetli yöntem, tek moleküllü görüntüleme için biyolojik olarak uygun floresan reaktif konsantrasyonlarında çalışmalar yapmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibeleri R01GM080376, R35GM118139 ve NSF Mühendislik Merkezi MechanoBiology CMMI: 15-48571'den Y.E.G.'ye ve NIAID doktora öncesi NRSA bursu F30AI114187'den R.M.J.'ye desteklendi.

NOT: Tüm adımlar genel laboratuvar alanında tamamlanabilir.
1. Cam kapak temizliği
<ol><li>Kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı birikmesi için temiz bir yüzey sağlamak için, temizlik için coplin cam boyama kavanozunun yivli kesici uçlarına 24 x 30 mm optik borosilikat cam kapak örtüleri (0,16−0,19 mm kalınlık) yerleştirin. NOT: Temizlik işlemi sırasında tüm yüzeylerin net bir şekilde açığa çıkması için kapakların dik durduğundan ve iyi ayrıldığından emin olun.</li>
	<li>Boyama kavanozuna örtüleri örtecek, kapağı yerize edecek ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate edecek kadar aseton dökün.</li>
	<li>Asetonu dökün ve boyama kavanozuna damıtılmış H2O doldurup suyu dökerek kapakları durulayın. 2 kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Aseton sonication (adım 1.2 ve 1.3) bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>40 ° C'de 20 dakika boyunca örtüleri ve sonikatı kaplayacak kadar kavanoza 200 mM KOH dökün. NOT: KOH camı hafifçe etches.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış H 2 Oile 6kez durulayın.</li>
	<li>Kapakları örtmek için etanol ekleyin, kapağı ekleyin ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış H ile2O 3 kez durulayın.</li>
	<li>Yumuşak tokparlaplar kullanarak her kapak kapağını kenardan alın ve kapakları N2 gazı ile kurutun. Sadece kapak ucunun kenarlarına dokunun. Kurutulmuş, temizlenmiş kapak örtülerinin her birini ayrı bir temiz Petri kabına yerleştirin.</li>
</ol>2. Polistiren boncukların buharlaştırıcı birikmesi
<ol><li>ZMW dizisi için kolloidal kristal maske oluşturmak için, 1 μm çapında 50 μL santrifüj, 15.000 x g,25 °C'de 5 dakika boyunca işlevsel olmayan polistiren boncuklar (suda% 2,5 w/ v). NOT: Boncukları pipetlemeden önce, boncukların şişenin dibine yerleşmesi durumunda stok çözeltisi kısa bir süre girdaplanmalıdır.</li>
	<li>Mümkün olduğunca az su bırakarak süpernatant atın. NOT: Artık su etanol resüspenzyon39buharlaşma özelliklerini değiştirebilir, bu nedenle tüm suyu çıkarmak için az miktarda boncuk çıkarılması kabul edilebilir.</li>
	<li>Boncukları adım 2.2'den 1:400 TritonX-100:etanol çözücünün 50 μL'sinde yeniden atın. Pipet, boncukları çözücü ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı. NOT: TritonX-100:etanol çözücü kullanımdan sonra parafin filmi ile kapatılmalı ve ayda bir kez taze olarak hazırlanmalıdır. Boncuklar, mikrosantrifüj tüpü gibi plastik bir kabın kenarlarına yapışma eğilimindedir, bu nedenle tüm boncukların yeniden dirilmesini sağlamak için yanlar boyunca pipet.</li>
	<li>Biriktirme için bir nem odası kurmak için, her biri bir kapaklı 6 Petri kabını, kapakları biraz aralık bırakılmış bir çizgide bir bankın üzerine yerleştirin. Her yemekte, bir sonraki adımda nem arttığında kapak örtülerinin ortama maruz kalabilmesi için kapakçığı açık bölgeye taşıyın.</li>
	<li>Petri tabaklarının arkasına bir higrometre ve küçük bir elektrikli fan yerleştirin.</li>
	<li>Laboratuvarda başlangıç bağıl nemini (RH) kaydedin. 200 mL'lik bir kabı 150−200 mL ~75 °C su ile doldurun ve fanın arkasına yerleştirin.</li>
	<li>Fanı açın ve Petri kaplarını, fanı, kabı ve higrometreyi devrilmiş, şeffaf bir plastik saklama kabıyla (66 cm x 46 cm x 38 cm) örtün.</li>
	<li>Haznedeki RH'nin %70−75'e yükselmesine izin verin, bu da tipik olarak 5−10 dakika sürer. NOT: Ortam laboratuvarı RH'si düşükse (~%50'nin altında), biriktirme sırasındaki nem kaybını telafi etmek için odanın daha yüksek bir RH'ye ulaşmasını, ancak% 80'den yüksek olmamasını sağlar (aşağıya bakın).</li>
	<li>RH% 70−75'e ulaştığında, RH'yi kaydedin ve plastik saklama kabını hafifçe kaldırarak petri kaplarına kapakları hızlı bir şekilde yerleştirin, bu da kapakların aşırı ıslanmasını önler. NOT: Haznedeki sıcaklık, nemlendirme sonucu oda sıcaklığından biraz daha sıcak olacaktır, tipik olarak 25−26 °C. Kapaklarda nem görünüyorsa, cam yüzeyler çok ıslaktır. Ticari bir torpido gözü protokolün bu bölümünü basitleştirebilir.</li>
	<li>Odadaki RH%85'e yükselmeye devam etsin. Bu noktada, RH'yi nem haznesine kaydedin ve boncuk süspansiyonunun pipeti 5 μL'yi her kapak kapağının ortasına kaydedin.</li>
	<li>Nem kaybını en aza indirmek için her biriktirmeden sonra odayı ve Petri tabaklarını kapatın. 2 dakika içinde tüm 6 ifadeleri bitirmek hedefleyin.</li>
	<li>İfadeden sonra RH'yı hazneye kaydedin. NOT: Biriktirmeden sonraki RH, ortam laboratuvarı koşullarına bağlı olarak biriktirme sırasında nemin ne kadar hızlı kaybolduğunu ölçmeye yardımcı olacaktır. Tipik bir başarılı çalışma için, oda ifadeden önce% 85 RH'den başlayacak ve ifadeden sonra% 70−75 RH'de sona erecektir.</li>
	<li>Boncuk damlacıklarının yayılmasına ve 5 dakika kurumasına izin verin. NOT: Kolloidal kristallerin çok sayıda deliği veya çok katmanlı bölgesi varsa, oda sırasıyla çok nemli veya kuruydu. Petri kaplarını kapatmak ve ifadelere başlamak için bağıl nemi ayarlayın (optimizasyonun daha fazla tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın).</li>
</ol>3. Kolloidal kristal şablonunda gözenek boyutunu azaltmak için boncuk tavlama
<ol><li>Boncuklar arası kesişme yerlerini daraltan ve interstices'in köşelerini yuvarlayan polistiren boncukların tavlama için düzgün bir sıcaklık yüzeyi sağlamak için, standart bir seramik sıcak plakanın üzerine düz, öğütülmüş bir alüminyum plaka yerleştirin.</li>
	<li>Sıcak plakanın sıcaklığını 107 °C'ye, polistirenin cam geçiş sıcaklığını40'aayarlayın. NOT: Kararlı ve doğru sıcaklık elde etmek için alüminyum plakada 2−3 mm genişliğinde ve 4−5 mm derinliğinde bir delikte bir termokuple probu tutulmuş.</li>
	<li>Sıcak alüminyum plakaya boncuk şablonunun ve 20 sn tavlamanın üzerine boncuk şablonunun bulunduğu bir kapak ucu yerleştirin (erime süresinin açıklanması için tartışma bölümüne bakın).</li>
	<li>Isıttıktan sonra, kapak kapağını alüminyum plakadan çıkarın ve soğutmak için derhal başka bir oda sıcaklığındaki alüminyum yüzeye yerleştirin. NOT: Kapakların teslim alımını kolaylaştırmak için kapak kapaklarının plakanın kenarına hafifçe asması veya sığ kanalları (beraberindeki videoya bakın) plakaya asması yararlıdır.</li>
</ol>4. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak alüminyum sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu
<ol><li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, boncuklar arasındaki kafeslerde direkler oluşturmak için kolloidal kristal şablonun üzerine 2 Å/sn'de 300 nm bakır biriktirin.</li>
	<li>Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun. NOT: Bant çekildikten sonra bazı küçük yansıtıcı fazla metal lekeleri kalabilir ve bunlar genellikle N2 gazı akışı ile çıkarılabilir. Bant çekildikten sonra önemli yansıtıcı fazla metal lekeleri kalırsa, polistiren boncukları kısmen çözmek için şablonları 2 saat boyunca toluen içine çekmeyi deneyin. Kapakları damıtılmış suyla yıkayın, N2ile kurulayın ve bant çekmesini tekrarlayın. Boncuklar bant çekme sırasında direkleri hasardan korumaya yardımcı olduğu için ek ıslatma boncukları tamamen çözmemelidir.</li>
	<li>Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın. DİkKAT: Toluen dumanı toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında toluen ile çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Toluen yanıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Hassas 200−300 nm boyundaki metal direkler artık açığa çıktığı için bu noktada kapak örtülerini dikkatlice tutturun. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer ve kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın. DİkKAT: Kloroform dumanlar toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında kloroformla çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Kloroform, diğer yanıcı çözücülerden uzakta havalandırılmış dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından bakır direklerin etrafında ve üstünde 4 Å/s'de 100−150 nm alüminyum biriktirin. NOT: Daha derin kılavuzlar ve arka plan floresanının daha iyi zayıflamasını elde etmek için daha kalın kaplamalar kullanılabilir, ancak bu aynı zamanda bir sonraki adımda gönderileri açığa çıkardıktan ve çözdükten sonra verimi azaltır (tartışma bölümüne bakın).</li>
	<li>Metal direkleri çözmek için, kapakları bakır etchant (sitrik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 2 saat boyunca. DİkKAT: Metal etchant cilt yanıklara neden olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında etchantlarla çalışın ve koruyucu ekipman giyin. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Metal etchant, aşındırıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 2 saat daha bakır vbhant içine yerleştirin, sonra damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın. NOT: ZMW slaytlar, kirleticilerden uzak tutmak için kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.</li>
</ol>5. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak altın sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu
NOT: Alüminyum ZMWs imal protokolü yansıtan altın ZMWs(Ek Şekil 1)imal yöntemi bu bölümde verilmiştir.
<ol><li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından 4 Å/s'de 300 nm alüminyum biriktirin.</li>
	<li>Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.</li>
	<li>Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.</li>
	<li>Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.</li>
	<li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirmeyi kullanarak, alüminyum direklerin etrafında ve üstünde 5 Å/s'de 100−150 nm altın biriktirin.</li>
	<li>Metal direkleri çözmek için, kapakları alüminyum etchant (fosforik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 1 saat boyunca.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 1 saat boyunca alüminyum vbhant içine geri yerleştirin, ardından damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın. NOT: ZMW slaytlar kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kolloidal kendi kendine montaj için (protokol bölüm 2), süspansiyon çözücü olarak su yerine etanol kullanımı buharlaşma işlemini hızlandırır, böylece şablonlar önceki yöntemlerde olduğu gibi 1−2 saat yerine 2−3 dakika içinde hazırlanır48,49. Burada sunulan evaporatif sedimentasyon protokolü, süspansiyon49,50,51'inüzerindeki yüzey eğimini, sıcaklığı ve hava hacmini kontrol etmeyi gerektiren önce...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) veya tek moleküllü floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) gibi tek moleküllü teknikler moleküler biyofizik için güçlü araçlardır, transkripsiyon1, 2 ,3, çeviri4,5,6ve diğerleri gibi süreçlerde bireysel biyomoleküllerin dinamik hareketlerinin, konformasyonlarının ve etkileşimlerinin incelenmesine izin verir7. SmFRET için, total iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi yaygın bir yöntemdir, çünkü birçok bağlı molekül zamanla takip edilebilir ve TIR tarafından oluşturulan evanescent dalgası kapak8'ebitişik 100−200 nm bölgesi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, ekscitasyon hacmindeki bu kısıtlamaya rağmen, arka plan floresanının üzerindeki tek molekül sinyallerini tespit etmek için ilgi flüforlarının pM veya nM aralıklarına seyreltilmesi gerekir9. Hücresel enzimlerin Michaelis-Menten sabitleri tipik olarak μM ila mM aralığında10olduğundan, tek molekül çalışmalarında biyokimyasal reaksiyonlar genellikle hücredekilerden çok daha yavaştır. Örneğin, protein sentezi E. coli11 , 12'de saniyede15−20amino asittegerçekleşirken,smFRET deneylerindeki prokaryotik ribozomların çoğu saniyede 0.1−1 amino asitte tercümeedilir 13. Protein sentezinde, duran ribozomlardaki kristal yapılar ve smFRET, transfer RNA'larının (tRNA'lar) tRNA-mRNA translokasyon adımı14,15'denönce 'hibrit' ve 'klasik' durumlar arasında dalgalanarak dalgalandırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, translokasyon GTPase faktörüNÜN fizyolojik konsantrasyonları ef-G mevcut olduğunda, smFRET6'damelez ve klasik durumlar arasında orta olan farklı bir konformasyon gözlenmiştir. Dinamik moleküler süreçleri hücredekilere benzer oranlarda ve konsantrasyonlarda incelemek önemlidir, ancak teknik bir zorluk olmaya devam etmektedir.
Floresan substrat konsantrasyonunu artırmaya yönelik bir strateji,16 diyafram açıklıkları içinde lokalize biyomolekülleri seçici olarak heyecanlandıran sınırlı uyarlama alanları oluşturmak için sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen metal bazlı, alt görünür dalga boyu diyaframlarının kullanılmasıdır (Şekil 1). Diyafram açıklıkları tipik olarak 100−200 nm çapında ve 100−150 nm derinlik17' dir. Kuyuların büyüklüğü ve şekli ile ilgili bir kesme dalga boyunun üzerinde (φc ≈ dielektrik orta 18 olarak su ile dairesel dalga kılavuzları için çapın2,3katı), dalga kılavuzunda yayılma modlarına izin verilmez, bu nedenle sıfır mod dalga kılavuzları terimi. Bununla birlikte, salınımlı bir elektromanyetik alan, evanescent dalgası olarak adlandırılan, yoğunlukta katlanarak çürüyen hala dalga kılavuzuna kısa bir mesafe tüneller18,19. TIR evanescent dalgalarına benzer olmasına rağmen, ZMW evanescent dalgaları daha kısa bir çürüme sabitine sahiptir ve bu da dalga kılavuzu içinde 10−30 nm etkili bir eksitasyon bölgesine neden olur. Floresan etiketli ligandların mikromolar konsantrasyonlarında, ekscitasyon bölgesinde aynı anda sadece bir veya birkaç molekül bulunur. Uyarım hacminin bu şekilde kısıtlanması ve bunun sonucunda arka plan floresanının azaltılması, tek moleküllerin biyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda floresan görüntülenmesini sağlar. Bu, tek protein difüzyon21'inFCS ölçümleri, düşük benzeşimli ligand-protein22'nintek moleküllü FRET ölçümleri ve protein-protein etkileşimleri23 ve tek moleküler devir olaylarının spektro-elektrokimyasal ölçümleri dahil olmak üzere birçoksisteme uygulanmıştır 24.
ZMW'ler, iyon ışın frezeleme25, 26veya elektron ışını litografisi (EBL) ve ardından plazma gravür16,27kullanılarak metal bir tabakanın doğrudan desenlenerek üretilmiştir. Bu maskesiz litografi yöntemleri seri olarak dalga kılavuzları oluşturur ve tipik olarak ZMW teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini önleyen özel nanofabrikasyon tesislerine erişim gerektirir. Başka bir yöntem, ultraviyole nanoimprint litografi lift-off28, ters bir ZMW şablonunu damga gibi bir direnç filmine bastırmak için kuvars slayt kalıbı kullanır. Bu yöntem daha aerodinamik olsa da, kuvars kalıbının imalatı için hala EBL gerektirir. Bu makalede, EBL veya iyon ışın frezeleme gerektirmeyen ve litografik bir maske oluşturmak için nanosferlerin yakın paketlenmesine dayanan basit ve ucuz şablonlu bir imalat yöntemi için protokol sunulmaktadır.
İlk olarak 1982 yılında Deckman ve Dunsmuir29,30tarafından önerilen nanosfer veya "doğal" litografi, malzemelerin gravür ve / veya biriktirme yoluyla yüzey deseni için şablonlar oluşturmak için onlarca nanometreden onlarca mikrometre31'ekadar değişen monodisperz kolloidal parçacıkların kendi kendine montajını kullanır. Kolloidal kristaller olarak adlandırılan kolloidal parçacıkların iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) genişletilmiş periyodik dizileri, saçılma ve kırınım32'denparlak bir yanardönerlik ile karakterize edilir. Elektron ışını veya fotolitografiden daha az yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu maskeleme metodolojisi basit, düşük maliyetlidir ve 100 nm'nin altında özellik boyutları oluşturmak için kolayca ölçeklendirilir.
Kolloidal parçacıkların kendi kendine birliğini yönlendirmek, kolloidal kristallerin yüzey desenleme için maske olarak kullanılmasının başarısını belirler. Parçacıkların boyutu ve şekli homojen ise, kolloidal parçacıklar entropik tükenme33tarafından tahrik edilen altıgen ambalaj ile kolayca kendi kendine monte edilebilir. Damla kaplamadan sonra su buharlaşması kolloidal parçacıkları tortulamak için etkili bir yoldur, ancak diğer yöntemler daldırmakaplama 34, spin kaplama35, elektroforetik biriktirme36ve hava-su arayüzünde konsolidasyon37içerir. Aşağıda sunulan protokol, uygulanması en basit olan buharlaşma sedimasyon yöntemine dayanmaktadır. Üçgen, yakın paketlenmiş polistiren boncuklar arasındaki kesişmeler, kurbanlık bir metalin kaplanacağı açıklıklar oluşturur, direkler oluşturur (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Bu adımdan önce boncukların kısa tavlanması, bu direklerin şeklini ve çapını ayarlar. Boncuklar çıkarılır, direklerin etrafına son bir metal tabaka biriktirilir ve ardından direkler kaldırılır. kolloidal nanoküme, ara direklerin çıkarılması ve pasivasyon ve bağlama için yüzey kimyası modifikasyonu üzerine iki metal biriktirme adımından sonra, ZMW dizileri tek molekül görüntüleme için kullanıma hazırdır. İmalat sonrası ZMW optik özelliklerinin daha kapsamlı karakterizasyonu, eşlik eden bir makalede bulunabilir38. Metallerin buhar biriktirmesi için bir termal evaporatör dışında, özel bir alet gerekmez.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. Cam Lamel Temizleme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coplin cam boyama kavanozu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td>8 oluklu ve kalıplanmış cam kapaklı boyama</td></tr><tr><td>kavanozu Lameller</td><td>VWR</td><td>48404-467</td><td>24 mm x 30 mm (No.1&frac12;, Dikdörtgen)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>1 L</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potasyum hidroksit</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80115TS</td><td>100 mm çap, 15 mm derinlik</td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson</td><td>Z245143</td><td>Masaüstü ultrasonik temizleyici, 5510</td></tr><tr><td><güçlü>2. Polistiren Boncukların Evaporatif Biriktirmesi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf saklama kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-8222</td><td>26 x 18 x 15 inç.</td></tr><tr><td>Masa fanı</td><td>O2Cool</td><td>FD05001A</td><td>Herhangi bir küçük masa (~ 5 inç) fanı çalışacaktır</td></tr><tr><td>Cam beher</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Nem ölçer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-661-19</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-903</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Polistiren mikro küreler</td><td>Polysciences</td><td>18602-15</td><td>1.00 ve mikro; m çapında, işlevselleştirilmemiş</td></tr><tr><td>Triton X-100 deturgent</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td><güçlü>3. Kolloidal Kristal Şablonda Gözenek Boyutunu Küçültmek için Boncuk Tavlama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA11062RY</td><td>14 cm x 14 cm</td></tr><tr><td>Seramik ocak</td><td>gözü Fisher Scientific</td><td>HP88857100</td><td>13 x 8,2 x 3,8 inç</td></tr> olacak şekilde şirket içinde özelleştirilmiştir.<tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>McMaster-Carr</td><td>38615K71</td><td>Termokupl probu ile sıcaklık okuma</td></tr><tr><td>Termokupl probu</td><td>McMaster-Carr</td><td>9251T93</td><td>Tip K, yüzey probu</td></tr><tr><td><güçlü>4/5. Kolloidal Kristal Şablonu Kullanarak Sıfır Modlu Dalga Kılavuzlarının Nanofabrikasyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum dağlayıcı</td><td>Transen</td><td>Tip A</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum peletler</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAL40QXHB</td><td>Elektron ışını buharlaşması için</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bakır dağlayıcı</td><td>Transen</td><td>49-1</td><td></td></tr><tr><td>Bakır peletler</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMCU40QXQA</td><td>Elektron ışını buharlaşması için</td></tr><tr><td>Altın peletler</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAUXX40G</td><td>Elektron ışını buharlaşması için</td></tr><tr><td>Lens kağıdı</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Scotch bant</td><td>Zımba</td><td>MMM119</td><td></td></tr><tr><td>İnce film biriktirme sistemi</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD-75</td><td>Masaüstü termal buharlaştırma sistemi de işe yarayacak</td></tr><tr><td>Titanyum peletler</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMTI45QXQA</td><td>Elektron ışını buharlaşması için</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma</td><td>244511</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Temsili Sonuçlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Modeling Yazılımı</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift Görünümlü spektral ayırıcı</td><td>Photometrics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek konsantrasyonlı tek moleküllü mikroskopi için sıfır mod dalga kılavuzlarının İmalatı

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Tek moleküllü floresan enzimolojisinde, çözeltideki etiketli substratlardan gelen arka plan floresanları genellikle florofor konsantrasyonu ile piko- nanomolar aralıkları, birçok fizyolojik ligand konsantrasyonundan daha az büyüklük sırasını sınırlar. Alüminyum veya altın gibi ince iletken bir metalde üretilen 100−200 nm çapında diyafram açıklıkları olan sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen optik nanoyapılar, görünür ışık eksiltmeyi zeptoliter etkili hacimlere hapsederek floroforların mikromoler konsantrasyonlarında tek tek moleküllerin görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, pahalı ve özel nanofabrikasyon ekipmanına duyulan ihtiyaç, ZMW'lerin yaygın kullanımının önüne geçmektedir. Tipik olarak, ZMWs gibi nanoyapılar, sıralı ve yavaş olan elektron ışını litografisi kullanılarak doğrudan yazılarak elde edilir. Burada kolloidal veya nanosfer litografi, dalga kılavuzu imalatı için nanometre ölçeğinde maskeler oluşturmak için alternatif bir strateji olarak kullanılır. Bu rapor, yaklaşımı her aşama için pratik hususlarla ayrıntılı olarak açıklar. Yöntem, son dalga kılavuzu çapları ve derinlikleri 100−200 nm olan binlerce alüminyum veya altın ZMW'ın paralel olarak yapılmasına izin verir. Metal biriktirme için sadece ortak laboratuvar ekipmanı ve termal evaporatör gereklidir. Bu yöntem, ZMW'leri biyokimyasal topluluk için daha erişilebilir hale getirerek, moleküler süreçlerin hücresel konsantrasyonlarda ve oranlarda incelenmesini kolaylaştırabilir.

Polistiren kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı sedimansasyon yoluyla kendi kendine montajı (adım 2.1−2.13), çözücü buharlaşma hızının kontrol edilmesi gerektirdiğinden bir dizi sonuç üretebilir. Bununla birlikte, ifadeler hızlı olduğundan (tur başına 10−15 dk), prosedür farklı ortam laboratuvarı koşulları için hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Şekil 3A, biriktirme ve buharlaşmadan sonra iyi biçimlendirilmiş bir kolloidal şablon gösterir. Makroskopik olarak, boncukların bölgesi daires...

Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

Sıfır modlu dalga kılavuzları üretmek için burada sunulan nanosfer litografi protokolü, herhangi bir özel üretim aracı veya tesisi gerektirmeyen erişilebilir, düşük maliyetli bir yöntemdir. Bu yöntem, tek molekül biyofiziği için faydalı olacak ve daha fazla araştırmacının biyolojik olarak ilgili floresan reaktif konsantrasyonlarında tek molekül deneyleri yapmasına izin verecektir. Kolloidal parçacıkların buharlaşarak biriktirilmesi için temiz bir yüzey oluşturmak için, optik borosilikat cam lamelleri bir Coplin cam boyama kavanozunun yivli eklerine yerleştirin.Boyama kavanozunu, lamelleri kaplayacak kadar asetonla doldurun ve kavanozun üzerini kapatın. Kavanozu 40 santigrat derecede 10 dakika boyunca sonikleştirin. Asetonu dökün ve lamelleri damıtılmış suyla üç kez durulayın.Sonikasyon ve asetonu tekrarladıktan sonra, kavanozu lamelleri kaplamak için yeterli potasyum hidroksit ile doldurun. Kavanozu tekrar sonikasyon, üstü kapalı, 40 santigrat derecede 20 dakika boyunca. Lamelleri altı kez damıtılmış suyla durulayın, ardından 40 santigrat derecede 10 dakika boyunca etanolde sonikleştirin.Lamelleri damıtılmış su ile üç kez yıkadıktan sonra, her bir lameli forseps kullanarak kenarlar

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz serbest duran mikroküreler ve on-chip microtoroids dahil silika rezonans kaviteler, imal etmek, bir karbondioksit lazer reflow tekniğinin kullanımı açıklanır. Reflow yöntemi her iki cihaz içinde uzun foton yaşamlar sağlayan, yüzey kusurları kaldırır. Çıkan cihazlar telekomünikasyon gelen biodetection kadar uygulamaları sağlayan, ultra yüksek kalite faktörleri var.

Silika Ultra Yüksek Kalite Faktörü Microresonators Fabrikasyon

Bir yivli paralel plaka dalga geometrisine göre Terahertz frekansları için bir kırılma endeksi algılayıcı uygulanması için işlem burada tarif edilmektedir. Yöntem dalga yapısının rezonans frekansındaki kaymalar izlenmesi yoluyla sıvı küçük bir hacim kırılma indeksi ölçümü...

Paralel plaka Waveguide Sensor Kullanımı Terahertz Mikroakışkan Algılama

Fotonik kristal yavaş ışığın dalga kılavuzları ve boşlukların kullanımı yaygın olarak pek çok farklı uygulamada fotonik topluluğu tarafından kabul edilmiştir. Bu cihazların Bu nedenle imalat ve karakterizasyonu büyük bir öneme sahiptir. Interferometrik (dalga kılavuzları) ve rezonans saçılması (kaviteler): Bu kağıt, yani bizim üretim tekniği ve iki optik karakterizasyon yöntemleri, özetliyor.

Fotonik Kristal Yavaş Işık Dalga Kılavuzları Ve Çürükler Üretimi ve Karakterizasyonu

Floresan çekirdekli microcavity sensörler silika mikrokapilerler kanal yüksek indeks kuantum nokta kaplama kullanır. Kılcal kanal neden içine pompalanan akışkan kırılma indisi değişiklikler kanal orta analiz etmek için de kullanılabilir microcavity floresan spektrum içinde kayar.

Refraktometrik Algılama Floresan çekirdekli mikro kavitasyonlar sentezi ve İşletilmesi

Nanodetection için istenmeyen lazer seğirme gürültü çıkarmak için tasarlanmış bir referans interferometresi tekniği, ultra-yüksek kalite faktörü microcavity tarama için kullanılır. Montajı, kurulumu ve veri toplama için Talimatları kavite kalite faktörünü belirlemek için ölçüm işlemi yanında, sağlanmaktadır.

Nanodetection için bir referans Interferometer Uygulanması

Üçüncü dereceden optik doğrusal olmayan duyarlılık ile ilgili doğrusal olmayan olayların etkili nesil Χ (3) triply rezonans silis mikrosferlerdeki etkileşimler bu yazıda sunulmuştur. bildirilen burada etkileşimler şunlardır: Uyarılmış Raman saçılması (SRS) ve Uyarılmış Anti-Stokes Raman Saçılma (SARS) içeren dört dalga karıştırma işlemleri.

Mikrosferik Whispering Galeri Modu Rezonatörler içinde Uyarılmış Stokes ve Antistokes Raman saçılması

Biz Femtosaniye lazer kaynaklı ablasyon kullanılarak subwavelength çapı silis lifleri (optik nanolifler) 1-D fotonik kristal boşlukları imal edilmesi için bir protokol mevcut.

Femtosaniye Lazer kaynaklı Ablasyonu kullanarak nanolif 1-D Fotonik Kristal Kavitenin Fabrikasyon

Manyetik mikro - ve taşınımı manyetik girdaplar transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve manyetik iletim x-ray mikroskobu (MTXM) çalışmaları için uygun şekillendirme spin yapılandırmalarla imalatı için bir protokol sunulmuştur.

Silikon nitrür membranlar üzerinde manyetik nanoyapıları imalatı transmisyon mikroskopisi teknikleri kullanarak manyetik girdap etütler

Ayrıntılı bir talimat nasıl son derece eğimli kurmak için kiremit (HIST) mikroskop ve onun kullanım için tek molekül düşsel süpürüldü açıklanmıştır.

Son derece eğimli oluşturmak için bir kılavuz döşeme mikroskop genişletilmiş görünümü alan tek molekül görüntüleme için süpürüldü.

Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Keşfedin sıfır mod dalga kılavuzlarının nanoküre litografisi ile imalatını. Bu düşük maliyetli yöntem, tek moleküllü görüntüleme için biyolojik olarak uygun floresan reaktif konsantrasyonlarında çalışmalar yapmanıza olanak tanır.

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı

Daha fazla video keşfet