Name: Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta FRAP yöntemiyle de novo protein sentez oranlarını canlı olarak ölçme tekniğini. Bu yöntem, yaşlanma ve hastalık süreçlerinde protein sentezinin modülasyonunu anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chaniotakis M. ve Kounakis K.'ya video kaydı ve kurgusu için teşekkür ederiz. K.P., Yunanistan Araştırma ve İnovasyon Vakfı (HFRI) ve Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği'nin (GSRT) bir bağışı ile finanse edilmektedir. N.T. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC – GA695190 – MANNA), Avrupa Komisyonu Çerçeve Programları ve Yunanistan Eğitim Bakanlığı'nın bağışları ile finanse edilmektedir.

NOT: Florofororlara hem transkripsiyonel hem de çevirifüzyonu çeşitli dokularda de novo protein çevirisini değerlendirmek için kullanılabilir. Protein sentezi oranları, sitoplazma, mitokondri ve nükleus7gibi farklı hücresel bölmelerde lokalize olan birden fazla protein ailesi için değerlendirilebilir. Aşağıdaki suşlar küresel ve nöronal protein sentezi oranlarını izlemek için kullanılır, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. De novo protein sentezinin izlenmesi için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması
<ol><li>Yabani tip (wt) ve mutant transgenik nematodların gelişim evrelerini ve büyümesini değerlendirmek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.</li>
	<li>1. Gün: Escherichia coli (OP50)(Tablo 1)ile tohumlanmış Nematode Büyüme Medya (NGM) plakaları üzerine istenilen floresan muhabiri taşıyan wt ve mutant transgenik hayvanların 10 L4 larvasını seçmek ve aktarmak için solucan toplama kullanın( Tablo 1).<ol>
<li>Bir Bunsen brülör üzerinde temas yerinde cam eriterek bir cam Pasteur pipet konik ucuna platin tel takarak bir solucan almak olun. Daha sonra, platin telin ucunu herhangi bir alet (örn. kıskaç veya hafif çekiç) kullanarak spatula şekline düzleştirmek.</li>
		<li>E. coli (OP50) bakterisinin tek bir kolonisini 50 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortam içeren bir şişeye dönüştürün ve sallayarak kuvözde 37 °C'de 10 saat büyüyün (200 rpm; Tablo 1). Daha sonra, bakteri kültürü 200 μL ile tohum NGM plakaları. Bakteri çim büyüme sağlamak için oda sıcaklığında bir gecede tohumlu plakalar kuluçka.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuluçka ve 20 °C standart sıcaklıkta nematodlar büyümek.</li>
	<li>5. Gün: Plakalar karışık bir transgenik solucan popülasyonu içerir. Taze tohumlu OP50-NGM plakalarında her bir suştan 15 Adet L4 larva seçin ve aktarın.</li>
	<li>6. Gün: FraP tayini yapın ve yetişkinliğin birinci gününde protein sentezhızını izleyin.</li>
	<li>Ngm plakaları içeren siklohekmidi olumlu kontrol olarak hazırlayın ve kullanın: NOT: Siklohekmidin stok çözeltisini suda 10 mg/mL konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Stok çözeltisi 4 °C'de tutun.<ol>
<li>Uv ışığı (222 μW/cm2 yoğunluk) ile tohumlu NGM plakalarını 15 dakika teşhir ederek bakterileri yok edin.</li>
		<li>Agar hacminde 500 μg/mL son konsantrasyona bakteriyel tohumlu plakaların üstüne siklohekmid ekleyin.</li>
		<li>Tabakların oda sıcaklığında 30 dakika kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Araç ve siklohekmid içeren plakalarda psod-3GFP ifade eden transgenik nematodların transferi.</li>
		<li>20 °C standart sıcaklıkta 2 saat kuluçka hayvanları.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FRAP tsöjen somatik doku muhabirleri pife-2GFP ve psod-3GFP ifade transgenik hayvanlar kullanarak
NOT: Tüm hayvan vücudunda küresel protein sentezhızını izleyin. Bu transkripsiyonel muhabirler farklı ifade düzeyleri mevcut ve her yerde birden fazla somatik dokularda ifade edilir, bağırsak da dahil olmak üzere, farinks ve vücut duvarı kasları.
<ol><li>1 günlük yetişkin transgenik hayvanları, merkezde 20°L OP50 damlası ile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına toplayıp aktarın.</li>
	<li>Kapağı çıkarın ve her plakayı bir epifloresan mikroskobunun 20 x objektif lensin altına yerleştirin.</li>
	<li>Fotobeyaztlama (ön beyazlatma) yapmadan önce bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın.</li>
	<li>Photobleach her örnek için 10 dakika. NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir.</li>
	<li>Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.</li>
	<li>Hayvanları tek tek NGM plakalarında tutun ve onları kurtarın.</li>
	<li>Her floresan muhabirin iyileşmesini en az 6 saat boyunca floresan stereomikroskopta görüntüleyin ve kaydedin.</li>
	<li>Alternatif olarak, bir epifloresan mikroskobu kullanarak floresan kurtarma değerlendirmesi yapın (örneğin, AksiyoImager Z2).</li>
	<li>Önümüzdeki 3 gün boyunca hayvan sağlığını hareket, dokunma hassasiyeti, üreme kapasitesi ve sağkalım larını izleyerek hayvan başına sağlık durumunu dikkatle değerlendirin. Fotobeyaztlama sonrası hasar belirtileri gösteren nematodlar ileri analizdışı bırakıldı.</li>
</ol>3. Örneklerin montajı ve pan-nöronal sitoplazmaik GFP, punc-119GFP ifade transgenik nematodlar kullanarak FRAP analizi gerçekleştirmek
NOT: Sinir halkasının bulunduğu baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama ile pan-nöronal protein sentezini izleyin.
<ol><li>% 2 agarose pedleri hazırlayın.</li>
	<li>Agarose pedin ortasına 10 μL'lik bir M9 arabelleği ekleyin.</li>
	<li>Transfer 5 transgenik nematodlar m9 tampon bir damla içine pan-nöronally sitoplazmik GFP ifade.</li>
	<li>Sıvı yaymak için bir kirpik kullanın. NOT: Hayvanlar agar içine M9 emiciliği nedeniyle 2 dakika içinde azaltılmış hareketleri görüntüler.</li>
	<li>Bir "kirpik" çekme kullanarak çakışma önlemek için nematod konumunu değiştirin.</li>
	<li>Örneği epifloresan mikroskobunun 40 x objektif lensin altına yerleştirin. NOT: Kapak kayması kullanmayın.</li>
	<li>Bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın (çamaşır suyu).</li>
	<li>Photobleach 90 saniye için ilgi hedeflenen alan. NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir.</li>
	<li>Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.</li>
	<li>Fotobeyaztlı nematodlara 10 μL'lik m9 tamponu ekleyin.</li>
	<li>Hayvanlar 5 dakika lığına iyileşsin.</li>
	<li>Nematodları merkezde 20 μL OP50 damlaile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına aktarmak için "kirpik" pick veya pipet kullanın.</li>
	<li>Epifloresan stereomikroskop altında her 1 saatte bir her numunenin görüntüsünü yakalayın. NOT: Fotobeyaztlama dan sonraki iyileşme süresi için t=0'ı sayın.</li>
</ol>4. FRAP tahlil sırasında yakalanan görüntülerin veri analizi
<ol><li>Edinilen görüntüleri yazılım (örneğin, Fiji) kullanarak analiz edin.</li>
	<li>Yazılımla görüntüleri açın.</li>
	<li>Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin. NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın.</li>
	<li>Floresan bölgeyi (örn. tüm vücut, baş, bağırsak) manuel olarak ayarlamak için Freehand Selection aracını kullanın.</li>
	<li>Her zaman noktası için ilgi alanının ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için Analyze açılır menüsünden Ölçüm komutunu seçin. NOT: Floresan geri kazanım yüzdesi fotobeyazlama sonrası çekilen referans görüntüleri kullanılarak hesaplanır.</li>
</ol>5. Rapor istatistiksel analiz
<ol><li>Her bir suş ve/veya koşulda en az 20 - 25 nematod kullanın. NOT: Üç biyolojik kopya yapılmalıdır.</li>
	<li>P < 0.05 ile istatistiksel analiz için istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li>
<li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).</li>
<li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li>
<li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growing+Toolbox+for+Protein+Synthesis+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547(2009).</li>
<li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li>
<li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li>
<li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li>
<li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).</li>
<li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+receptor+p62%2FSQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).</li>
<li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+aggregation%2C+and+degradation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Protein sentezi modülasyonu organizmahomeostaziçin gereklidir. Yaşlanma sırasında, küresel yanı sıra spesifik protein sentezi tedirgin. Son çalışmalar protein çeviri dengesinin yaşlanmayı doğrudan kontrol ettiğini ve yaşlanmanın sadece yaşlanma sürecinin bir yan ürünü olmadığını ortaya koymaktadır. Özellikle, ökaryotik inisiyasyon faktörü 4E (eIF4E) gibi çeviri makinelerinin temel bileşenleri, çeviri başlatma sırasında mRNA kapamasını kolaylaştırır ve böylece kap-bağımlı protein çevirisi oranı oksidatif strese neden olur...

Protein sentezi ve bozulma organizmahomestazis için gereklidir. Yaşa bağlı hastalıkların çok sayıda kusurlu protein üretimi 11tarafındanteşvik edilir ,2. Küresel protein çeviri oranlarını ölçmek için, ribozomal profilleme gibi biyokimyasal teknikler vardır, hangi ribozom korumalı mRNA parçalarıderin sıralama içeren ifade izlemek için yanı sıra yeni protein sentezi3. Bu yöntem, ribozomlara artan RNA ilişkisi mutlaka artan çeviri anlamına gelmez gibi, çeviri oranları dolaylı bir okuma olmanın yanı sıra, yüksek maliyet ve başlangıç malzeme büyük miktarda bir gereklilik gibi teknik dezavantajları vardır. Öte yandan, proteomik tabanlı yöntemler nabız metabolik profilleme ile doğrudan protein nicelliği için izin kitle spektrometresi analizi4,5. Ancak, bu kolayca in vivo kullanılamaz sınırlı zamansal çözünürlüğe sahip yarı-nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, proteinin etiketlenmesi ilgi hayvan /doku eşit olmayan dağıtılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntemlerin her ikisi de dokuya özgü veya hücreye özgü protein çeviri oranlarındaki değişimleri tüm hayvanlarda veya dokularda gizleyebilirsiniz.
Caenorhabditis elegans çok sayıda yetiştirilebilir kolay kullanımlı bir model organizmadır6. Ayrıca, genetik amenability ve şeffaflık vivo canlı görüntüleme için izin verir. Bu protokol, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası floresan geri kazanımını kullanarak protein sentezoranlarını saptamak için yapılan metodolojiyi açıklamaktadır. Floresan proteinlerin transgenik ekspresyonundan yararlanıyoruz, ya tüm organizmada ya da belirli dokularda/hücrelerde. Transgenik hayvanlar, yaygın olarak ifade edilen bir genin promoter'ı kullanarak GFP'yi ifade edebilir veya belirli hücre tiplerini hedeflemek için dokuya özgü bir organizatör olabilir. Bu teknik belirli bir proteinprotein sentez oranlarını incelemek için belirli bir organizatör genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz pedleri %</td><td></td><td></td><td></td>2</tr> <tr><td>Kalsiyum klorür dehidrat (CaCl2?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>SERVA Elektroforezi</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>sikloheksimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon stereomikroskobu</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>edc-3 (ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>Hayvanları 20 derecede koruyun; C</td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Görüntüleyici Z2</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 suşu</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan diseksiyon stereomikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Lumar V12</td></tr><tr><td>Greiner Petri kapları (60 x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td>IFE-2 (OK306); Ex[pife-2GFP, pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>Hayvanları 20 derecede koruyun; C</td></tr><tr><td>görüntü analiz yazılımı</td><td>Fiji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO<>sub4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>LB sıvı ortam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9 tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları (75 x 25 x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Excel yazılım paketi</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>N2; Ex[pife-2GFP; pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>Hayvanları 20 derecede koruyun; C</td></tr><tr><td>N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>Hayvanları 20 derecede koruyun; C</td></tr><tr><td>N2; Ex[punc-119GFP; pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>Hayvanları 20 derecede koruyun; C</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,586</td><td></td></tr><tr><td>Nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin stok çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>Agar plakaları hazırlamak için standart ekipman (otoklav, Petri kapları, vb.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solucanların bakımı için standart ekipman (platin tel çekme, kuluçka makineleri vb.).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>istatistiksel analiz yazılımı</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, ABD</td><td></td><td>GraphPad Prism yazılım paketi</td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solucan penası</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans de novo protein sentez oranlarının değerlendirilmesi

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Sağlıklı bir proteom bakımı hücre ve organizmahomestaz için gereklidir. Protein çevirikontrolü ile bozulma arasındaki dengenin bozulması yaşa bağlı çok sayıda hastalığı teşvik eder. Proteostaz kalite kontrol mekanizmalarının azalması yaşlanmanın bir özelliğidir. De novo protein sentezini saptamak için biyokimyasal yöntemler hala sınırlıdır, çeşitli dezavantajları vardır ve canlı hücrelerde veya hayvanlarda yapılamaz. Caenorhabditis elegans, şeffaf ve kolayca genetiği değiştirilmiş olmak, görüntüleme teknikleri kullanarak protein sentezoranlarını izlemek için mükemmel bir modeldir. Burada, fotobleaching (FRAP) sonrası floresan kurtarma kullanarak vivo de novo protein sentezini ölçmek için bir yöntem tanıtmak ve tanımlamak. Belirli hücre veya dokularda floresan proteinleri ifade eden transgenik hayvanlar floresan fotobeyazrlama ile sonuçlanan güçlü bir ışık kaynağı tarafından ışınlanır. Buna karşılık, floresan kurtarma değerlendirilmesi hücre ve / veya ilgi dokularda yeni protein sentezi anlamına gelir. Bu nedenle, transgenik nematodların, genetik ve/veya farmakolojik müdahalelerin birleşimi ve protein sentezoranlarının canlı görüntülenmesi yaşa bağlı proteostazın çöküşüne aracılık eden mekanizmalara ışık tutabilir.

Burada sunulan prosedür kullanılarak, protein sentez oranlarını ilgili protokollere göre değerlendirmek için aşağıdaki somatik muhabirleri ifade eden yabani tip ve mutant transgenik nematodlar, pife-2GFP, psod-3GFP ve punc-119GFP kullanılmıştır. Özellikle ife-2 promotörü kullanılarak somatik dokularında sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve ife-2 mutant solucanlar fotobeyaztlama dan hemen sonra ve 5 sa...

Burada, de novo protein sentezini in vivo değerlendirmek için, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası nematod Caenorhabditis elegans ve floresan kurtarma kullanan radyoaktif olmayan ve noninvaziv bir yöntem sınıyoruz ve tanımlıyoruz. Bu yöntem, protein sentezinin yeni modülatörlerini belirlemek için genetik ve/veya farmakolojik ekranlar ile kombine edilebilir.

Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Protein sentezi oranı hastalık ve yaşlanma sırasında tedirgin. Fotobeyaztma veya FRAP sonrası floresan geri kazanımı, in vivo protein sentezi oranının ölçülmesine olanak sağlar. Biz fotobeyazrlama sonra yeni protein sentezini izlemek için bir model olarak, GFP ifade şeffaf C.elegans solucanlar kullanın.Yaygın olarak ifade edilen veya belirli hücre veya dokularda farklı organizatörler altında GFP ifade transgenik solucanlar kullanarak floresan iyileşmesini ölçmek için pratik kurallar salıyoruz. Ayrıca, bu yöntem gerçek zamanlı olarak protein sentezi hızı izleme sunuyor. Yabani tip ve mutant transgenik nematodların gelişim aşamalarını ve büyümesini değerlendirmek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.E.coli ile tohumlanmış nematode büyüme medya plakaları üzerine istenilen floresan muhabiri taşıyan vahşi tip ve mutant transgenik hayvanların 10 L4 larvaseçin. Kuluçka ve 20 santigrat derece standart sıcaklıkta nematodlar büyümek. Dört gün sonra, plaka transgenik solucanların karışık bir popülasyon içerir.Taze tohumlu OP50 NGM plakalarında her bir suştan 15 Adet L4 larva seçin ve aktarın. FRAP tayini yapın ve yetişkinliğin ilk gününde protein sentezhızını izleyin. Ertesi gün, olum

assessment-de-novo-protein-synthesis-rates-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümlülük oranını nicelendirmek için basit ve düşük maliyetli bir prosedür sunar. Özel ekipman veya solucan toplama uzmanlığı olmadan popülasyonlar arasında embriyonik anormalliklerin doğrudan tespit edilmesini sağlar. Protokol, genetik mutasyonların, RNA girişimiyle yapılan gen çökerliklerinin ve diyetin etkilerini nicelendirmek için kullanılabilir.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümcüllük oranının nicelendirilmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta FRAP yöntemiyle de novo protein sentez oranlarını canlı olarak ölçme tekniğini. Bu yöntem, yaşlanma ve hastalık süreçlerinde protein sentezinin modülasyonunu anlamak için kullanılır.

Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet