Name: Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans kullanarak yaş ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel mekanizmalarını incelemek için hiperaktif iyon kanalı kaynaklı nekroz ve protein agregatı kaynaklı nörotoksisite yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chaniotakis M. ve Kounakis K.'ya video kaydı ve kurgusu için teşekkür ederiz. K.P., Yunanistan Araştırma ve İnovasyon Vakfı (HFRI) ve Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği'nin (GSRT) bir bağışı ile finanse edilmektedir. N.T. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC – GA695190 – MANNA), Avrupa Komisyonu Çerçeve Programları ve Yunanistan Eğitim Bakanlığı'nın bağışları ile finanse edilmektedir.

1. Hiperaktif iyon kanalları tarafından indüklenen nekrotik hücre ölümü
NOT: Mec-4 ve deg-3 dahil olmak üzere degenerinlerin gen ailesindeki fonksiyon kazanım mutasyonları, solucanlarda mekanosansasyon için gerekli olan altı dokunma reseptör nöronunne nekrotik hücre ölümünü tetikleyen hiperaktif iyon kanallarının oluşumuyla sonuçlanır3. Dejenerinlerin anormal uyarılması ile indüklenen nekroz, memelilerde eksitotoksisite ile çeşitli mekanistik ve morfolojik benzerlikler gösterir. Enerji metabolizması ve kalsiyum homeostaz bakımı nekroz sırasında nöronal sağkalım üzerinde önemli bir role sahiptir11. Hiperaktif iyon kanalları, mec-4(u231)X ve deg-3(u662)Vtarafından tetiklenen nekrotik hücre ölümünü izlemek için aşağıdaki suşlar kullanılabilir.
<ol><li>Nekrotik hücre ölümünün incelenmesi için mutant solucanların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması<ol>
<li>1. Gün: Nematode Growth Media (NGM) üzerine mec-4(u231) veya deg-3(u662) mutant nematodların L4 larvalarını seçin; Tablo 1) escherichia coli (OP50) ile bir diseksiyon stereomikroskop kullanılarak tohumlanmış plakalar.</li>
		<li>Tohumlu NGM plakabaşına 10 L4 nematod yerleştirin ve 20 °C'lik standart sıcaklıkta yetiştirin.</li>
		<li>5. Gün: Plakaları 1 mL M9 tamponuyla yıkayın(Tablo 1) ve hayvanları 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.</li>
		<li>30 s için 10.000 x g santrifüj ve supernatant kaldırın.</li>
		<li>0,5 mL beyazlatma çözeltisi (7 mL H2O, 1 mL 5 N NaOH ve 2 mL çamaşır suyu) ekleyin. NOT: Beyazlatma çözümü yavaş yavaş etkinliğini kaybeder; bu nedenle günlük olarak hazırlanmalıdır.</li>
		<li>Girdap ve solucanlar eriyene kadar periyodik olarak izleyin. NOT: Embriyoların canlılığı etkileneceği için 5 dakikadan uzun sürebeyaztlandırmadan kaçının.</li>
		<li>30 s için 10.000 x g santrifüj ve supernatant kaldırın.</li>
		<li>1 mL M9 tamponu ile iki kat pelet (yumurta) yıkayın.</li>
		<li>Yıkandıktan sonra, 200 μL M9 tampon yumurta yeniden askıya ve bir su banyosunda 34 °C'de 25 dakika kuluçka.</li>
		<li>20 °C'de ayrı bir kontrol numunesi (yumurta) grubu koruyun.</li>
		<li>Pipet 100 μL kontrol veya ısı şoku ile işlenmiş yumurtave tohumsuz NGM plakaları üzerine yerleştirin. Her tabakta en az 100-200 yumurta var.</li>
		<li>Yumurtaları kuluçkaya yatana kadar 20 °C'de kuluçkaya yatırdı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diferansiyel girişim kontrastı kullanılarak muayene için L1 larvalarının montajı (DIC; Nomarsky) mikroskopi<ol>
<li>% 2 agarose pedleri hazırlayın.</li>
		<li>Plakaları yıkamak ve 1,5 mL tüplerde L1 larva nematodları toplamak için 1 mL M9 tampon kullanın.</li>
		<li>30 s için 10.000 x g santrifüj.</li>
		<li>Supernatant çıkarın ve pelet (nematodlar) tutun.</li>
		<li>Nematodları anestezik için 100 mL 20 mM M9/levamisole tampon ekleyin. NOT: Anestezi olarak sodyum azitten kaçının. Sodyum azit mitokondriyal hasarı ve oksidatif stresi tetikler ve sonunda hücre ölümü indüksiyonuna yol açar</li>
		<li>L1 solucanları içeren M9/levamisole tampon pipet 10 μL ve % 2 agarose pedleri üzerine monte(Tablo 1).</li>
		<li>Numunenin üstüne bir kapak slipini yavaşça yerleştirin. NOT: Görüntüleme işlemi boyunca nemi korumak için kapağı oje ile kapatın.</li>
		<li>Diferansiyel girişim kontrastı kullanarak solucanları gözlemleyin (DIC; Nomarsky) mikroskopi.</li>
		<li>Nematod başına karakteristik vacuolated görünüm ile hücreleri sayarak altı dokunmatik reseptör nöronların puan nörodejenerasyon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protein agregakaynaklı nörodejenerasyon
NOT: Aşağıdaki suşlar protein agregalarına bağlı nörotoksisitenin araştırılmasında kullanılabilir: (A) dopaminerjik nöronlarda insan α-sinükleinaşırı ekspresyonu, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] ve (B) insan poliglutamin proteinaşırı ekspresyonu (PolyQ) pan-nöronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
<ol><li>Nörodejenerasyon teşpini için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması<ol>
<li>C. elegans gelişimini ve büyümesini izlemek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.</li>
		<li>1. Gün: Taze OP50 tohumlu NGM plakaları üzerinde her bir suş 15-20 L4 larvaları toplayıp aktararak transgenik nematod popülasyonunu senkronize edin. NOT: Her koşulda her bir zorlanmadan en az üç plaka kullanın.</li>
		<li>Kuluçka ve nematodlar 20 ° C standart sıcaklıkta büyümeye izin.</li>
		<li>2. Gün: 34 °C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesinde plakaları transfer ederek 30 dakika boyunca günlük ön koşullandırma gerçekleştirin. Daha sonra, önceden koşullandırılmış nematodları 20 °C'lik standart sıcaklıkta geri getirin. NOT: Farklı genetik arka planlar uzun süre maruz kalmak için yüksek sıcaklığa duyarlı olabilir.</li>
		<li>(A) Dopaminerjik nöronlarda insan α-sinüklein aşırı ekspresyonu araştırıyorsanız, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: Gün 9, dopaminerjik nöronal hücre ölümü için 7 günlük transgenik nematodları izlemek.</li>
		<li>(B) İnsan poliglutamin proteininin aşırı ekspresyonu araştırırsanız (PolyQ) pan-nöronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskobik inceleme için numunelerin montajı<ol>
<li>%2 agarose pedleri hazırlayın (Tablo 1).</li>
		<li>Agarose pedin ortasına 10 μL 20 mM M9/levamisole tampon damlası ekleyin.</li>
		<li>İlgili transgenik nematodları seçin ve m9/levamisole damlasına aktarın. NOT: Damla başına 20-30 nematod yerleştirin.</li>
		<li>Numunenin üstüne hafifçe bir kapak kaydırın. NOT: Görüntüleme işlemi boyunca nemi korumak için kapağı oje ile kapatın.</li>
		<li>İlgili numunelerin mikroskobik incelemesine devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopaminerjik nöronlarda α-sinüklein ve sitosolik GFP'yi birlikte ifade eden transgenik nematodların elde etme süreci ve veri analizi<ol>
<li>Bir kamera ile birlikte bir epifloresan mikroskobu kullanın (örneğin, EVOS FL Auto 2).</li>
		<li>20x büyütmede kafa bölgesinin z-stack görüntülerini algılayıp yakalayın.</li>
		<li>Maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin ve toplayın.</li>
		<li>Edinilen görüntülerin analizine devam edin.</li>
		<li>Aşağıdaki hücresel özellikleri puanlama tarafından nörodejenerasyon için transgenik solucanlar inceleyin, (i) dat-1organizatörü altında GFP ifade nöronlardan floresan kaybı , (ii) soma ve / veya aksonal blebbing gösteren nöronlar, outgrowths veya dendritik kaybı.</li>
		<li>Bir yazılım paketi (örneğin, Excel) kullanarak verileri içe aktarın ve analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. YFP ile kaynaşmış pan-nöronal PolyQ40 ifade transgenik nematodların edinim süreci ve veri analizi
<ol><li>Bir kamera ile birlikte bir epifloresan mikroskobu kullanın (örneğin, EVOS FL Auto 2).</li>
	<li>20x büyütmede kafa bölgesinin z-stack görüntülerini algılayıp yakalayın.</li>
	<li>Maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin ve toplayın.</li>
	<li>Fiji yazılımını kullanarak elde edilen görüntülerin analizine devam edin.</li>
	<li>Fiji programı14ile açık görüntüler .</li>
	<li>Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin. NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın.</li>
	<li>Floresan alanı el ile ayarlamak için serbest seçim aracını kullanın (RoI; örneğin, kafa).</li>
	<li>Çözümle ve Araçlar açılır menüsü nden yatırım getirisi yöneticisine ilgili yg'yi ekleyin.</li>
	<li>İşlem ve Arka Planı Çıkar'ı seçerek arka planı %50'ye çıkarın.</li>
	<li>Menü komutu Resim üzerinden eşik değerlerini ayarlama ve uygulama | Ayarla | Eşik. Tüm denemenin görüntü analizi boyunca aynı eşik değerlerini tutun ve ayarlayın.</li>
	<li>YG Yöneticisi'ndenilgili YG'yi seçin.</li>
	<li>Menü komutunu kullanarak protein agregalarının sayısını analiz edin Analiz et ve Parçacıkları Analiz Et.</li>
	<li>Edinilen her görüntü için 3,5-3,12 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Ayrı Sonuçlar penceresinden ekran değerlerini kopyalayın.</li>
	<li>Bir yazılım paketi kullanarak sonuçları yapıştırın/içe aktarın ve analiz edin.</li>
</ol>4. Rapor istatistiksel analiz
<ol><li>Her deneysel durum için en az 30 nematod kullanın. Üç biyolojik kopya gerçekleştirin.</li>
	<li>P < 0.05 ile istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) yapmak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+neuronal+necrosis%3A+rogue+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+mechanotransduction%3A+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li>
<li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson%27s+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li>
<li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li>
<li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22BioMolecular+Concepts%22%5BJournal%5D)">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Burada, yaşa bağlı nörodejenerasyonu araştıran çok yönlü C. elegans modellerinin büyüme, senkronizasyon ve mikroskobik incelemesi için yaygın olarak erişilebilir metodolojiler sokulmaktadır. Özellikle, biz değerlendirmek ve hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite1,2,,3,,4,5,7<s...

Son yirmi yılda, C. elegans yaygın nekrotik hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model organizma olarak kullanılmıştır. C. elegans son derece iyi karakterize ve eşlenmiş sinir sistemi, şeffaf vücut yapısı ve genetik ve görüntüleme yöntemleri nin çeşitli repertoire in vivo hücresel fonksiyon ve yaşlanma boyunca sağkalım izlemek için sunuyor. Böylece, nörodejenerasyon çeşitli C. elegans genetik modelleri zaten nöronal canlılık değerlendirmek için geliştirilmiştir. Özellikle, iyi tanımlanmış ve kullanılan nematod modelleri hiperaktif iyon kanal kaynaklı nekroziçerir 1,2,3 ve hücre ölümü artan protein toplama tarafından tetiklenen4,5,,6,,7,99,10 ve sıcak çarpması11,12, diğerleri arasında.
Nematodlarda ve memeli nöronlarında sonraki bir ısı stresinin tetiklediği nekrotik hücre ölümüne karşı direnç kazandırAn alt öldürücü sıcaklıklara kısa süreli maruz kalma11. İlginçtir ki, nematodların hafif yüksek sıcaklıkta günlük ön koşullandırması, iyonik dengesizlik (örn. mec-4(u231) ve/veya deg-3(u662)ve protein toplama (örn., α-synüklein ve poliQ40)11,13gibi çeşitli uyaranların neden olduğu nörodejenerasyona karşı korur.
Burada, excitotoksisite tetikli hücre ölümü, Parkinson ve Huntington hastalığı gibi insan hastalıklarının köklü modellerinde yaşa bağlı nörodejenerasyonu izlemek ve değerlendirmek için C. elegans kullanarak çok yönlü metodolojileri tanımlıyoruz. Ayrıca, nörodejenerasyon çeşitli modellerde ısı önkoşullanma nöroprotektif rolü altını çizer. Bu tekniklerin genetik ve/veya farmakolojik ekranlarla bir leşi sonucu, yeni hücre ölümü modülatörlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu potansiyel terapötik ilgi ile sonuçlanacaktır.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dehidrat (CaCl2?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>SERVA Elektroforezi</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>derece-3(u662)V veya derece-3(d)</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)Hayvanları</td><td></td> <td>20 ° C'de koruyun; C</td></tr><tr><td>DIC mikroskobu (Nomarsky)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Vert A1</td></tr><tr><td>Diseksiyon stereomikroskobu</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>EVOS Hücre Görüntüleme Sistemleri</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 suşu</td><td>Caenorhabdit Genetik Merkezi (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Petri çanaklar (60 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td>görüntü analiz yazılımı</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://fiji.sc KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>mec-4(u231)X veya mec-4(d)</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)Hayvanları</td><td></td> <td>20 ° C'de koruyun; C</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı (18 mm x 18 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>01 010 30</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Excel yazılım paketi</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,586</td><td></td></tr><tr><td>Nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin stok çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>Agar plakaları hazırlamak için standart ekipman ( otoklav, Petri kapları vb.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solucanların bakımı için standart ekipman (platin tel çekme, kuluçka makineleri vb.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>istatistiksel analiz yazılımı</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, ABD</td><td></td><td>GraphPad Prism yazılım paketi</td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&alpha;-syn, pdat-1GFP]</td><td></td><td></td><td>İstek üzerine: G. Caldwell (Alabama Üniversitesi, Tuscaloosa AL)</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans yaş İlişkili nörodejeneratif hastalıkların modellendirilmesi

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

İnsan nörodejeneratif patolojileri ile mücadele ve yaygın sosyoekonomik etkileri yönetmek küresel bir öncelik haline gelmektedir. İnsan yaşam kalitesi ve sağlık sistemi üzerindeki zararlı etkilerine rağmen, insan nörodejeneratif bozuklukların çoğunluğu hala tedavi edilemez ve engellenemez kalır. Bu nedenle, bu tür hastalıklara karşı yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesi acil bir aciliyet haline gelmektedir. Nöronal devrelerin ve fonksiyonun yaşla ilişkili bozulması, düşük solucan Caenorhabditis elegans ve insanlar gibi çeşitli organizmalarda evrimsel olarak korunur ve altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmalarda benzerlikleri belirtir. C. elegans, yaşlanma sırasında nöronal aktivite ve kalite kontrolünü değerlendirmek için iyi karakterize bir sinir sistemi, vücut şeffaflığı ve genetik ve görüntüleme tekniklerinin çeşitli repertoire'sini sunan son derece biçimlendirilebilir bir genetik modeldir. Burada, hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz (örneğin, deg-3(d) ve mec-4(d)ve protein agregası (örn. α-syunclein ve poli-glutamat) kaynaklı nörotoksisite, yaşla ilgili nöronsal inancının hücresel ve moleküler alt çökmelerini izlemek ve incelemek gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz. Bu hayvan nörodejenerasyon modellerinin bir kombinasyonu, hücre ölümü modülatörleri için genetik ve farmakolojik ekranlar ile birlikte nöronal fonksiyonun yaşa bağlı arıza benzeri görülmemiş bir anlayış yol açacaktır ve insan sağlığı ve yaşam kalitesi için geniş alaka ile kritik anlayışlar sağlayacaktır.

Hiperaktif iyon kanalları tarafından indüklenen nekrotik hücre ölümü Burada sunulan prosedürler kullanılarak mec-4(u231) ve deg-3u662 mutant embriyolar ya 34 °C'de 25 dakika kuluçkaya yatırıldı ya da 20 °C'de standart sıcaklıkta tutuldu. Kuluçka sırasında her iki grubun L1 larva evresinde nöronal hücre cesetlerinin sayısı belirlendi. Nekrotik hücre ölümü, ısı şoku ön koşullu yumurtalardan yumurtadan çıkan nematodlarda azalır (Şekil 1A-1B...

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Son yıllarda, insan ömrü, yaşam standartlarındaki gelişmeler ve tıp bilimindeki gelişmeler nedeniyle uzatıldı. Yaş birçok hayatı tehdit eden hastalıklar için en büyük risk faktörüdür, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere, Alzheimer gibi, Parkinson ve Huntington hastalığı. Burada, nöral dejenerasyonun hücresel moleküler mekanizmasını izlemek ve incelemek için hiper-aktif iyon kanalı kaynaklı nekroz ve protein agregaları nörotoksisiteye neden olan çok yönlü yeni yöntem modellerini kullanan metodolojiler gösteriyoruz.Tepe sağlıklı larvaları dört yapmak ve nematod büyüme medya plaka üzerine üç Newton nematod yapmak, e.Coli ile diseksiyon stereo mikroskop kullanarak eeving. On ve dört nematod yerleştirin, parazitik enzim plakave standart sıcaklıkta büyümek, 20 derece santigrat. Beş gün sonra, 1 mL ve 9 tampon ile plaka yıkayın ve 1.5mL tüp hayvanları toplamak.30 saniye için 30, 000 g santrifüj ve supernatant kaldırın. 0,5 mL kaplama çözeltisi ekleyin. Kaplama çözeltisi oda sıcaklığında saklanır.Girdap ve hepsi eriyene kadar periyodik olarak izleyin. Beş dakikadan uzun süreler için kaplama kaçının. 30 saniye için 10, 000 g santrifüj ve supernatant kaldırın.Paletin iki katını

modeling-age-associated-neurodegenerative-diseases-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Bu protokol, C. elegans amyotrofik lateral skleroz modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki hassas tahlil, C. elegans suşları için genel yarar ile değiştirilmiş hareketlilik ile açıklanmaktadır.

C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi

Bu yazıda, C. elegans'tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Bu röportajda, Dr. Lindquist protein katlanması, prion hastalıkları ve nörodejeneratif hastalıklar arasındaki ilişkileri açıklar. Protein katlanması modern biyolojinin temel sorun. Geleneksel biyokimyasal işlevlerine ek olarak, proteinlerin biyolojik bilgi transferi arabuluculuk ve bu nedenle bir genetik materyal olarak kabul edilebilir. Bu yeni keşfedilen proteinlerin fonksiyonu insan bozuklukları çalışmaları için önemli etkileri vardır. Dr Lindquist da model organizmaların genetik çalışmalar...

Röportaj: Protein Katlama ve Nörodejeneratif Hastalıklar Çalışmaları

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Öğrenin, Caenorhabditis elegans kullanarak yaş ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel mekanizmalarını incelemek için hiperaktif iyon kanalı kaynaklı nekroz ve protein agregatı kaynaklı nörotoksisite yöntemlerini.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Daha fazla video keşfet