Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Standartlaştırılmış protokol, endojen hücre göçünü değerlendirmek için kullanılabilir ve iskelet fenotiplerinin yanı sıra çeşitli hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu tekniğin avantajı, yaralanma ve/veya sitokin tedavisine yanıt olarak bir hücre popülasyonu yerine tek tek hücreler için in vivo hücre göçünün izlenmesine izin vermesidir. Prosedüre başlamadan önce, anestezi uygulanmış farede ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmediğini onaylayın ve hayvanın gözlerine merhem sürün.

Daha sonra, hemen medialden sağ kulağa sol kulağa doğru enine, bir santimetreden daha az bir kesi yapın ve ilk kesiden, sağ gözün yanından buruna doğru yaklaşık iki ila üç milimetre arasında ikinci bir kesi yapın. Cildi periosteumdan ayırmak için forseps kullanın ve cildi kalvaria periosteumasından ayırmak için bağ dokusunu nazikçe kesmek için makas kullanın. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, cilt flebinin üst kısmına oftalmik merhem sürün ve flebi sol gözün üzerine nazikçe katlayın.

Sagital ve koronal sütürlerin kesişimi açıkça ortaya çıkarılmalıdır. Kan ve kalıntı kıl alanını temizlemek için açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın ve bir eğimin ucunu koronal sütürden buruna doğru bir ila iki iğne genişliği ve sagital sütürün sağına bir ila iki iğne genişliği yerleştirin. Çok az miktarda aşağı doğru basınç kullanarak, şırıngayı dikkatlice bir kez saat yönünde ve birkaç kez saat yönünün tersine çevirin.

Ardından, mikro kırığı yaklaşık 40 mikrometreye genişletmek için 27 gauge bir iğne kullanın. Kemik parçaları kalırsa, mikro kırığı PBS ile yıkayın. Kemik parçaları hala devam ediyorsa, parçaları nazikçe çıkarmak için 29 gauge bir iğne kullanın.

CCL5 tedavisi için, mililitre başına 100 nanogram stok CCL5 çözeltisi ve mililitre başına 10 nanogram çalışan kemoatraktan çözeltisi elde etmek için bazal membran matrisi kullanın. Yaralanmayı tedavi etmek için, 220 mikrolitrelik bir pipete beş mikrolitre solüsyon yükleyin ve dikişe iki mikrolitre kemokin uygulayın. Daha sonra matrisin katılaşmasına izin verin ve bir saatlik kemokin tedavisi sırasında dokunun susuz kalmamasını sağlamak için kalvaria'yı cilt flebi ile nazikçe örtün.

Periosteal kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak intravital görüntülenmesi için, fareyi mikroskoba taşımadan önce, kalvarinin görsel düzlemini kontrol etmek için farenin kafasının arkasına hafif bir baskı uygulayın. Düzlem düz değilse, konumu ayarlamak için fare kısıtlamasını yavaşça sola veya sağa çevirin. Daha sonra, deri flebindeki tüm kalvaria'yı su içinde steril% 2 metilselüloz ile kaplayın ve fareyi XYZ ekseni motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin.

Epifloresan ışığı kullanarak, fareyi mikroskoba bakacak ve koronal ve sagital sütürlerin kesişimi sahnenin ortalanmış referans noktası olacak şekilde hizalayın. Ardından görüntüleme alanına bir cam kapak yerleştirin ve hizalamayı iki kez kontrol edin. Sütürün içine ve dışına migrasyonun hızlandırılmış görüntülenmesi için, kalvaria'yı taramak üzere düşük büyütmeli suya daldırma lensi seçin.

Sagital ve koronal sütür kesişiminin referans görüntüsünü elde edin ve hücrelerden gelen SHG ve floresan sinyallerini kullanarak, her bir yaralanma bölgesini bulun ve XYZ koordinatlarının yanı sıra sagital ve koronal sütürlere olan mesafeleri kaydedin. Uzun süreli görüntüleme için koronal veya sagital sütürlerde bir konum seçin ve görüntüleme sırasında referanstan bu alanın ayrıntılı bir ZStack görüntüsünü elde edin. En az bir saat boyunca her bir dakikada bir görüntü kaydetmek için zaman atlamalı yazılım ayarlarını kullanın ve mevcut görüş alanını anlık görüntüler arasındaki süredeki ilk görüş alanıyla karşılaştırın.

Görüş alanları farklıysa, görüş alanının hangi yönde ayarlanması gerektiğini belirlemek için ZStack görüntüsünü kullanın. Son zamanlarda, periosteal iskelet kök hücrelerinin Mx1 pozitif alfa-SMA pozitif ikili etiketleme ile işaretlendiği Mx1 domates alfa-SMA GFP raportör fareleri üretildi. Sütür yerleştirildikten 24 saat sonra, bir saatlik görüntüleme periyodu boyunca Mx1 pozitif alfa-SMA pozitif periosteal iskelet kök hücre göçü çok az gözlenir veya hiç gözlenmez.

Yaralanmadan 24 saat sonra bir kalvaria defektinin CCL5 kemokin tedavisi, koronal sütürden uzağa ve yaralanma bölgesine doğru yönlü olarak belirgin bir göçe neden olur. Bu temsili analizde, görüntülemeden sonraki bir saat içinde, Mx1 pozitif alfa-SMA pozitif periosteal iskelet kök hücrelerinden biri, yaralanmaya doğru yaklaşık 50 mikrometre göç etti. Bu protokolün hatırlanması gereken en önemli yönü, hücreye özgü göçü uyarmak için CCL5 tedavisini yaralanma bölgesiyle sınırlamaktır.

Bu prosedür tamamlandıktan sonra, lokalize tedaviye bir hafta boyunca devam edilebilir. Calvaria yaralanmasının iyileşmesini ve mineral birikimini değerlendirmek için bir mikro BT kullanılabilir.