Yüksek Verimli Bir Elektrokemilüminesans 7-Plex Testi Aynı Anda Tip 1 Diyabet ve Çoklu Otoimmün Hastalıklar İçin Tarama
29 Mayıs 2020
7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.
Elektrokemilüminesans testi, Tip-1 diyabet ve otoimmün kriyo hastalığı, çölyak hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom-1 dahil olmak üzere diğer ilgili otoimmün hastalıkları aynı anda tarayabilir. Çok karmaşık ECR testi, tek bir kuyucukta 10'a kadar çoklu antikor testini birleştirerek yüksek verim, daha az kütüphane ve daha az geniş hacim gerektiren daha ucuz bir test ile sonuçlanır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir gönderi olan Xiaofan Jia olacak.
Karışık bir bağlayıcı bağlı antijen çözeltisi hazırlamak için, önce dama tahtası testine dayalı olarak her bir antijen için en uygun konsantrasyonu seçin ve biyotin ve rutenyum etiketli antijeni rasyonel çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Benzersiz biyotinile antijenlerin her birine farklı bağlayıcıları bağlamak için, 96 iyi oynanan bir test için, 240 mikrolitre uygun bir STREPTAVIDIN konjuge bağlayıcı ile 4 mikrolitre ilgilenilen biyotinillenmiş proteinler karıştırıldı. Daha sonra tüp başına 156 mikrolitre% 1 BSA ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, her tüpe 160 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika daha inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, her tüpten 400 mikrolitre bağlayıcı bağlı antijen çıkarın ve antijen süspansiyonlarının yedisini de tek bir tüpe çekin. Daha sonra karışıma 1.2 mililitre durdurma çözeltisi ve 4 mikrolitre Ru sülfo-NHS etiketli GAD65, TPO, tTg, ThG, Proinsülin interferon-alfa ve IA-2 antijeni ekleyin.
Serum örneklerini etiketli antijen karışımı ile inkübe etmeden önce, 96 oyuklu bir PCR plakasının oyuğu başına 15 mikrolitre serum ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon için her bir serum kuyucuğu ile 18 mikrolitre 0.5 molar asidik asidik asidik asit karıştırın. İnkübasyon sırasında, yeni bir 96 oyuklu PCR plakasının oyuğu başına 35 mikrolitre antijen ve 13 mikrolitre bir molar Tris tamponu ekleyin. İnkübasyonun sonunda, asitle muamele edilmiş serumun 25 mikrolitresini hemen antijen plakasının her bir oyuğuna aktarın.
Plakayı PCR tavan folyosu ile örtün ve plakayı bir saat boyunca oda sıcaklığında düşük hızda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Kuluçka süresinin sonunda, plakayı 18 ila 24 saat boyunca 4 santigrat dereceye yerleştirin. Tabağı buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
Daha sonra her bir kuyucuğa 150 mikrolitre% 3 bloker A-tamponu ekleyin. Tüm kuyucuklar tedavi edildiğinde, plakayı tavan folyosu ile örtün ve plakayı gece boyunca 4 santigrat derece buzdolabına koyun. Ertesi sabah, plakayı ters çevirin ve numuneleri yıkama başına kuyu başına 150 mikrolitre PBS-T ile üç kez yıkayın.
Kuyucukların hiçbirinde tampon kalmayana kadar plakayı hafifçe vurun. Her oyuğa 30 mikrolitre serum antijen inkübatı ekleyin. Tüm inkübatlar eklendiğinde, plakayı folyo ile örtün ve plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca düşük hızda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
İnkübasyonun sonunda, inkübatları fiske vurarak çıkarın ve gösterildiği gibi kuyucuk başına 150 mikrolitre PBS-T ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 150 mikrolitre okuma tamponu ekleyin ve plakayı bir plaka okuyucuda saniyede sayımlarla okuyun. Yeni teşhis edilen 1026 Tip-1 diyabet hastasından alınan geniş bir numune kohortunun bu analizinde, yedi artı elektro lüminesans testinden elde edilen oto antikor seviyeleri, karşılık gelen her bir yerleşik tek elektro lüminesans testinden ve karşılık gelen her bir tek standart radyo bağlama testinden ve ELISA'dan elde edilen seviyelerle karşılaştırıldı.
Test spesifiklikleri, 95. persentilin kullanıldığı tiroid oto antikorları hariç, tüm oto-antikor testleri için 99. persentillerde aynıydı. Yedi oto antikorun her biri için az sayıda uyumsuz numune, her bir test için kesme noktalarının sınır çizgisi çevresinde bulundu. Burada, her bir tahlil için 1022 sağlıklı kontrol için karşılık gelen veriler gözlemlenebilir.
Hatırlanması gereken en önemli şey, benzersiz biyotinile antijenlerin her birine farklı bir bağlayıcı bulmak ve her bir antijeni konjuge bağlayıcı sağlama özellikleriyle karıştırmaktır. Bu tahlil tekniği, araştırmacıların büyük ölçekli popülasyonlarda aynı anda birden fazla otoimmün hastalık için tarama planlamasına ve kliniklerin Tip-1 diyabetli birden fazla ilgili hastalığı kolayca taramasına olanak tanıyacaktır.
Genel Bakış
Bu çalışma, Tip-1 diyabet ve çeşitli otoimmün hastalıkların eş zamanlı taramasına olanak tanıyan çoklu (multiplex) bir elektrokemilüminesans (ECL) analizini sunmaktadır. Bu analiz, çok sayıda otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirerek verimliliği artırmakta ve maliyetleri düşürmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Otoimmünite
- Tanı yöntemleri
- Elektrokemilüminesans analizleri
Arka Plan
- Tip-1 diyabet (T1D), sıklıkla diğer otoimmün hastalıklarla ilişkilendirilir.
- Geleneksel analizler birden fazla test gerektirebilir, bu da zaman ve maliyetleri artırır.
- Multiplex analizler tanı sürecini kolaylaştırabilir.
- Elektrokemilüminesans yüksek hassasiyet ve özgünlük sağlar.
Çalışmanın Amacı
- T1D ve ilgili otoimmün hastalıkların taranması için çoklu (multiplex) bir ECL testi geliştirmek.
- Çoklu testin performansını, yerleşik tekli testlerle karşılaştırmak.
- Klinik ortamlarda geniş ölçekli taramaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Karışık bağlayıcı-kuplenmiş antijen çözeltilerinin hazırlanması.
- Serum örneklerinin işaretli antijenlerle inkübasyonu.
- Yüksek kapasiteli tarama için 96 kuyucuklu plaka formatının kullanımı.
- T1D hastaları ve sağlıklı kontrollerdeki otoantikor seviyelerinin karşılaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Multiplex analiz, tekli analizlerle karşılaştırılabilir özgünlük göstermiştir.
- Kesme eşikleri yakınında az sayıda uyumsuz örnek tespit edilmiştir.
- Yeni teşhis edilmiş geniş bir T1D hasta kohortu için veri sağlanmıştır.
- Birden fazla otoimmün hastalık için verimli tarama imkanı sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Multipleks ECL analizi, eş zamanlı tarama için uygun bir araçtır.
- Bu yöntem, klinik uygulamalarda tanısal verimliliği artırabilir.
- Daha geniş popülasyonlarda ileri doğrulama yapılması önerilmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulanabilirlik Özeti
Tek bir kuyucukta birden fazla otoantikorun eş zamanlı tespiti, büyük ölçekli otoimmün hastalık taramalarındaki kritik bir darboğazı gidererek analiz karmaşıklığını ve kaynak tüketimini azaltır. Bu multipleks elektrokemilüminesans yaklaşımı, Tip 1 diyabet ve eşlik eden otoimmün durumlar arasında ilişkili biyobelirteç okumaları sağlayarak erken hastalık teşhisindeki öngörü güvenini artırır. Analiz, çoklu otoantikor profillerine dayalı verimli hasta stratifikasyonuna olanak tanıyarak immünoterapi geliştirmede portföy önceliklendirmesini ve mekanistik risk azaltmayı destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Preklinik modellerde otoantikor kümelerini hastalık endotipleriyle ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hastalıkla ilgili sistemlerde antijene özgü immün yanıtların fonksiyonel doğrulaması yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Yakınsak otoantikor imzalarına sahip hasta alt gruplarını tanımlayarak hedef seçimine olan güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yüksek tekrarlanabilirlik gerektiren sonraki tarama kampanyaları için standartlaştırılmış, kantitatif biyobelirteç panelleri hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kuyucuklar arasında tutarlı sıvı faz bağlanması sağlayan immobilize antijen-bağlayıcı kompleksler aracılığıyla analiz hazırlığı sunar.
- Ölçeklenebilirlik: Yeniden formatlama gerektirmeden, kuyucuk başına 10'a kadar otoantikoru taramak için platformun yeniden kullanımını kolaylaştırarak verimliliği artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Tip 1 diyabet ve komorbid otoimmün bozukluklarda klinik progresyonla ilişkili otoantikorları tespit ederek hastalıkla ilgili sistemlerle uyum sağlar.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Çoklu organ otoimmünitesini öngören, yüksek penetranslı otoantikor profillerine sahip hastaları belirleyerek devam/dur kararlarını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Adacık, tiroid, bağırsak ve interferon yolu otoantikorlarının eş zamanlı ölçümü yoluyla immün mekanizma yorumlamasındaki belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, çoklu otoantikor profillemesi yoluyla öncü bileşik tanımlama ve preklinik doğrulama aşamalarını bilgilendiren erken immün fenotiplemeyi mümkün kılarak, keşiften translasyona bir köprü görevi görür.
- Keşif Biyolojisi: Otoantikor ko-ekspresyon modellerini otoimmün patogenezdeki patojenik yolaklar ile ilişkilendirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tedavi koşulları veya genetik arka planlar arasında bağışıklık yanıtlarının karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif, tekrarlanabilir çıktılar sağlar.
- Analitik: Hasta ve kontrol kohortları arasındaki otoantikor seviyelerinin istatistiksel karşılaştırmasına imkan veren normalize edilmiş saniye başına sayım okumaları sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilişkili immün disregülasyonu yansıtan insan örneklerinde biyobelirteç panellerini doğrulayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Başlangıçtaki 7-plex konfigürasyonun ötesinde, diğer otoimmün veya inflamatuar hastalık panellerine uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir bir immünassay platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Eş zamanlı otoantikor ölçümü yoluyla yalancı negatifleri azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: İmmobilize antijen sunumu aracılığıyla kuyucuklar arası değişkenliği ortadan kaldırarak standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Yedi tanısal testi tek bir iş akışı adımında birleştirerek sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Biyobelirteçlerle tanımlanmış hasta popülasyonlarına dayalı olarak terapötik adayların riskle uyumlu önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Antijen immobilizasyonu için immünolojik analiz tasarımı ve bağlayıcı kimyası konusunda uzmanlık gerektirir.
- 96 kuyucuklu formatta elektrokemilüminesans deteksiyonuna uygun bir plaka okuyucuya bağımlıdır.
- Çok merkezli çalışmalar için bloklama ve yıkama protokollerinin merkezler arasında standardize edilmesini gerektirir.
- Orijinal yedi hedef dışındaki yeni otoantikor hedeflerine genişletilirken antijen konsantrasyonlarının adaptasyonunu gerektirir.
- Multiplex formatta çapraz reaktiviteyi önlemek için optimize edilmiş bağlayıcı-antijen çiftlerine olan ihtiyaçla sınırlıdır.
