Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi
14 Mayıs 2020
Burada sunulan, akustik ayırıcı kullanılarak CHO hücre kültürünün birincil netleştirilmesi için bir protokoldür. Bu protokol, sallama şişesi kültürlerinin veya biyoreaktör hasatlarının birincil netleştirilmesi için kullanılabilir ve perfüzyon biyoreaktör işlemleri sırasında hücre kanaması malzemesinin sürekli olarak açıklığa kavuşması için potansiyel bir uygulamaya sahiptir.
Protokolümüz, bir model monoklonal antikor içeren hasat edilmiş kültür sıvısından CHO hücrelerinin birincil olarak ayrılması için tezgah ölçekli bir akustik dalga ayırıcının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Akustik dalga ayırma, santrifüjleme ve filtreleme gibi geleneksel birincil arıtma yöntemlerine kıyasla küçük ayak izi, düşük kontaminasyon riski ve filtre kirlenme riskini azaltma gibi bazı avantajlar sağlar. Akustik dalga ayırma, sonraki filtrasyon ve kromatografi işlemleri için sürekli bir hücresiz malzeme akışı sağladığından, sürekli biyoproseste uygulanması için potansiyel vardır.
Akustik dalga ayırıcıyı hazırlamak için, bulanıklık kablolarını ilgili bağlantı noktalarına bağlayın ve oda gücü BNC kablolarını akustik dalga ayırıcı sisteminin arkasına bağlayın. Bulanıklık problarını bulanıklık ölçere ve termometre muhafazasına yerleştirin ve vidaları sıkın. Besleme hortumunu, besleme pompası aracılığıyla besleme bulanıklık portunun girişine bağlayın.
Ve y-borusunu besleme bulanıklık portunun çıkışından akustoforetik odanın giriş portuna bağlayın. Akustotoretik odanın atık portundan gelen aşama 1 hortumunu, aşama 1 pompası aracılığıyla bir hücre toplama kabına bağlayın ve boruyu akustotoretik odanın süzüntü portundan prob 1 bulanıklık portunun girişine bağlayın. Ardından, prob 1 bulanıklık portunun dışından gelen hasat borusunu bir ürün toplama kabına bağlayın.
Sistemi hasat edilmiş hücre kültürü sıvısı ile doldurmak için akustik dalga ayırıcıyı açın ve ilgili yazılım programını açın. Okumalar panelinde, veri kaydını başlatmak için Testi Başlat'a tıklayın. Ve besleme borusu ucunu, karıştırılmakta olan hasat edilmiş hücre kültürü sıvı kabına bağlayın.
Besleme pompasını başlatmak için pompa hızını girin ve Enter'a basın. Hücre sıvısının kaptan akustoforetik odaya pompalandığından emin olmak için pompa yön okunun doğru yönlendirildiğini onaylayın ve başlamak için üçgen simgesine tıklayın. Akustoforetik haznenin doldurulması sırasında Yüzde İndirgeme Panelindeki besleme bulanıklığı ölçümlerini izleyin.
Hasat edilen hücre kültürü sıvısı, hücre sıvı kabı içinde yeterince karıştırılıyorsa, bulanıklık değerleri, haznenin yüklenmesi sırasında tutarlı olacaktır. Sıvı, akustoforetik odanın arkasındaki piezo dönüştürücünün üzerine geldiğinde, pompayı durdurmak için Kapat'a tıklayın. Ve BNC güç kablosunun diğer ucunu akustoforetik odaya bağlayın.
Akustoforetik hazne dolduktan ve açıldıktan sonra, besleme pompası hızını istenen çalışma hızına değiştirin. Aşama 1 piezo gücünü açmak için, güç modülündeki çubuğu 10 watt'a kaydırın ve Aç'a tıklayın.Hücreler akustoforetik odanın dibine yerleşmeye başladığında, akustik dalga ayırıcı odalarını yakından izlerken ve pompa hızlarını gerektiği gibi ayarlarken, hücre yoğunluğuna ve besleme pompası hızına göre uygun bir oranla 1. aşama pompasını başlatın. Paketlenmiş hücre kütlesini hesaplamak için, 15 mililitrelik boş bir tüple bir terazinin darasını alın ve tüpü besleme malzemesi ile doldurun.
Tüpün toplam ağırlığını besleme ile kaydettikten sonra, tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir kaba boşaltın. Hücre peleti ile tüpün ağırlığını ölçün. Ardından, akustoforetik odadan taşma bulanıklık probu 1'e girerken aşama 1 bulanıklığının bulanıklık profilini izleyin.
Çalışma bittiğinde, besleme ve kademe 1 pompalarını durdurun ve hazneye giden gücü kapatın. BNC güç kablosunu ayırın ve sonraki analiz için ürün hasat malzemesini toplayın. Akustoforetik odadan kalan sıvıyı boşaltmak için atık borusunu boş bir kaba yerleştirin.
Boruyu akustoforetik oda giriş ve süzüntü portlarından ayırın ve atık boruyu pompa kafasından serbest bırakın. Hazne boşaldığında, boruyu yeniden bağlayın, atık boruyu tekrar pompa kafasına yerleştirin ve besleme borusunun ucundan deiyonize suyu 15 ila 20 dakika boyunca yıkamak için dakikada 60 mililitrelik bir besleme ve aşama 1 pompa hızı kullanın. Su ile durulamanın sonunda, %70 izopropil alkolü borudan ve hazneden 15 ila 20 dakika pompalayın, ardından 15 ila 20 dakikalık ek bir deiyonize su durulayın.
Bu temsili analizde, hasat edilen hücre sıvısı akustik dalga ayırıcı odasına girerken, besleme bulanıklık probundan alınan bulanıklık ölçümleri, yaklaşık 1000 ila 1100 NTU arasında tutarlı kaldı. Ve prob 1 bulanıklık probundan yapılan ölçümler 40 ila 50 NTU civarında kaldı. Hasat edilen hücre sıvısının hazne içinde daha uzun süre tutulması, bu örnekte olduğu gibi, hasat edilen hücre sıvısının akustoforetik odaya girmeden önce ve akustik ayrılmadan sonra altı santigrat dereceden daha büyük bir sıcaklık farkı olduğu gibi sıcaklık artışlarına neden olur.
Yüksek hücre yoğunluklu hasatlar yapılırken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli husus, bulanıklık problarının doygunluğudur, çünkü besleme bulanıklık probu için bulanıklık ölçümleri 4600 NTU'nun üzerinde doygun hale gelir ve bu da muhtemelen hücre giderme verimliliğinin hesaplanmasında hafife alınmasına neden olur. Ek olarak, besleme pompası hızı arttıkça hücre çıkarma verimliliği yaklaşık %100'den %57'ye önemli ölçüde düşer ve daha yavaş bir besleme pompası hızı tipik olarak daha iyi bir hücre arıtması ile doğrudan ilişkilidir. Biyoteknoloji ürünleri üreticileri sürekli üretime doğru ilerlerken, akustik dalga teknolojisinin kullanımı, sürekli biyoişleme ve bolluk biyoreaktör işlemleri için ek uygulamalara sahip olabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, CHO hücre kültürlerinin birincil berraklaştırılması için akustik dalga ayırıcısının kullanımını özetlemektedir. Sürekli biyoinişleme potansiyeli de dahil olmak üzere, bu yöntemin geleneksel tekniklere göre avantajlarını vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre kültürü
- Biyoproses
- Ayırma teknolojileri
Arka Plan
- CHO hücreleri, biyofarmasötik üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Geleneksel berraklaştırma yöntemleri verimsiz olabilir ve kontaminasyon riskleri taşıyabilir.
- Akustik dalga ayrımı, kompakt ve etkili bir alternatif sunar.
- Bu yöntem, sürekli akışa olanak tanıyarak alt akış işlemlerini iyileştirir.
Çalışmanın Amacı
- Bir akustik dalga ayırıcının kurulumunu ve çalışmasını göstermek.
- Hücrelerin kültür sıvısından ayrılma verimliliğini değerlendirmek.
- Biyoişlemede sürekli berraklaştırma potansiyelini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Akustik dalga ayırıcının bulanıklık ve güç bağlantılarıyla kurulumu.
- Ayırma işlemi sırasında bulanıklık seviyelerinin izlenmesi.
- Hücre yoğunluğu ve bulanıklık ölçümlerine göre pompa hızlarının ayarlanması.
- İşlem sonrası sistemin durulanması ve temizlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Tutarlı bulanıklık ölçümleri, etkili ayrışmaya işaret etmektedir.
- Uzun süreli işlem sırasında sıcaklık artışları gözlemlenmiştir.
- Hücre uzaklaştırma verimliliği, besleme pompası hızlarına göre değişiklik göstermektedir.
- Sürekli biyoişleme uygulamaları için potansiyel vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Akustik dalga ayrıştırması, geleneksel yöntemlere karşı uygulanabilir bir alternatiftir.
- Verimlilik ve kontaminasyon riski açısından avantajlar sağlar.
- Sürekli üretimdeki uygulamalarının daha fazla araştırılması gereklidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Birincil berraklaştırma, santrifüjleme ve filtrasyon gibi geleneksel yöntemlerin kontaminasyon riskleri oluşturduğu, geniş alan gerektirdiği ve sürekli işlemeyi engellediği biyolojik üretimdeki kritik bir darboğazdır. Akustik dalga ayrımı, berraklaştırılmış sıvının sürekli akışına olanak tanıyan, kompakt ve düşük kontaminasyonlu bir alternatif sunarak sürekli biyoişleme iş akışlarına entegrasyonu destekler. Bu yaklaşım, operasyonel karmaşıklığı ve filtre tıkanma risklerini azaltırken, tekrarlanabilir hücre uzaklaştırma sağlayarak erken saflaştırma basamaklarındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Monoklonal IgG1 gibi terapötik proteinlerin alt akış analizleri için CHO hasatlarının hızlı bir şekilde berraklaştırılmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Santrifüjasyona kıyasla uygulamalı süreyi ve kontaminasyon riskini azaltarak numune işlem süresinin hızlanmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz geliştirme süreçlerinde güvenilir analit tespiti için uygun olan, düşük bulanıklığa (40–50 NTU) sahip tutarlı hücreden arındırılmış süpernatan üretir.
- Operasyonel Değer: Filtre kirlenmesini ve tıkanmasını en aza indirerek analiz tekrarlanabilirliğini artırır ve reaktif israfını azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Ürün bütünlüğünü bozmadan, preklinik materyal üretimi için kültür sıvılarının ölçeklenebilir berraklaştırılmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Biyolojiklerin geliştirilmesindeki platform teknolojisi hedefleriyle uyumlu olarak, kesikli işlemeden sürekli işleme geçişi kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Akustik dalga ayrıştırması, hasat sonrası ve derinlik filtrasyonu veya kromatografi öncesinde konumlanarak erken saflaştırma sürecine uyum sağlar ve sürekli üretim hatlarına sorunsuz entegrasyona olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Salgılanan ürünlerin doğru şekilde miktarının belirlenmesini ve karakterize edilmesini sağlamak için karmaşık kültür sıvılarını berraklaştırır.
- Tarama: Tarama kampanyaları boyunca tutarlı analiz performansı için kritik olan, tekrarlanabilir ve düşük bulanıklığa sahip bir çıktı sunar.
- Analitik: Hücre uzaklaştırma verimliliği ve işlem tutarlılığı ile ilişkili, ölçülebilir bulanıklık azalma metrikleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Ürün verimini ve bütünlüğünü koruyarak, preklinik toksikoloji ve etkinlik çalışmaları için materyalin sürekli tedarikini destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çok ürünlü tesislerde birden fazla hücre hattına ve ürün tipine uyarlanabilen modüler, ölçeklenebilir bir birim işlemi temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gerçek zamanlı bulanıklık izleme ve tutarlı ürün geri kazanımı yoluyla açıklığa kavuşturma verimliliğindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Alan gereksinimini azaltır, santrifügasyon risklerini ortadan kaldırır ve filtre kirlenmesini en aza indirerek operasyonel genel giderleri düşürür.
- Stratejik Değer: Sürekli işleme yeteneklerini mümkün kılarak partiler arası değişkenliği azaltır ve teknoloji transferini hızlandırır.
- Portföy Etkisi: Erken saflaştırma aşamalarının riskini azaltan güvenilir ve ölçeklenebilir bir açıklığa kavuşturma sağlayarak risk odaklı karar verme süreçlerini destekler.
Uygulama Hususları
- Akışkanlar dinamiği ile akustoforetik sistem kurulumu ve kalibrasyonu konularında teknik uzmanlık gerektirir.
- Bulanıklık izleme, peristaltik pompalar ve sıcaklık kontrol sistemleri ile entegrasyon gereklidir.
- Tekrarlanabilir performans için akış hızlarının ve güç ayarlarının vardiyalar ve operatörler arasında standartlaştırılması gerekir.
- Yüksek hücre yoğunluklarında (>4600 NTU) bulanıklık probu doygunluğu, giderme verimliliğinin olduğundan düşük hesaplanmasına neden olabileceğinden dikkate alınmalıdır.
- Performans akış hızına bağlıdır; aşırı besleme hızları hücre giderme verimliliğini düşürür, bu da hasat yoğunluğuna göre optimizasyon yapılmasını gerektirir.
