Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı
12 Mayıs 2020
Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.
Sıfır modlu dalga kılavuzları üretmek için burada sunulan nanosfer litografi protokolü, herhangi bir özel üretim aracı veya tesisi gerektirmeyen erişilebilir, düşük maliyetli bir yöntemdir. Bu yöntem, tek molekül biyofiziği için faydalı olacak ve daha fazla araştırmacının biyolojik olarak ilgili floresan reaktif konsantrasyonlarında tek molekül deneyleri yapmasına izin verecektir. Kolloidal parçacıkların buharlaşarak biriktirilmesi için temiz bir yüzey oluşturmak için, optik borosilikat cam lamelleri bir Coplin cam boyama kavanozunun yivli eklerine yerleştirin.
Boyama kavanozunu, lamelleri kaplayacak kadar asetonla doldurun ve kavanozun üzerini kapatın. Kavanozu 40 santigrat derecede 10 dakika boyunca sonikleştirin. Asetonu dökün ve lamelleri damıtılmış suyla üç kez durulayın.
Sonikasyon ve asetonu tekrarladıktan sonra, kavanozu lamelleri kaplamak için yeterli potasyum hidroksit ile doldurun. Kavanozu tekrar sonikasyon, üstü kapalı, 40 santigrat derecede 20 dakika boyunca. Lamelleri altı kez damıtılmış suyla durulayın, ardından 40 santigrat derecede 10 dakika boyunca etanolde sonikleştirin.
Lamelleri damıtılmış su ile üç kez yıkadıktan sonra, her bir lameli forseps kullanarak kenarlarından nazikçe alın. Her lamel nitrojen gazı ile kurulayın ve her temiz, kuru lamel ve kendi Petri kabını yerleştirin. Bir mikron işlevselleştirilmemiş polistiren boncuklardan 50 mikrolitre santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve mümkün olduğunca az su bırakın. Boncukları 50 mikrolitre çözücü içinde tekrar süspanse edin, ardından pipetleyerek iyice karıştırın. Biriktirme için bir nem odası kurmak için, arka arkaya altı Petri kabı düzenleyin.
Her Petri kabına bir lamel yerleştirin ve kapakları çevreye maruz kalacak şekilde konumlandırılmış şekilde hafifçe aralık bırakın. Petri kaplarının arkasına bir higrometre ve küçük bir elektrikli fan ortalayın, ardından laboratuvardaki bağıl nemi kaydedin. 200 mililitrelik bir kabı yaklaşık 75 santigrat derecede 150 ila 200 mililitre su ile doldurun ve kabı fanın arkasına yerleştirin.
Fanı açın ve ardından Petri kaplarını, fanı, kabı ve higrometreyi ters çevrilmiş, şeffaf bir plastik saklama kabıyla örtün. Bağıl nem %70 ila 75'e ulaştığında, lamellerin aşırı ıslanmasını önlemek için plastik saklama kabını hafifçe kaldırın ve Petri kaplarının kapaklarını hızla kapatın. Haznedeki bağıl nem %85'e ulaştığında, her bir lamel ortasına beş mikrolitre boncuk süspansiyonu pipetleyin.
Biriktirmeden hemen sonra her bir Petri kabını kapatın ve biriktirmeler arasında her şeyi saklama kabının içinde tutun. Nem kaybını en aza indirmek için boncuk biriktirme işlemleri mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır. Birikintiler çok kuru veya ıslaksa, hazne nemi optimize edilmesi gereken en önemli değişkendir.
Altı biriktirmenin tümü tamamlandığında, haznedeki bağıl nemi kaydedin ve boncuk damlacıklarının beş dakika boyunca yayılmasına ve kurumasına izin verin. Polistiren boncukların tavlanması için düzgün bir sıcaklık yüzeyi sağlamak için, standart bir seramik sıcak plakanın üzerine düz, frezelenmiş bir alüminyum plaka yerleştirin ve sıcak plakanın sıcaklığını, polistirenin cam geçiş sıcaklığı olan 107 santigrat dereceye ayarlayın. Sıcak alüminyum plakanın üzerine boncuk şablonunu içeren bir lamel yerleştirin.
20 saniye tavladıktan sonra, lameli alüminyum plakadan çıkarın ve soğuması için hemen oda sıcaklığındaki bir alüminyum yüzeye yerleştirin. Termal buharlaşmalı biriktirme kullanarak, boncuk şablonlarını içeren lameller üzerine saniyede iki angstrom hızında 300 nanometre bakır biriktirin. Bu, boncuklar arasındaki boşluklarda direkler oluşturacaktır.
Boncuklardaki fazla bakırı çıkarmak için, yüzeye bir parça bant hafifçe bastırın ve ardından bandı yavaşça soyun. Polistiren boncukları, lamelleri toleune içine yerleştirerek ve gece boyunca bırakarak çözün. Kapak kızaklarını dikkatli bir şekilde tutarak, bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın.
Şablonları nitrojenle kurulayın. Artık polimer ve kirleticileri çıkarmak için bunları 30 dakika boyunca bir oksijen plazma temizleyicisine koyun. Termal buharlaşmalı biriktirme kullanarak, saniyede bir angstrom'da üç nanometre titanyum yapışma tabakası biriktirin, ardından bakır direklerin etrafında ve üstünde saniyede dört angstrom ile 100 ila 150 nanometre alüminyum biriktirin.
Bazı biriktirme birimlerinde otomatik olarak yapıldığı gibi, biriktirme sırasında numunelerin dönmediğinden emin olun. Bakır direkleri çözmek için, lamelleri iki saat boyunca bakır dağlayıcı içinde bekletin. Lamelleri damıtılmış suda duruladıktan sonra, nitrojenle kurulayın, ardından hala kaplamayla kaplı olan direkleri ortaya çıkarmak için yüzeyi lens kağıdı ile hafifçe parlatın.
Lamelleri iki saat daha bakır aşındırıcıda bekletin, ardından tekrar damıtılmış suyla durulayın ve nitrojenle kurulayın. Yüzey pasivasyonundan sonra, sıfır modlu dalga kılavuzu lameller, tek moleküllü görüntüleme için mikroakışkan akış odaları yapmak üzere çift taraflı yapışkan bant kullanılarak kuvars slaytlarla eşleştirilebilir. Kolloidal şablonun kendi kendine montajının başarısı kritik olarak bağıl neme bağlıdır.
İyi biçimlendirilmiş bir şablonda, boncukların bölgesi, opak çok katmanlı bir halka ile tanımlanan kenarlıklarla daireseldir. İyi biçimlendirilmiş şablonlarda, şablonların çoğu altıgen olarak yakın paketlenmiş boncuklar içermelidir. Evaporatif çökeltme sırasında sıkışma nedeniyle taneler arasında bazı kusurlar olacaktır.
Bakır birikimi ve polistiren boncukların çözünmesinden sonra, bakır direklerin çapı 150 nanometrenin altında olmalıdır. 300 nanometre bakır biriktirme derinliği için direkler yaklaşık 250 nanometre uzunluğundadır. Alüminyum kaplamanın biriktirilmesinden ve ardından bakır direklerin çözülmesinden sonra, dalga kılavuzları atomik kuvvet mikroskobu ile görünür olmalı ve yaklaşık 550 nanometre aralıklarla yerleştirilmelidir.
Polistiren şablonların 20 saniye boyunca tavlanması, görünür ışığın yayılmasını kesmek için yeterince küçük, 118 nanometre çapında alüminyum dalga kılavuzları üretti. Görüntüleme için tipik bir ZMW alanı, 40 x 80 mikronluk bir görüş alanında 3.000 dalga kılavuzu içerir. ZMW işlevselliğini test etmek için tek moleküllü FRET yapıldı.
Tek moleküllü FRET izleri, test edilen tüm ortam Cy5 florfor konsantrasyonlarında tespit edilebilirdi. Karşılaştırıldığında, tek moleküller yalnızca pikomolar ila düşük nanomolar konsantrasyonlara sahip TERF aydınlatmasında tespit edilebilir. Sıfır modlu dalga kılavuzu imalatından sonra, cihazlar, tek moleküllü görüntüleme sırasında spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak için polimerlerle pasifleştirilebilir.
Sıfır modlu dalga kılavuzlarının cam tabanları, tek molekül emisyonunu artırmak için hafifçe kazınabilir. Genel olarak, bu yeni sıfır modlu dalga kılavuzu üretim yöntemi, araştırmacıların hücredekilere daha yakın konsantrasyonlarda ve oranlarda transkripsiyon veya translasyon gibi dinamik biyokimyasal süreçleri daha kolay araştırmalarına olanak tanıyacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, floresan boyaların düşük konsantrasyonlarında tek molekül görüntülemesini sağlayan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemi açıklar. Yöntem, cam kapak üzerinde bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal öz-birleşimi kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyofizik
- Nanoteknoloji
- Tek molekül görüntüleme
Arka Plan
- Sıfır mod dalga kılavuzları, tek moleküllerin incelenmesi için gereklidir.
- Geleneksel üretim yöntemleri maliyetli olabilir ve özel aletler gerektirebilir.
- Bu yöntem süreci basitleştirmeyi amaçlar.
- Kolloidal öz-birleşim, nanoyapıların oluşturulması için umut verici bir tekniktir.
Çalışmanın Amacı
- Sıfır mod dalga kılavuzlarını üretmek için erişilebilir bir yöntem sunmak.
- Daha fazla araştırmacının tek molekül deneyleri yapmasını sağlamak.
- Biyolojik olarak alakalı konsantrasyonlardaki floresan reaktiflerle yapılan çalışmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Optik borosilikat cam kapakların kullanımı.
- Yüzey temizliği için asetonda sonikasyon.
- Kolloidal parçacıkların buharlaşma ile biriktirme.
- Görüntüleme için bir dalga kılavuzu şablonunun oluşturulması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem düşük maliyetlidir ve özel alet gerektirmez.
- Tek molekül görüntüleme için etkili dalga kılavuzları üretir.
- Araştırmacılar nano- ila mikromolar konsantrasyonlarda görüntüleme sağlayabilir.
- Protokol basit ve tekrarlanabilirdir.
Sonuçlar
- Bu nanosfer litografi yöntemi, tek molekül görüntüleme tekniklerine erişimi demokratikleştirir.
- Tek molekül biyofizik araştırmalarında yeni yollar açar.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemi biyolojideki çeşitli uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables single molecule imaging at micromolar fluorophore concentrations, overcoming a key limitation in biochemical assays where background fluorescence restricts usable concentrations to pico- to nanomolar ranges. By facilitating the study of molecular processes at cellular-relevant concentrations and rates, it supports more physiologically relevant target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The accessibility of this low-cost fabrication approach expands the utility of zero mode waveguides beyond specialized core facilities to broader biopharma R&D laboratories.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification by allowing single molecule observation at concentrations that reflect physiological ligand levels.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive nanofabrication equipment, making single molecule enzymology accessible to more discovery teams.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking through direct visualization of single molecule interactions under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a platform for preparing validated biological systems that enable reliable compound evaluation at higher, more relevant fluorophore concentrations.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through parallel fabrication of thousands of zero mode waveguides using common lab equipment.
- Scalability: Supports platform reuse and scalability for downstream screening workflows by generating uniform waveguide arrays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates the study of dynamic biochemical processes such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell, improving relevance to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of single molecule FRET signals at micromolar concentrations, which are unattainable with traditional total internal reflection fluorescence (TERF) illumination.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, single molecule readouts that clarify mechanism and reduce ambiguity in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, enabling biophysical characterization that informs compound selection and optimization prior to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by allowing direct observation of single molecule behavior in complex environments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanostructures with quantitative outputs that enable comparison of ligand binding or enzymatic activity across conditions.
- Analytics: Provides single molecule fluorescence and FRET readouts that offer high-resolution kinetic and mechanistic insights beyond ensemble averages.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling studies at near-physiological concentrations and molecular crowding conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fabrication capability that can be shared across departments, reducing dependency on external nanofabrication services.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct single molecule visualization.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput via parallel fabrication using accessible equipment like thermal evaporators and hot plates.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency and enables better go/no-go decisions by generating reliable biophysical data earlier in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic clarity that reduces late-stage attrition due to unexpected biological behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in colloidal self-assembly, thermal evaporation, and surface cleaning protocols.
- Depends on access to a thermal evaporator, hot plate, sonicator, and basic chemistry lab equipment for metal deposition and etching.
- Necessitates standardization of humidity-controlled bead deposition to ensure consistent waveguide template formation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different substrate materials or waveguide metals (e.g., aluminum vs. gold).
- Includes practical limitations such as sensitivity to relative humidity during bead self-assembly and the need for careful handling to avoid template defects.
