Name: Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Öğrenin, maya hücrelerinden fonksiyonel makromolekülleri korumak için kriyojenik öğütme yöntemini. Bu teknik, protein bütünlüğünü koruyarak verimli hücre lizi sağlar ve biyokimyasal çalışmalar için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gunjan laboratuvarındaki araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı ve Florida Sağlık Bakanlığı'nın finansmanı ile desteklenmiştir. Lisans öğrencisi John Parker'a teknik yardım için teşekkür ederiz.

1. Maya Patlamış Mısır Hazırlanması
<ol><li>YPD ortamının 0,5 L'lik maya hücrelerini 1 x 107 hücre/mL yoğunluğuna kadar büyütün. Coulter Sayacı veya başka bir yol kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>2.400 g ve 4 °C'de 10 dk santrifüj hücreleri.</li>
	<li>Her numuneyi 500 mL buz gibi deiyonize 18 mega Ohm Milli-Q su ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>15 mL buz gibi Lysis Tamponunda resuspend peletleri [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, %0.1 Ara, gliserol, taze eklenen azaltıcı ajan 10 mM β-merkaptoetanol, proteaz inhibitörü kokteyli, 10 μM proteozom inhibitörü MG-132, 1 mM deasetlaz inhibitörü sodyum bütirat ve fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum vanatrat, 50 mM sodyum florür, 50 mm sodyum β-gliserfofos]. Ek ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakın. Örnekler bir sonraki adım için hazır olana kadar yeniden askıya alınmış hücreleri buzüzerinde tutun. NOT: Çok çeşitli iyonik olmayan deterjanlar içeren çok çeşitli lisis tamponları, alt akım uygulamasına dayalı olarak içerdiği numuneler ve özel inhibitörlerle kullanılabilir. Proteaz ve proteazomal inhibitörlerin dahil edilmesi protein bozulmasını önlemek için çok önemlidir, özellikle de ekstreler çözüldükten sonra.</li>
	<li>Yavaş yavaş bir veya daha fazla 50 mL santrifüj tüpler kuru buz üzerinde tutulan ve jant hemen altında kadar LN2 ile dolu içine önceden soğutulmuş serolojik pipet kullanarak bir seferde hücre süspansiyon bir damla ekleyerek snap dondurulmuş maya patlamış mısır olun. Hızlı buharlaşma nedeniyle kaybını telafi etmek için sık sık tüp sıvı nitrojen kadar top. Azot boğulması ile ilgili tehlikeleri önlemek için iyi havalandırılan bir alanda çalışın.<ol>
<li>50 mL'lik bir tüp yerine, patlamış mısır hazırlığı için birbirine bağlanmış birden fazla 50 mL tüp (veya kriyojenik sıcaklıkları tolere edebilen büyük plastik santrifüj şişesi gibi büyük ağızlı herhangi bir kap) kullanın(Şekil 1A). Büyük konteyner ve açılması, daha kolay bu büyük agregalar oluşturmak için patlamış mısır kümeleme önler gibi patlamış mısır hazırlanmasıdır. Patlamış mısır için 0,3-0,5 cm'lik bir boyut aralığı, dondurucu değirmenini kullanarak uygun taşlama/pulveizasyon elde etmek için idealdir(Şekil 1B).</li>
		<li>LN2'nin -80 °C'de depolamadan önce patlamış mısır içeren tüplerden tamamen buharlaştığından emin olun. Maya patlamış mısırı hazırladıktan sonra -80 °C'de muhafaza edildiğinde birkaç yıl stabil olarak durmak mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> Şekil 1: Maya patlamış mısır hazırlama. (A) Maya "patlamış mısır" LN hücre süspansiyon dropwise dondurma tarafından yapılır2. Biz bir lastik bant ile birlikte düzenlenen ve kuru buz dolu bir buz kovası yerleştirilir bir ila üç 50 mL tüpler kullanın. Tüpler ln ile doldurulur2 sadece kendi jantlar altında kadar ve tüm hücre süspansiyon patlamış mısır içine yapılmış kadar neredeyse tam tutmak için sık sık sıvı nitrojen ile tepesinde(B) patlamış mısır boyutu optimal taşlama verimliliği önemli bir belirleyicidir. Patlamış mısırın boyut aralığı 0,3 ile 0,5 cm arasında olmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Kriyogrinding
<ol><li>Başlamak için, dondurucu değirmeni soğutmak, şişeleri, malzemeleri öğütmek ve tüm numuneler için makineyi çalıştırmak için yeterli LN2 olduğundan emin olun. Beşten az numune için LN2'nin 30-35 L'si yeterli olacaktır. Dondurucu değirmen odasını dolgu hattına kadar LN2 ile doldurun. UYARI: LN2 ile ilgili tüm adımlar iyi havalandırılan bir alanda yapılmalı ve boğulma riskini önlemek için dondurucu değirmeninin kendisi böyle bir alanda bulunmalıdır. Uygun ayakkabı, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri, nitril eldiven bir taban tabakası, sonra termal eldiven, nitril eldiven başka bir çift takip dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin. LN2'yikullanırken çok dikkatli olun.</li>
	<li>LN2 sıçrama kaçınarak, yavaş yavaş dondurucu değirmen kapağını kapatın ve makine nin soğuması için birkaç dakika bekleyin. Bir sonraki adıma geçmeden önce buharlaşmadan kaynaklanan kaybı telafi etmek için hazneyi LN2 ile doldurmak gerekebilir. NOT: LN2'yi yalnızca dolgu satırına kadar gerektiğinde yeniden doldurun. Bu makine için hem tehlikeli hem de zararlı olabilir gibi oda aşırı doldurmayın. Otomatik dolum sistemleri, buharlaşan LN2'yi doğrudan dondurucu değirmenine bağlı bir depolama tankından doldurabilen dondurucu değirmeni için kullanılabilir.</li>
	<li>Pre-chill büyük taşlama şişeleri ve manyetik impactor bar LN onları dunking tarafından2 ayrı bir küçük dewar tutulur. LN2 köpürmeyi durduğunda tüm LN2'yi decant. Sonra taşlama şişesine örnek / maya patlamış mısır ekleyin ve iki paslanmaz çelik uç fişleri ile sıkıca mühür.<ol>
<li>Taşlama verimliliğini azaltabileceğinden öğütme şişesinin üçte birinden fazlasını numuneyle doldurmayın. Bunun yerine, daha büyük örnekler iki veya daha fazla şişeye bölünerek ve sırayla öğütülerek işlenebilir. Daha küçük taşlama şişeleri daha küçük numuneler için kullanılabilir (3 mL'ye kadar).</li>
	</ol></li>
	<li>Öğütme şişesini dondurucu değirmen odasına yerleştirin ve yerine kilitleyin. Kapağı kapat.</li>
	<li>Tomurcuklanan maya için, 14 kırma hızında 2 dakika/çevrim (döngüler arasında soğutma için 2 dk mola ile) için toplam üç döngü için numuneleri öğütün. Makine döngüleri tamamladıktan sonra durduğunda, dondurucu değirmenkapağını yavaşça açın ve toz dondurulmuş hücre lisatı ile şişenin kilidini dikkatlice açın ve dondurucu değirmeninden çıkarın. Birden fazla küçük şişe kullanılırsa, bir seferde bir şişe kaldırmak ve kuru buz onları yerleştirmek için hızlı bir şekilde çalışır. NOT: Genellikle aynı örnek türüne sahip farklı boyutlardaki şişeler kullanılırken taşlama parametrelerini ayarlamaya gerek yoktur. Ancak, çevrim sayısı ve taşlama oranı gibi taşlama parametrelerinin, kullanım kolaylığına bağlı olarak farklı numune tipleri için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Çoğu memeli hücresi ve yumuşak doku1-2 döngü içinde 10 kırma hızında lyse olacaktır. Bakteri, maya, sinek larvası ve erişkin meyve sinekleri gibi numunelerin kuruması zor olan 3-6 döngü maksimum hızda, kemik, diş vb. sert dokular 10 döngüye kadar sürebilir. Çözülmüş numunenin küçük bir aliquot önce ve sonra kısık verimliliğini belirlemek için bozulmamış, unlysed hücrelerin sayısını saymak için taşlama dan önce ve sonra mikroskop altında görülebilir. Tomurcuklanan maya dan protein ve DNA salınımı üzerinde kriyogrinding parametrelerinetkisi mükemmel bir analiz daha önce yayınlanmıştır15.</li>
	<li>Numunenin çözülmesine izin vermemek için hızlı bir şekilde çalışarak, açma aletini kullanarak son parçalardan birini dikkatlice sökün (taşlama sırasında biraz gevşek leşmiş gibi görünen iseçin). Daha sonra, impactor çubuğunu çıkarmak için bir çift uzun çalgı kullanın (kuru buzlu bir kovada önceden soğutulmuş olan). LN2 ile önceden soğutulmuş ve kuru buz üzerinde tutulan bir polistiren tartım kabıüzerine taşlama şişesi üzerine ters ve dokunarak toz haline getirilmiş örnek toplamak.</li>
	<li>Toz dondurulmuş hücre lisatının tamamı öğütme şişesinden çıkarıldıktan sonra, tartım kabından toz lanmış lysate'yi 50 mL'lik tüpe dökün ve en iyi sonuçlar için hemen yavaş erime basamadına geçin. Alternatif olarak, dondurulmuş toz lysate'yi bir gecede -80 °C'de saklayın, ancak bu bazı bozulmalara neden olabilir.</li>
	<li>Buz ve su% 50 bulamaç ile bir buz kovası hazırlayın ve manyetik karıştırıcı ile bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin. Numuneleri tutmak için bir tel rafı veya buz bulamacına uygun başka bir rafı batırın.<ol>
<li>Daha sonra, yavaş yavaş bir manyetik karıştırıcı kullanarak bulamaç sürekli ajitasyon ile bir buz bulamaç banyosu örnekleri eritin. Eriyen buzu değiştirmek için daha fazla buz ekleyin (buz kovasının taşmasını önlemek için bazı suyun atılması gerekebilir). Birkaç inhibitörleri sulu tamponlar kısa yarım yaşamları olduğundan, ek proteaz inhibitör kokteyl (Malzemeler Tablosubakınız) ve 10 μM proteozom inhibitörü MG-132 örnekleri erimeye başladıktan sonra lysate (yaklaşık 30 dakika sonra) ekleyin.</li>
		<li>Erime işlemini hızlandırmak için her 5 dakikada bir tüplerin dışında oluşan buz kaldırın. Numunelerin oda sıcaklığında veya daha yüksekte hızlı bir şekilde çözülmesinin önemli ölçüde bozulmaya yol açabileceğini unutmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Numuneler tamamen çözüldükten sonra (numune miktarına bağlı olarak bir saatten fazla sürebilir), hücre enkazının büyük bir kısmını lysat'tan çıkarmak için 4 °C'de 20 dk'da ~3.220 g'de lysat'ı santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant'ı buz üzerinde önceden soğutulmuş 50 mL polikarbonat santrifüj tüplere aktarın ve numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj edin (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Bulutlu lipid tabakasını(Şekil 2),önceden soğutulmuş serolojik pipetler kullanarak soğutulmuş 15 mL tüpe rahatsız etmeden, tüpteki sıvı sütunun merkezinden oluşan açık bir süpernatantı sadece açık bir süpernatant aktarın. Lipidlerin ve enkazların taşınmasını önlemek için santrifüj tüpündeki tüm lysate'yi çıkarmaktan kaçının. Santrifüj tüpünde kalan lysather spin sonra ekstre küçük miktarlarda kurtarmak için birden çok kez santrifüj edilebilir. NOT: Herhangi bir denatüre proteinile birlikte lipidler bulutlu/sütlü görünür ve sıvı/hava arabiriminin üst kısmında ve bazen çözünmez hücresel enkazdan oluşan peletin üzerinde yer alır (Şekil 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> Şekil 2: Santrifüj tüpündeki tabakaları ayıklayın. 20 dk için 16.000 g santrifüj aşağıdaki bir tüp tüm hücre ekstresinin önemli görünür özellikleri gösterilir. Her özelliğin göreceli bolluğu örnektürüne, hücrelerin büyüme evresine (üstel karşı sabit), hücreleri askıya almak için kullanılan lisis tamponunun miktarına ve lysis etkinliğine bağlıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="12"><li>Ekstre daha fazla kurtarmak için 5 dakika için kalan lysate santrifüj. Bu 5 dk santrifüjü mümkün olduğunca çok net özü kurtarmak için gerekirse birden çok kez tekrarlayın. Peletyakın tüp altına yakın lipidler içeren bulutlu lysate atın.</li>
	<li>Protein kompleksi saflaştırma, immünopresipitasyon ve proteomik analiz gibi downstream uygulamaları için bu özleri kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li>
<li>Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+B+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 13, Unit 13 (2001).</li>
<li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li>
<li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li>
<li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Archives+of+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li>
<li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Techniques%22%5BJournal%5D)">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+yeast+mitochondrial+DNA+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).</li>
<li>Bzducha-Wróbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+%CE%B2-glucan+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li>
<li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+sampling+of+dental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the sampling of dental DNA.</a> Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).</li>
<li>Sweet, D., Hildebrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+human+teeth+by+cryogenic+grinding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding.</a> Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+%28P.+taeda+L.%29+and+other+conifer+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).</li>
<li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li>
<li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li>
<li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295(2012).</li>
<li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li>
<li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li>
<li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments%3A+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li>
<li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).</li>
<li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101(2014).</li>
<li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li>
<li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li>
<li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS%2FMS+determination+in+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li>
<li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li>
<li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+method+for+the+determination+of+copper%2C+manganese+and+iron+in+seafood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Composition+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li>
<li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+B-Atomic+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li>
<li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sr-87%2FSr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley%3A+Implications+for+early+hominid+habitat+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+Et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li>
<li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka%5BTitle%5D)+AND+%22Geology%22%5BJournal%5D)">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mayadan alınan yerli proteinlerin incelenmesinin bir sınırlaması, sert hücre duvarlarından dolayı maya hücrelerinin verimsiz bir şekilde çalışmasıdır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiş olmasına rağmen, elimizde en tutarlı ve verimli yöntem patlamış mısır gibi dondurulmuş maya hücrelerinin flaş kriyogrinding olduğunu. Bu yöntem, tomurcuklanan mayadan elde edilen yüksek kaliteli tüm hücre ekstrelerinin diğer lysis yöntemlerine göre güvenilir bir şekilde hazırlanmasını sağlar. Temsili sonuçlar kriyogrinding 4 ° C<strong class...

Maya protein çalışmaları için popüler bir model organizma, bu araştırmacılar için kullanılabilir genetik ve biyokimyasal araçların bir bolluk ile basit bir ökaryotik organizma olduğu gibi1. Sağlam hücre duvarlarından dolayı, araştırmacıların karşılaştıkları bir zorluk, hücresel içeriklere zarar vermeden hücreleri verimli bir şekilde dinleyerek. Enzimatik lysis (zimolyaz)2,3, kimyasal lysis4, fiziksel lysis donma-çözülme5, basınç tabanlı (Fransız basın)6,7, mekanik (cam boncuk, kahve öğütücü)8,9, sonication tabanlı10 ve kriyojenik2,11içeren maya hücrelerinin bozulması yoluyla protein özleri elde etmek için farklı yöntemler mevcuttur . Hücre lisisinin ve protein veriminin etkinliği kullanılan tekniğe bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir, böylece lysate için istenilen downstream uygulaması için sonuç veya uygunluk etkiler. Kararsız, geçici çeviri sonrası modifikasyonları olan veya ısıya duyarlı proteinleri incelerken, hazırlık sırasında numune kaybını veya bozulmasını en aza indirecek bir yöntem kullanmak özellikle önemlidir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Özü hazırlama tekniği</td>
			<td>Şey</td>
			<td>Avantaj -ları</td>
			<td>Dezavantaj -ları</td>
			<td>Akış aşağı analizi</td>
			<td>Başvuru</td>
		</tr><tr><td>Fransız basını: Zymolyase kullanılarak enzimatik ön işlem ile yüksek basınçlı homogenizer (diğer adıyla Mikroakışkanlaştırıcı)</td>
			<td>Zymolyase-20T, mikroakışkan yüksek basınçlı homojen. Kırıcı, hava tahrikli, yüksek basınçlı pompa (oran 1:250; gerekli hava basıncı 0.6-l MPa) ve ek bir geri basınç ünitesi ile özel bir bozulma odası oluşur. İşlem için en az 20 mL numune boyutu gereklidir.</td>
			<td>Kombine protokol kullanılarak elde edilen nihai toplam bozulma 95 MPa basınçta 4 geçişle %100'e yaklaşırken, Zymolyase olmadan sadece homojenizasyon kullanılarak 95 MPa'da 4 geçişle sadece %32'lik bir bozulma yaşandı.</td>
			<td>Küçük ölçekli uygulamalar için uygun değildir. Enzimler büyük ölçekli preparatlar için pahalı alabilirsiniz.</td>
			<td>Protein arınması</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Boncuk çırpıcı: Zymolyaz e-misli bir fastprep aletinde cam boncuklarla lysed işlenmiş hücreler</td>
			<td>Kabaca eşit hacimde soğuk, kuru, asitle yıkanmış 0,5 mm cam boncuk, lysis tamponundaki belirli bir hücre peleti hacmine eklenir ve hücreler güçlü manuel ajitasyon ile bozulur.</td>
			<td>Özellikle protein arınması yerine, atasözü amacıyla birçok farklı küçük maya kültüründen özler yaparken yararlıdır.</td>
			<td>Cam boncuk işlemi sırasında, proteinler sert protein denatürasyonuna yol açan geniş köpük neden sert tedavi edilir. Hücre kırılması miktarı değişirken, proteozis ve proteinlerin modifikasyonu mekanik kırılma sırasında ekstrenin 4°C'nin üzerinde ısınmasından kaynaklanabilir.</td>
			<td>Çoğunlukla DNA ve RNA analizleri, aynı zamanda jel elektropheorez denaturing tarafından protein analizi, ya da Batı lekeleme olmadan.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Ozmotik şok ve Dounce homojenizasyon kombinasyonu kullanılarak izlenme ardından zimolyaz tedavisi</td>
			<td>Hücre duvarlarının enzimatik sindiriminden sonra, spheroplastlar bir Dounce homogenizer'de 15-20 vuruşluk dar bir havanele (açıklık 1-3 μm) ile lizededilir.</td>
			<td>BJ926 veya EJ101 gibi proteease-eksik suşları kullanmak için avantajlı. Bu maya hücrelerini kırmak için en nazik yoludur ve bu nedenle karmaşık enzimatik işlevleri (örneğin, çeviri, transkripsiyon, DNA çoğaltma) yürütebilir ve hangi makromoleküler yapıların bütünlüğü (örneğin, ribozomlar, splicesomes) muhafaza edilmelidir özleri hazırlamak için en uygundur. Kromatin çalışmaları (Bloom ve Carbon, 1982) veya nükleer protein özleri için kullanılabilen sağlam çekirdeklerin izole edilmesinde de yararlıdır (Lue ve Kornberg, 1987).</td>
			<td>Spheroplast lysis prosedürünün en büyük dezavantajları, özellikle büyük ölçekli preparatlar için (>10 litre) nispeten sıkıcı ve pahalı olması ve uzun kuluçka süreleri proteoziz veya protein modifikasyonuna yol açabilir.  Kromatin preparatları için, diferansiyel santrifüj (nükleozom merdiven bütünlüğüne dayalı) tarafından üretilenlerden farklı veya daha düşük kalitede dir.</td>
			<td>Kromatin çalışmaları için bozulmamış çekirdekleri izole etmek, karmaşık enzimatik işlevleri yerine getirebilen ekstreler, makromoleküler yapılar, nükleer protein özleri.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Bir harç/havaneli veya blender kullanarak Sıvı Azot taşlama tarafından flaş dondurulmuş hücrelerin Hücre Bozulması</td>
			<td>Hücreler hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur ve daha sonra bir havaneli kullanarak bir harç elle öğütülerek, ya da sıvı azot varlığında bir Waring blender kullanılarak lysed.</td>
			<td>Protokol hızlı ve kolay. Bu çok büyük kültürler de dahil olmak üzere maya hücrelerinin değişen miktarlarda barındırabilir. En büyük avantajı, hücrelerin aktif olarak büyüyen durumdan hemen sıvı nitrojene (−196°C) alınması, proteazlar ve nükleazlar gibi bozunatif enzim aktivitelerinin azalması ve proteinleri (örn. fosfatazlar ve kinases) değiştiren aktivitelerdir. Özellikle büyük ölçekli protein arıtma için tek bir maya kültüründen bütün hücre özleri yapmak için uygundur.</td>
			<td>Biraz dağınık ve dikkatsiz araştırmacı için potansiyel olarak tehlikeli. Küçük numuneler (yani, 10- 100 ml maya kültürleri) kolayca işlenmez, çünkü blender'da etkili bir şekilde kırılmak için yeterli dondurulmuş hücre kümeleri kütlesi yoktur. Tek tek numuneleri işlemek ve kullanımlar arasındaki ekipmanı temizlemek zaman alır.</td>
			<td>Büyük ölçekli protein arınması için tek bir maya kültüründen bütün hücre özleri.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Otolsis, Boncuk değirmeni</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 saat, 200 devir / Ø 0.5 mm, 5 × 3 dk/3 dk</td>
			<td>Özellikle küçük ölçekli ekstre hazırlama için hızlı ve verimli bir şekilde</td>
			<td>Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. Boncuk dayak ekipmanları gerekli.</td>
			<td>Küçük ölçekli analizler.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Otolsis, Sonication</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 dk/2 dk, pulser %80, güç %80</td>
			<td>Sonication ekipman genellikle çoğu kurumda mevcuttur.</td>
			<td>Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. Sonication ekipman gerekli. Yavaş lysis 24 saatten fazla sürebilir.</td>
			<td>Maya hücre duvar hazırlıkları.</td>
		</tr><tr><td>Kaynama ve donma-çözülme işlemi</td>
			<td>Standart bir dondurucu ve ısıtma bloğu veya sıcak su banyosu dışında özel ekipman gerekli değildir.</td>
			<td>Verimli, tekrarlanabilir, basit ve ucuz.</td>
			<td>Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar.</td>
			<td>PCR tarafından DNA analizi.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Maya özlerinin hazırlanmasında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması.
Kriyogrinding (aka kriyojenik taşlama / kriyojenik frezeleme) genellikle nicel veya nitel analizler için güvenilir bir şekilde sıcaklığa duyarlı örneklerden nükleik asitler, proteinler veya kimyasallar almak için kullanılır. Biyoteknoloji, toksikoloji, adli tıp12,13,çevre bilimi, bitki biyolojisi14 ve gıda bilimi gibi çeşitli alanlarda birçok uygulama için başarıyla kullanılmaktadır. Bozulmamış biyolojik makromoleküllerin izolasyonu genellikle sıcaklığa bağlıdır. Son derece düşük sıcaklıklar proteazların ve nükleazların inaktif kalmasını sağlar ve bu da sonraki analizler için bozulmamış proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin güvenilir bir şekilde izole edilmesini sağlar. Gerçekten de, bir dondurucu değirmeni tipik olarak -196 °C (LN2kaynama noktası) bir örnek sıcaklığı korur, böylece DNA / RNA veya protein denatürasyonu ve bozulmaen en aza indirir.
Dondurucu değirmeni, paslanmaz çelik uç fişler arasında toz haline getirilecek numuneyi içeren bir şişe içinde katı metal bir çubuğu veya silindiri hızla ileri geri hareket ettiren bir elektromanyetik taşlama odası kullanır. Alet, taşlama odası içinde bir manyetik alan oluşturur ve hızla tersine çevirir. Manyetik alan ileri geri kayıyorgibi, mıknatıs fişlere karşı örnek ezerek 'kriyogrinding' ve patlamış mısır pulverization elde. Dondurucu değirmeni harç ve havanelinin yerini alır ve birden fazla numunenin (veya aynı anda en fazla 4 küçük numunenin) yüksek tekrarlanabilirlik ile sıralı olarak işlenmesine izin verir ve manuel taşlama ile ilişkili kullanıcı-kullanıcı değişkenliğini önler. Örnekler işlendikten sonra, hücre ekstreleri çeşitli akış aşağı uygulamaları için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Vidalı kapaklı 50 mL polikarbonat tüpler</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>Maya YPD medya bileşeni</td></tr><tr><td>BD Bacto Maya Özü</td><td>BD Biosiences</td><td>212750</td><td>Maya YPD medya bileşeni</td></tr><tr><td>Beckman Avanti santrifüj</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Yüksek hızlı santrifüj</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-Dekstroz Susuz</td><td>MP Biyomedikal</td><td>901521</td><td>Maya YPD medya bileşeni</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Sallanan kova rotoru</td></tr><tr><td>Eppendorf soğutmalı santrifüj 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Soğutmalı santrifüj</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Hacim ayırıcı ve kriyoprotektan</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>HIS6 antikoru</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>HIS etiketi için antikor</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>İyonik gücü korumak için tuz</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Proteazom İnhibitörü</td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitörü kokteyli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Fosfataz inhibitör kokteyli</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td>Protein Lekesi</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Sodyum Butirat</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Histon Deasetilaz İnhibitörü</td></tr><tr><td>Sodyum Florür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Fosfataz İnhibitörü</td></tr><tr><td>Sodyum Vanadat</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>159664</td><td>Fosfataz İnhibitörü</td></tr><tr><td>Sodyum ve beta;-gliserofosfat</td><td>Alfa Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Fosfataz İnhibitörü</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 dondurucu değirmen</td><td>SPEX Numune Hazırlama</td><td>6850</td><td>Dondurucu Değirmen</td></tr><tr><td>TALON Metal Afinitesi Reçine</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>HIS etiketli proteinleri aşağı çekmek için</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Noniyonik deterjan</td></tr> <tr><td>ve beta;-Merkaptoetanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>İndirgeyici ajan</td></tr></tbody></table>

otomatik dondurucu değirmeninde kriyogrinding ile hücre ekstrelerinin hazırlanması

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Genetik manipülasyon kolaylığı ve tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae ökaryotik hücresel makine güçlü evrimsel koruma önde gelen bir genetik model organizma yaptı. Ancak, verimli protein izolasyonu hücrelerin optimal bozulmasına bağlı olduğundan, hücresel proteinlerin biyokimyasal analizi için maya kullanımı enzimatik olarak sindirimi pahalı olan hücre duvarı tarafından engellenir (liticase veya zimolyase kullanarak), ve mekanik olarak bozması zor (geleneksel boncuk çırpıcı kullanarak, bir Fransız presi veya kahve öğütücü) örneklerin ısıtılmasına neden olmadan, bu da protein denatürasyon ve bozulmaya neden olur. Sıvı azot (LN2)altında maya hücrelerinin harç ve havaneli kullanılarak elle öğütülmesi numunelerin aşırı ısınmasını önlese de, emek yoğundur ve operatörler arasında hücre lysis'inde değişkenliğe maruz kalır. Uzun yıllar boyunca, biz başarıyla otomatik bir dondurucu değirmenhücrelerinin kriyogrinding kullanarak yüksek kaliteli maya özleri hazırlanıyor. LN2 kullanımı ile elde edilen -196 °C'lik sıcaklık biyolojik materyali proteazlar ve nükleazlar tarafından bozulmasına karşı koruyarak bozulmamış proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin alınmasını sağlar. Burada bu tekniği ayrıntılı olarak "patlamış mısır" olarak bilinen hücrelerin dondurulmuş damlacıkları oluşturmak için LN2 içine damla akıllıca eklenmesi ile bir lysis tampon hücrelerin in bir süspansiyon dondurma içeren maya hücreleri tomurcuklanma için açıklar. Bu patlamış mısır sonra yavaş yavaş çözülür ve çözünmez enkaz kaldırmak için santrifüj ile açıklığa kavuşturulmuş bir dondurulmuş "toz" özü oluşturmak için bir dondurucu değirmende LN2 altında pulverize edilir. Elde edilen ekstreler protein veya nükleik asit saflaştırma, proteomik analizler veya ko-immünoprepitasyon çalışmaları gibi downstream uygulamaları için hazırdır. Bu teknik, çeşitli mikroorganizmalar, bitki ve hayvan dokuları, mercanlar da dahil olmak üzere deniz numuneleri ve adli ve permafrost fosil örneklerinden DNA/RNA izole etmek için hücre ekstresi hazırlanması için yaygın olarak uygulanabilir.

Her iki yöntemle hazırlanan hücre özlerinde göreceli geri kazanım proteinlerini değerlendirmek için maya hücresi lysis için 4 °C'de cam boncuk frezeleme ve -196 °C'de otomatik kriyogrindyöntemi olmak üzere iki farklı yöntem karşılaştırdık. Bu çalışma için, bir tomurcuklanan maya suşu YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub--Δub-kullanmayı seçti 2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 yüksek bir kopya plazmi...

Biz bozulma ve proteinlerin denatürasyonu en aza indirgeyen bir kriyojenik dondurucu değirmen kullanarak maya veya diğer hücrelerden tüm hücre özleri hazırlanması için güvenilir bir yöntem açıklar. Hücre ekstreleri fonksiyonel protein komplekslerinin saflaştırılması, proteomik analizler, ko-immünopresipite çalışmaları ve labile protein modifikasyonlarının saptanması için uygundur.

Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Maya popüler model organizma, sadece genetik çalışmalar için değil, aynı zamanda yabani tip ve mutant maya suşları çıkarılan proteinler ve diğer makromoleküllerin biyokimyasal çalışmalar için. Ancak, onların sert hücre duvarları nedeniyle, araştırmacıların karşı karşıya olduğu önemli bir sorun hücresel içeriğe zarar vermeden maya hücrelerinin bu verimli lysis olduğunu. Bozulmamış biyolojik makromoleküllerin izolasyonu genellikle sıcaklığa bağlı olarak önemlidir.Ekstrelerin düşük sıcaklıkta hazırlanması, hücre içi proteazların ve nükleazların inaktif kalmasını sağlar ve bu da bozulmamış proteinin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin yeterli derecede izole edilmesine neden olabilir. Enzimatik, kimyasal ve fiziksel olarak maya özleri elde etmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Ancak enzimatik lysis hücre duvarı sindirmek için saflaştırılmış enzimlerin gereksinimi nedeniyle pahalı, böylece hücrelerin daha az sayıda kullanımını sınırlayan.Daha fazla enzimatik reaksiyonlar sindirim ve hücrelerin erken lysis önlemek için yakından izlenmelidir. Güçlü denatüre ajanlar kullanarak kimyasal yöntemler, etkili olsa da, proteinlerin denatürasyonu neden ve bu nedenle, protein kompleksleri veya fonksiyonel enzimlerin izolasyon için uygun değildir. Bir Fransız basınında yüksek basınç altında lysis gibi fiziksel yöntemler, dört santigrat soğukta yapılabilir ama tüm yerli proteinlerin bozulmasını ve denatürasyon önlemek için yeterince soğuk değildir.Diğer popüler fiziksel yöntemler bir harç ve havaneli, blender veya kahve öğütücü kullanımı bir lysis tampon resuspended maya hücreleri öğütmek ve damlacıkveya taşlama ve cam boncuk ve maya karışımı olarak dondurulmuş hızlı bir hazırlık boncuk çırpıcı değirmen veya sonication tarafından bir lysis. Ancak, manuel taşlama emek yoğun dur ve elde edilen protein verimi bir blender, kahve öğütücü veya boncuk çırpıcı değirmeninde sonication veya taşlama ile lysis sırasında kullanılan tekniklere bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir, hangi bir protein denatürasyon ve bozulma ile sonuçlanır ısı önemli miktarda üretir. Bu nedenle, fonksiyonel protein komplekslerinin saflaştırılması, biyokimyasal tahliller veya geçici post-translations tespiti gibi uygulamalar için en az denatürasyon ve bozulma ile kendi doğal durumunda proteinler ile maya hücre lisis elde etmek için, hücrelerin miktarı ne olursa olsun verimli lysis sağlarken ısı üretimini en aza indirecek bir kolay ölçeklenebilir lysis yöntemi kullanmak esastır.Burada eksi 196 Santigrat derecelik sıvı nitrojendeki hücrelerin lysis'i için bir kriyo dondurucu değirmeninin kullanılmasını içeren bir yöntemi açıklayarak dondurulmuş hücre ekstreleri üreterek proteinler, DNA ve RNA gibi bozulmamış fonksiyonel makromoleküllerin, denatürasyon ve bozulmayı en aza indiren çok düşük sıcaklıklarda geri kazanılmasına olanak sağlıyoruz. Bu yöntem, arkeolojik alanlardan çıkarılan veya donmuş donmuş halde bulunan adli ve hatta antik örnekler de dahil olmak üzere herhangi bir türden herhangi bir türden alınan her türlü hücre veya doku örneğinde kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Dondurucu değirmeni, paslanmaz çelik uç fişler arasında toz haline getirilecek numuneyi içeren bir polikarbonat dosyası içinde katı metal çubuğu hızla ileri geri hareket ettiren süper iletken bir elektromanyetik taşlama haznesi kullanır.Bu fiziksel hücre lisis yöntemi daha verimli bir lysis sağlar ve tekrarlanabilir daha kaliteli bir özü sonuçlanır. Maya hücreleri mil başına 10 milyon hücre konsantrasyonu ile yetiştirildi. Bu maya hücreleri önceden soğutulmuş santrifüj şişesi yerleştirildi ve 2, 400 G.'de 10 dakika döndürüldü.Bu pelet küçük bir miktar buzlu suda yeniden asılı ydı, hücreleri yıkamak için kültürün ilk hacminin yaklaşık yarısı. Yeniden askıya alınan hücreler 2, 400 G.'de 10 dakika daha eğildi. Bu pelet daha sonra yeniden askıya alınacak ve 15 ML buz soğuk lysis tampon.Peletin tamamen askıya alındığını sağlayın. Yeniden askıya alınan hücreler, bir sonraki adıma hazır olana kadar önceden işaretlenmiş bir tüpte buz üzerinde kalmalıdır. Güvenlik gözlükleri, el koruması ve laboratuvar önlüğü gibi sıvı nitrojeni kullanırken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyin.El becerimizi en üst düzeye çıkarmak için, genellikle iki çift nitril eldiven arasına sıkışmış bir çift beyaz termal eldiven giyeriz. Sıvı nitrojene maruz kaldıktan sonra kolayca yırtıldığı için dış ve nitril eldivenleri sık sık değiştirin. Laboratuarımızda, küçük bir beş litrelik sıvı azot kabına sıvı nitrojen bir aliquot aktarıyoruz.Sıvı nitrojen daha sonra kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş olan 50 ML tüp içine dökülür. Bir kez 50 ML tüp sıvı azot dolu, biz yavaş yavaş maya ekstresi ekleyin, 1.5 mililitre likit artışlarla tüp bir damla akıllıca bir şekilde. Büyük patlamış mısır pelet oluşumunu en aza indirmek için, maya süspansiyon dairesel bir hareket le eklenir.Büyük patlamış mısır peletlerinin oluşumunu daha fazla önlemek için, tüm peletlerin çapı0,3 ile 0,5 santimetre arasında olduğundan emin olmak için büyük bütüller kullanırız. Sıvı nitrojen her zaman buharlaştığından, her 1,5 mil maya süspansiyon eklemeden önce tüpü sıvı nitrojenle doldurduktan emin olun. Maya süspansiyon tüm patlamış mısır haline getirilmiştir sonra patlamış mısır ile tüp iki ila üç dakika boyunca kapağı olmadan oturup tüm artık sıvı azot buharlaşmasına izin sağlar.Sıvı nitrojenin buharlaştığından emin olmak için kapağı neredeyse tamamen kapatın ve hafifçe titretin. Eğer bir tıslama sesi varsa, bu sıvı nitrojenin henüz tam olarak buharlaşmadığını gösterir. Kapağı sıkıca kapatmadan önce kalan sıvı nitrojenin buharlaşmasını sağlamak için kapağı bir dakika kadar daha açın.Kapak erken kapatılırsa tüpteki artık sıvı patlamaya neden olabilir. Bu maya patlamış mısır eksi 80 derece C.For en az beş örnek için, sıvı azot mevcut 30 ila 35 litre olduğundan emin olmak için neredeyse süresiz olarak saklanabilir. Dondurucu değirmenini tam çizgiye doldurun ve kapağı kapatın ve dondurucu değirmeninin birkaç dakika soğumasını bekleyin.Yine, her zaman sıvı nitrojen ile uğraşırken kişisel koruyucu giysiler giymeyi unutmayın. Polikarbonat taşlama şişeleri, paslanmaz çelik uç fişler ve darbe çubuğu sıvı nitrojen ile önceden soğutulmalıdır. Sıvı nitrojen köpürmeyi durdurana kadar bu bileşenleri batık tutun.Tüm öğütme işlemi tamamlanana kadar kuru buz üzerinde tüm patlamış mısır örnekleri tutmak için unutmayın. Öğütme şişelerinden tüm sıvı nitrojeni çıkar ve patlamış mısırınızı şişeye aktar. Öğütme şişesine de manyetik bir darbe çubuğu yerleştirmeyi unutmayın.Taşlama şişesinin ucuna paslanmaz çelik fişi dikkatlice eşit olarak yerleştirerek taşlama şişesini kapatın. Biz son fişler doğru yerleştirilir ve sıkıca taşlama şişeleri mühürleme sağlamak için bir titreşim emici kauçuk destek ile ahşap bir ekmek tahtası üzerinde taşlama şişe her ucunu bang. Bu gevşek gelmez ve taşlama işlemi sırasında dondurucu değirmende dökülmesine izin vermek için son fişleri güvenli önemlidir.Dondurucu değirmen taşlama odasına bir taşlama şişe yerleştirin ve yerine kilitleyin. Dondurucu değirmen kapağını kapatın ve numuneyi 14 kırma hızında, döngü başına iki dakika boyunca üç döngü boyunca öğütün. Taşlama döngüleri tamamlandıktan sonra dondurulmuş toz hücre lisat ile şişe kilidini.Lysate'nin erimesini önlemek için, açma aletini kullanarak uç fişlerden birini sökmek için hızlı ve dikkatli çalışın. Şişe açıldıktan sonra, impactor çubuğunu çıkarın ve dondurulmuş toz ekstresini önceden soğutulmuş plastik tartım kabına hızlı bir şekilde aktarın. Ahşap ekmek tahtası üzerinde şişe vurarak mümkün olduğunca dondurulmuş özü kadar kurtarmak.Tüm toz şişeden çıkarıldıktan sonra, toz ekstrelerinin tamamını kuru buzüzerinde tutulan önceden etiketlenmiş 15 mil tüpe hızlıca aktarın. Protein bozulmasını en aza indirmek için özleri hemen kullanarak erimeye devam etmek en iyisi olsa da, gerekirse dondurulmuş toz lysate bir gecede eksi 80'de saklanabilir. Sürekli bir buz kovası bir manyetik karıştırma çubuğu kullanarak dolaşan bir buz bulamaç yavaş yavaş toz lysate dışarı çözülür.Hatta erime kolaylaştırmak için, tüplerin dışında sık sık gelişir buz kaldırmak, yaklaşık her beş dakikada bir ya da öylesine. Bir kez özler 1X proteaz inhibitör kokteyl ve 10 mikromolar proteozom inhibitörü MG132 protein bozulmasını önlemek için çözülmeye başlar. Numuneler tamamen çözüldükten sonra, bir saatten fazla sürebilir, 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca 3, 220 G'de numuneleri aşağı doğru döndürün.Bu dönüş, hücre enkazının çoğunu lysate'den temizler. Spin tamamlandığında supernatant önceden buz üzerinde soğutulmuş olan polikarbonat şişeler içine aktarım ve pelet atın. Ekstresi netleştirmek için 16, 000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca süpernate ve örnekleri santrifüj edin.Dönüş tamamlandıktan sonra, üstündeki parçayı veya santrifüj tüpünün altındaki peletli enkazı içeren bulutlu katmanı rahatsız etmeden sıvı sütunun ortasından sadece berrak süpernatant'ı dikkatlice kurtarın. Temiz lysate taze önceden soğutulmuş 15 Mil tüp içine aktarın. Kalan bulutlu sıvı, toptan olarak biraz daha geri kazanımı sağlamak için aynı hızda beş dakika süreyle son zamanlarda eritilebilir.Özler artık protein komplekslerinin saflaştırılması ve immünopresipitasyon gibi deneylerde kullanıma hazırdır. Her iki yöntemle hazırlanan göreceli olarak kurtarılan proteinleri ve hücre özlerini değerlendirmek için maya hücresi lysis'in iki farklı yöntemini karşılaştırdık: dört santigrat derecede cam boncuk frezeleme ve eksi 196 Santigrat derecede otomatik kriyo öğütme yöntemi. Bu çalışmadan biz bir tandem HIS-MYC etiketli ubiquitin ifade yüksek bir kopya plazmid taşıyan bir tomurcuklanan maya suşu kullanmayı seçti.Bu yüzden talon kobalt HIS etiket afinite boncuklar kullanarak yakınlık saflaştırma aşağıdaki, toptan özler etiketli poliubiquitinated proteinlerin kurtarma yakınlık değerlendirebilirsiniz bir monoklonal HIS tag antikor ile Batı blotting takip. Normalde çok kısa ömürlü olan poliubiquitinated proteinler her yerde proteozom makine ile hızlı bozulması nedeniyle ve böylece farklı yöntemlerle hazırlanan toptan özler kalitesini karşılaştırmak için çok iyi bir yol sunuyoruz. Ponceau lekeli membransağ yarısında gördüğümüz gibi, biz toptan özü şerit boyunca daha yoğun Ponceau boyama tarafından değerlendirilen kriyo dondurucu değirmen protokolü tarafından hazırlanan toptan özler daha yüksek bir toplam protein verimi kurtarıldı.Bu özellikle dondurucu değirmenbütün özler şeritlerin alt ve üst kısımlarında açıktır. Ayrıca, HIS etiketi Batı leke sağ yarısında gösterildiği gibi, biz kriyojenik taşlama tarafından hazırlanan toptan özleri Talon boncukkullanarak aşağı çekmek ardından HIS-MYC etiketi ubiquitinated protein daha iyi bir iyileşme gözlendi. Kriyojenik dondurucu değirmeninin hücre ekstrelerinin hazırlanmasında diğer yöntemlerden daha üstün olduğu sonucuna vardık, özellikle de aşağı akım uygulaması için fonksiyonel makromoleküller gerekli olduğunda.

preparation-cell-extracts-cryogrinding-an-automated-freezer

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Kaynak: Wiegand, D.J., ve diğerleri. Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, yüksek protein sentez hızıyla bilinen, hızla büyüyen bir bakteri olan Vibrio natriegens'ten bir hücre ekstraktının hazırlanmasını göstermektedir. Bakteri peleti, hücresel bozulmayı önlemek için buz üzerinde sonikasyondan önce lizis tamponunda yıkanır ve yeniden süspanse edilir. Lizat, çözünmeyen hücre kalıntılarını ayırmak için santrifüjlenir ve...

Vibrio natriegens'ten Ham Hücre Ekstraktının Hazırlanması

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.

Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Burada silikon nitrür membranlar ve dalma-donma bir senkrotron kriyojenik X-ışını nanoprobun ile X-ışını floresan görüntüleme öncesinde hücre kültürü için bir protokoldür. Sadece oda sıcaklığında nano-analiz yapıldığında, dondurulmuş numuneler daha da dondurularak kurutulabilir. Bunlar hücre içi element bileşimi hakkında bilgi edinmek için kritik adımlardır.

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Bu yöntem, in situ hücresel kriyotomografi ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için elektron mikroskobu (EM) ızgaralarının hazırlanması için erişilebilir ve esnek bir protokol sağlar.

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Öğrenin, maya hücrelerinden fonksiyonel makromolekülleri korumak için kriyojenik öğütme yöntemini. Bu teknik, protein bütünlüğünü koruyarak verimli hücre lizi sağlar ve biyokimyasal çalışmalar için güvenilir sonuçlar sunar.

Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet