İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Meninksler de dahil olmak üzere CNS dokularının hızlı izolasyonu, homeostatik ve patojenik koşullarda immün hücre fenotipinin, fonksiyonunun ve lokalizasyonunun kapsamlı bir analizine izin verir. Gösterilen iki yöntem, tek hücre teknikleri ve histolojik yöntemler kullanılarak aşağı akış analizi için ideal olan meninkslerle CNS dokularının hızlı bir şekilde çıkarılmasına izin verir. Temsili sonuçlar bağışıklık hücrelerinin analizine odaklansa da, bu iki yöntem mikroglia, astrositler, perisitler, endotel hücreleri, stromal hücreler ve nöronlar dahil olmak üzere CNS yerleşik hücrelerini analiz etmek için kullanılabilir.

Ötenazi uygulanmış farelerden beyin ve omurilik örneklerini izole ederek başlayın. Kafayı çıkardıktan sonra, deride orta hat kesisi yapın ve kafatasını serbest bırakmak için gözlerin üzerine çevirin. Mandibulayı kafatasından çıkarmak için burun kemiğini kesin.

Ardından mandibulayı, dili ve gözleri çıkarın. Dokuyu dış işitsel meatus boyunca serbest bırakmak için kafatasının yan kısımları boyunca kesin ve kesin. Omurilik örneğini almak için keskin bir makasla omurgaya paralel keserek göğüs kafesini omurgadan ayırın.

Omurgayı izole etmek için alt bel bölgesinde küçük bir kesi yapın, ardından omurları ortaya çıkarmak için omurga boyunca kalan kasları kesin ve çıkarın. Dekalsifikasyon yaparken, yumuşak ve esnek olup olmadığını belirlemek için kemiği günlük olarak kontrol edin. Dokuyu forseps ile EDTA solüsyonundan çıkarın, bir Petri kabına yerleştirin ve kemik yumuşaklığını 25 gauge iğne ile nazikçe test edin.

İğne kemiğe kolayca nüfuz ederse, dekalsifikasyon işlemi tamamlanmıştır. Beyindeki kafatası kapağını çıkarmak için ciltte orta hat kesisi yapın ve cildi gözlerin üzerine çevirin. Makası foramen magna'nın içine yerleştirin ve kafatasını korteksler boyunca koku alma ampulüne doğru yanal olarak kesmeye başlayın, kesileri dış işitsel meatus ve mandibulanın üzerinde tutun.

Kafatası kapağını beyinden kurtarmak için koku alma ampulünde buluşan kesiklerle aynı kesimleri karşı tarafta da yapın. Forseps kullanarak, kafatası kapağını geri soyun ve 25 milimolar HEPES ile desteklenmiş beş mililitre soğuk RPMI ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Kavisli forsepsleri beynin tabanının altına yerleştirin ve beyni kafatası kapağından kurtarmak için kaldırın.

Göğüs kafesini omurgadan ayırmak için omurgaya paralel keserek omur kolonunu ve omurilik dokusunu çıkarın. Daha sonra omur kolonunu izole etmek için alt bel bölgesinde küçük bir kesi yapın. Omurları ortaya çıkarmak için omurga boyunca kalan kasları kesin ve çıkarın.

Ardından, ekstra ince cerrahi makası omur kolonunun içine yerleştirin ve kolonun yan kenarı boyunca kesin. Vertebra kolonu ön ve arka kısma bölmek için karşı yan kenarı tamamen kesin. Omuriliği vertebral kolondan yavaş ve dikkatli bir şekilde soymak için forseps kullanın ve 25 milimolar HEPES ile beş mililitre soğuk RPMI içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra omurganın ön ve arka kısımlarını başka bir tüpe aktarın. Meninksleri kafatası kapağından çıkarmak için, kafatası kapağını RPMI ortamından çıkarın ve dış kenarın etrafından puan almak için keskin forseps kullanın. Meninksleri kafatası kapağının kenarından soyun, dural ve araknoid meninksleri çıkarmak için kazıyın ve meninksleri bir Petri kabına yerleştirin.

Meninksleri vertebral kolondan çıkarmak için, kolonu ortamdan çıkarın ve meninksleri serbest bırakmak için vertebral kolonun kenarlarından keskin forsepslerle çizin. Meninksleri omurların kenarından soymak için kavisli forseps kullanın ve meninksleri bir Petri kabına yerleştirin. 50 mililitrelik konik bir tüpe naylon ağ süzgeci yerleştirin.

Bir hücre süspansiyonu oluşturmak için, meninksleri bir süzgecin içine taşıyın ve üç mililitre HEPES takviyeli RPMI ekleyin, ardından dokuyu ve ortamı süzgeçten geçirmek için beş mililitrelik bir şırıngadan bir piston kullanın. Beyin veya omurilik dokusunu ortamla birlikte 100 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve dokuyu dibe doğru hareket ettirmek için forseps kullanın. Beyin dokusunu steril bir jiletle kıyın ve dokuyu plakanın dibinde toplayın.

Petri kabına% 10 FCS ile desteklenmiş üç mililitre RPMI ekleyin, daha sonra ortamdaki dokuyu yeniden süspanse etmek için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın ve 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Dokuya kollajenaz tip 1 ve DNaz 1 ekleyin ve tüpleri 37 derece santigrat derece su banyosunda 40 dakika inkübe edin. Dokuyu enzimlerle iyice karıştırmak için tüpleri her 15 dakikada bir ters çevirin.

İnkübasyondan sonra, 0.01 molar nihai konsantrasyon için her bir tüpe EDTA ekleyin ve kollajenazı inaktive etmek için tüpleri beş dakika daha inkübe edin. Her tüpe% 10 FCS ile desteklenmiş dokuz mililitre RPMI ekleyin, ardından tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin. Hücre peletine dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire etmek için vakumlu bir Pasteur pipeti kullanın.

Hücre peletine üç mililitre %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin, ardından son hacmi 10 mililitreye getirmek ve hücre peletini yeniden süspanse etmek için ek RPMI %10 FCS ortamı ekleyin. Tüpü ters çevirin ve iyice karıştırın, ardından tüpün dibine bir mililitre% 70 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi içeren serolojik bir pipet yerleştirin. Kabarcık yapmamaya dikkat ederek çözeltiyi yavaşça altına alın.

Gradyanı bozmamaya dikkat ederek serolojik pipeti tüpten çıkarın. Tüpü 800 G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin, ardından miyelin kalıntı tabakası da dahil olmak üzere süpernatanı tüpte iki ila üç mililitre kalana kadar aspire edin. Hücre katmanını %30 ile %70 yoğunluk gradyanı arasında toplamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın ve bunu yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Son hacmi 15 mililitreye getirmek için RPMI% 10 FCS ortamı ekleyin, ardından hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin. Bu protokol, ilerleyici multipl skleroz sırasında meninksler, beyin ve omurilikteki B ve T hücrelerini değerlendirmek için kullanıldı. CD45 yüksek periferik kaynaklı infiltre eden immün hücreleri CD45 düşük mikroglia ve CD45 negatif nöronlardan, astrositlerden ve oligodendrositlerden ayırt etmek için geçitleme yapıldı.

Sahte tedavi edilen farelerin omuriliğinde ve beyin dokusunda az sayıda CD45 yüksek hücresi mevcuttu. CD45 yüksek ekspresyonu için aynı geçit kesmesi, CD45 yüksek immün hücrelerini tanımlamak ve immün olmayan hücreleri dışlamak için meninkslerde kullanıldı. Tüm TMEV-IDD CNS dokularında, sahte tedavi edilen farelere kıyasla CD45 yüksek bağışıklık hücrelerinin yüzdelerinde artış gözlenmiştir.

Kronik TMEV-IDD sırasında, beyin ve omurilikteki CD45 yüksek bağışıklık hücreleri arasındaki B hücrelerinin yüzdesi meningeal kompartmana kıyasla daha yüksekti. Dekalsifiye beyinler ve omurilikler, CNS bölmesi içindeki B ve T hücrelerinin lokalizasyonunu tanımlamak için görüntülendi. Beynin kafatası kapağından konvansiyonel olarak çıkarılması, sağlam bir pia tabakası ile sonuçlandı, ancak kalan meningeal tabakalar hariç tutuldu.

Hem kireçten arındırılmış beyinlerde hem de omuriliklerde, tüm meningeal tabakalar sağlamdı. İzotip anahtarlamalı B hücreleri ve T hücreleri sırasıyla IgG ve CD3 ekspresyonu ile lokalize edildi. IgG'nin ER-TR7 ile birlikte boyanması, CNS parankiminde ve meninkslerde B hücrelerinin mevcut olduğunu, ER-TR7 pozitif meninksler içindeki hücresel agregatların ise çoklu IgG pozitif B hücreleri ve CD3 pozitif T hücreleri içerdiğini ortaya çıkardı.

Bu protokollerde kritik bir adım, tek hücreli süspansiyonların saflığını arttırmak ve yüksek kaliteli morfolojiye sahip histoloji dokusu elde etmek için gerekli olan CNS dokularının dikkatli bir şekilde çıkarılmasıdır. Açıklanan teknikler, homeostaz altında ve hastalık patogenezi sırasında hücre fenotipini, fonksiyonunu ve lokalizasyonunu incelemek için ideal olan CNS bölmesini işgal eden hücrelerin kapsamlı analizine izin verir.