Name: Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Öğrenin farelerde aferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme yöntemini. Bu cerrahi teknik, lenfatik endotelyal hücrelere minimal hasar vererek homeostaz ve bağışıklık yanıtlarını incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ava Zardynezhad'a el yazmasının okunması için teşekkür ediyor. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR, PJT-156035) ve Kanada Yenilik Vakfı SL (32930) ve Yujia Lin için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81901576) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan çalışmalarının kurumsal ve devlet etiği ve hayvan işleme komitesi tarafından onaylanması gerekmektedir.  Bu sağkalım dışı bir ameliyat.
1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>70 mL 100 etanol ile %100 etanol karıştırılarak 100 mL 70 etanol hazırlayın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araçları otoklav ve sterilizasyon korumak için ameliyat öncesi ve sırasında% 70 etanol araçları tutmak.</li>
	<li>Bir enjeksiyon cihazı hazırlayın.<ol>
<li>Yaklaşık 30 cm polietilen boru (0,28 mm çapında) kesin. 30 G x 1/2 iğnenin ucunu (a iğnesi) polietilen tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir 30 G x 1/2 iğne (iğne B) yerinden ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın.</li>
		<li>İğne A'yı 1 mL'lik tüberkülin şırıngasına takın. NOT: Bu polietilen boru için, tüpteki 1,6 cm sıvı 1 μL20'yekarşılık gelmektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tuzlu (bakteriyostatik %0.9 [w/v] sodyum klorür) 10:1 ketamin/ksilazin karışımını (10 mg/mL ketamin ve 1 mg/mL ksilazin) hazırlayın. Kullanmadan önce çözümü taze olarak hazırlayın.</li>
</ol>2. Hayvanın ameliyata hazırlanması
NOT: 6−10 haftalık fareler kullanın. Hem dişi hem de erkek fareler kullanılabilir. Bu çalışmada 6−10 haftalık, C57BL/6 dişi fare kullanıldı. Bu yöntem farelerin diğer suşları için uyarlanabilir.
<ol><li>Ketamin/ksilazin karışımının intraperitoneal 250 μL enjekte ederek fareyi anestezi k. Fare tamamen uyuyana kadar bekleyin. Tam anesteziyi algılamak için farenin parmak kıskacına tepki vermemesini sağlayın.</li>
	<li>Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş.</li>
	<li>Bacak etrafında tüydökücü krem uygulayın ve 5 dakika bekleyin. Artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin ve steril su ile bacak temizleyin. Çalışma alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Etanol kesi bölgesiyle sınırlı.</li>
</ol>3. Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş
NOT: Sağ bacak dikişli ve sol bacak sham kontrol olarak kullanılır. Lenfatik sütür protokolü (adım 3.1−3.8) 20−30 dk sürer.
<ol><li>Fareyi yatkın bir pozisyonda tutun ve sağ bacaktaki operasyon alanını ortaya çıkarmak için cerrahi bantla düzeltin.</li>
	<li>Intradermally 5 μL enjekte 1% Evans mavi boya veya 9 cm enjeksiyon cihazı tüp sıvısı ayak takımı içine. Evans mavilenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj yapabilirsiniz. NOT: İnsülin şırınga küçük hacimli enjeksiyon için kontrol etmek kolay değildir. Hacim enjeksiyon cihazı kullanılarak daha doğru bir şekilde kontrol edilebilir. Lenfatik damarlar deri altında mavi boya ile görselleştirilmiş. Kapsamlı eğitim ile, her iki afferent lenfatik damarlar yağ dokusunda şeffaf damarlar olarak çıplak gözle görülebilir, Saphenous arter paralel. Kapsamlı eğitim ile, boya potansiyel rahatsızlıkları endişeleri olduğu durumlarda Evans Mavi boya enjekte etmeden damarları dikiş mümkündür.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından 5 mm bir kesi sitesi seçin. Makasla deride küçük bir kesi (~5 mm) yapın. İnce çalışma forsepsleri kullanarak, kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak(Şekil 1A). NOT: Gerekirse, lenfatik damarları ortaya çıkarmak için küçük bir deri parçası çıkarılabilir.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında pLN'lere giden her iki afferent lenfatik damarı tanımlayın(Şekil 1B). NOT: Pedten pLN'ye kadar iki tane varlıklı lenfatik damar vardır. Her ikisi de tamamen lenf akışını engellemek için dikişli olması gerekir.</li>
	<li>Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı bir şekilde sütür iğnesini (0.7 metrik veya daha küçük) afferent lenfatik damar ile Safenöz arter arasına yerleştirin ve iğneyi afferent lenfatik damarın etrafına hafifçe çekin. Yavaşça dikiş dizesini çekin ve arkasında dikiş ipi yaklaşık 2 cm bırakın. İğne tutucuyu kullanarak ipi sıkıca bir cerrahın düğümü ile bir lenfatik damarı dikmeye yardımcı olun(Şekil 1C). NOT: Kesinin altındaki doku, uzun süre havaya maruz kalarak kuruyabilir. Kesimümkün olduğunca küçük yapmak ve sütürü hızlı bir şekilde yapmak (yani, 5 dk içinde) dokunun kurumasını önleyecektir. Bir pamuklu bez ile tuzlu küçük bir hacim uygulayarak doku nemini koruyun.</li>
	<li>Yavaşça hiçbir Evans Mavi boya dikiş site geçer ve daha sonra makas ile aşırı dize kesmek sağlamak için ayak takımı masaj.</li>
	<li>Diğer afferent lenfatik damarda(Şekil 1D)aynı dikiş adımlarını (yani, 3.5 ve 3.6 adımlarını) gerçekleştirin. 3.5'te damarları dikmek için kullanılan dikişle deri kesisini kapatın(Şekil 1E).</li>
	<li>Sham kontrolü için, intradermally sol ayak takımı% 1 Evans mavi boya 5 μL enjekte ve lenfdamarları görselleştirmek için ayak takımı masaj. Bir eksizyon ile cildi açın ve daha sonra damar(Şekil 1F)dikiş olmadan yara kapatın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, çalıştırılan fareleri 2−4 saat boyunca izleyin. Bacağın dikiş tarafı uyluk yayılmış Evans Mavi ile ödem göstermelidir, kontrol bacak ayak sınırlı Evans mavi boya gösterecektir. Fareler uyanırsa, ötanaziye kadar anestezi kılması için ek bir ketamin/ksilazin karışımı enjekte edilir.</li>
</ol>4. Lenf akışının takibi
<ol><li>Ameliyattan hemen sonra, hem kontrol hem de lenfatik dikişli bacağın ayak altına %2 floresan iyotiyosiyanat (FITC) enjekte edilir.</li>
	<li>400 μL ketamin/ksilazin karışımı ile fareleri ötenazi yapın ve fareler tamamen anestezi aldığında servikal çıkık yapın.</li>
	<li>Popliteal fossa dan pLNs toplamak ve dikkatle 2, 6 ve 12 saat FITC enjeksiyonu sonrası diseksiyon mikroskobu altında pLNs etrafında perinodal yağ dokusu kaldırın.</li>
	<li>PLN'leri, kriyomold'un yan tarafına bakan medüller sinüs bölgesine en uygun kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle gömün (Şekil 1G,H).</li>
	<li>Bir kriyotom kullanarak 20 μm dondurulmuş bölüm hazırlayın.</li>
	<li>FITC dağılımını belirlemek için kriyokesitleri konfokal mikroskop altında görüntüleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li>
<li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlymphatics+and+lymph+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li>
<li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li>
<li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions%2C+measured+in+draining+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li>
<li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li>
<li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation%3A+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li>
<li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li>
<li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li>
<li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li>
<li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li>
<li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GlyCAM-1%2C+an+endothelial+ligand+for+L-selectin%2C+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li>
<li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+organ+development%3A+from+ontogeny+to+neogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li>
<li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li>
<li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li>
<li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Lenf akışını niçin bloke etmek, sağlıklı ve hastalıklı koşullarda LN'ye antijen teslimatını manipüle etmede geniş uygulamalara sahip olacaktır. Sürekli lenf akışının NN'lerin boşaltIlmesinde bağışıklık yanıtını nasıl düzenlediğini incelemek için antijen doğumunun zamanlamasını kontrol etmek için bu yöntemi kullanmak mümkündür. Lenf akışı kesinti Bu yöntem de lenf etkileri hücre komedizasyonu, hücre aktivasyonu, hücre göçü ve LN hücre hücre etkileşimleri nasıl çalışma için kullanılabilir.
Özell...

Lenfatik sistemin mekansal organizasyonu, hücre dışı sıvıyı verimli bir şekilde çıkarmak ve antijenleri ve antijen sunan hücreleri (AAP'ler) drenaj lı LN'lere verimli bir şekilde çıkarmak için yapısal ve fonksiyonel destek sağlar. İlk lenfatik damarlar (lenfatik kılcal damarlar olarak da adlandırılır) sıvıların, hücrelerin ve diğer malzemelerin çevredeki hücre dışı alanlardan etkili bir şekilde toplanmasını kolaylaştıran kesintisiz hücreler arası kavşakları nedeniyle son derece geçirbilebilirdir1. İlk lenfatik damarlar sıkı hücreler arası kavşaklar, sürekli bir bazal membran ve lenfatik kas kapsama sahip lenfatik damarları toplama içine birleştirmek. Lenfatik damarların toplanması, toplanan lenflerin drenaj LN'lerine taşınmasından ve sonunda lenflerin dolaşıma geri dönmesinden sorumludur2,3. Drenaj LN içine lenf itmek toplama lenf damarları afferent lenfatik damarlar4,5,6,7. Afferent lenfatik damarların tıkanıklığı LNs içine lenf akışını engelleyebilir, hangi lenf akışının işlevini incelerken yararlı bir tekniktir.
Önceki çalışmalar lenf akımı antijenler ve AAP'ler taşıma önemli bir rol oynadığını göstermiştir, yanı sıra LN homeostazı korumak. Doku kaynaklı AKO'ların, tipik olarak aktif olarak göç eden dendritik hücreler (DCs) ile T hücrelerini aktive etmek için LN'ye giden varlıklı lenfatik damarların t hücreleri8. Fikir serbest form antijenler, mikroplar veya çözünür antijenler gibi, ln yerleşik AAP'leri etkinleştirmek için LN lenf ile pasif akışsonon yıl içinde kabul kazanıyor olmuştur 9,10,11,12. Lenf ile seyahat serbest form antijenler LN seyahat enfeksiyon dan sonra dakika sürer, ve LN-yerleşik hücre aktivasyonu 20 dakika içinde stimülasyon oluşabilir. Bu çok göç DC'lerin aktivasyonu daha hızlıdır, hangi drenaj LN girmek için 8 saatten fazla sürer9. Bağışıklık koruma başlatmak için antijenler taşıma yanı sıra, lenf de mikroortamını korumak için LN sitokinler ve DCs taşır, ve bağışıklık hücresi homeostaz desteklemek için13,14. Daha önce, afferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme lenfln 15, 16,17homeostatik T hücre ve B hücre homing desteklemek için gerekli HEV fenotip korumak için gerekli olduğunu gösterdi . CCL21LNDC ve T hücre konumlandırma yönlendirir kritik bir kemokin 8,18. Lenf akışının engellenmesi LN'deki CCL21 ekspresyonunu kesintiye uğratur ve LN19'dakiDC ve T hücre konumlandırmasını ve/veya etkileşimini potansiyel olarak kesintiye uğratur. Böylece, lenf akışını niçin bloke etmek, LN'deki bağışıklık yanıtlarını düzenleyen LN mikroortamını bozarak antijen/DC'nin drenaj LN'ye erişimini doğrudan veya dolaylı olarak engelleyebilir. Lenf akışının işlevini daha iyi araştırmak için, pediyeden pLN'ye kadar olan afferent lenfatik damarları dikerek farelerdeki lenf akışını engellemek için deneysel bir protokol(Şekil 1)sunulur. Bu yöntem sağlıklı ve hastalıklı koşullarda lenfatik fonksiyon üzerinde gelecekteki çalışmalar için önemli bir teknik olabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>% 0.9 Sodyum Klorür Salin< / güçlü ></td> <td>Baxter</td><td>JB1323</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü>% 100 etanol< / güçlü ></td> <td>Greenfield Global</td><td></td><td>Calgary Üniversitesi dağıtım hizmetleri UN1170.</td></tr><tr><td>< güçlü > tüy dökücü krem< / güçlü ></td> <td>Nair</td><td></td><td>Nair Hassas Formül Epilasyon Cr & egrave; Tatlı Badem Yağı ve Bebek Yağı ile, 200 ml. Veya benzer bir ürün.</td></tr><tr><td>Evans Blue boya</td><td>Sigma Life Science</td><td>E2129-10G</td><td>1 ml Evans mavi boya için 10 ml PBS'ye 0,1 g Evans mavisi ekleyin. Evens Blue solüsyonu 0,22 mm'lik filtrelerden süzülecek ve 1 ml'lik alikotlarda steril tutulacaktır.</td></tr><tr><td><güçlü>Floresein izotiyosiyanat izomeri I (FITC)</güçlü></td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>F7250-1G</td><td></td></tr><tr><td><>güçlüForseps Dumont #3</güçlü></td><td>WPI</td><td>500337</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Forseps Dumont #5</güçlü></td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Enjeksiyon aparatı</güçlü></td><td></td><td></td><td>Polietilen borunun bir ucunu 30G ve zamanlara bağlayın; &frac12; iğne. İğneye 1 ml'lik bir TB şırınga takın. İğne milini başka bir 30G ve kezden çıkarın; &frac12; iğne. 30G'nin kör ucunu yerleştirin ve kez; &frac12; iğne mili borunun diğer ucuna. Bu borunun iç çapı 0,28 mm'dir. Bu nedenle, borudaki 1,6 cm sıvı 1 &mu;l'dir.</td></tr><tr><td><güçlü>İnsülin şırıngası< / güçlü></td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>IRIS Forcep düz</güçlü></td><td>WPI</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>IRIS makas</güçlü></td><td>WPI</td><td>14218-G</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ketamin</güçlü></td><td>Narketan</td><td>DIN 02374994</td><td>Ketamin ve Xylazine tedarikçileri genellikle kurumsal ve resmi düzenlemelere tabidir.</td></tr><tr><td>< güçlü > İğneler (26Gx3 / 8) < / güçlü ></td> <td>Becton Dickinson ve Şirketi (BD)</td> <td>305110</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İğneler (30Gx1 / 2) < / güçlü ></td> <td>Becton Dickinson ve Şirketi (BD) 305106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Paton İğne Tutucu< / güçlü ></td><td>ROBOZ</td><td>RS6403</td><td>Düz, Kilitsiz; Tırtıklı</td></tr><tr><td><güçlü>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</güçlü></td><td>Sigma Life Science</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Polietilen boru</güçlü></td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td><güçlü> Cerrahi bant (1.25cmx9.1m)</güçlü></td><td>Transpore</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Cerrahi bant (2.5cmx9.1m)</güçlü></td><td>Transpore</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sütür</güçlü></td><td>Davis ve Geck CYANAMID Kanada</td><td>11/04</td><td>0.7 metrik monofilament polipropilen</td></tr><tr><td><güçlü>Şırınga (1ml)</güçlü></td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>VANNAS makas</güçlü></td><td>Dünya Hassas Aletleri (WPI)</td><td>14122-G</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ksilazin< / güçlü></td><td>Rompun</td><td>DIN02169606</td><td>Ketamin ve Ksilazin tedarikçileri genellikle kurumsal ve hükümet düzenlemesi altındadır.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü >Diseksiyon mikroskobu< / güçlü ></td> <td>Olympus</td><td></td><td>Olympus S261 (522-STS OH141791) ışık kaynağı ile: Olympus Highlight 3100</td></tr><tr><td><güçlü > Konfokal mikroskop< / güçlü ></td><td>Leica</td><td></td><td>SP8</td></tr></tbody></table>

farelerde afferent lenfatik damarlar dikerek lenf akışını engelleme

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Lenfatik damarlar doku sıvıdengesini korumak ve antijenler, sitokinler ve hücreleri drenaj lenf düğümleri (LNs) taşıyarak bağışıklık koruma optimize kritik öneme vardır. Lenf akıtıcıdamarların işlevini incelerken lenf akışının kesilmesi önemli bir yöntemdir. Murine footpad popliteal lenf düğümleri için afferent lenf damarları (pLNs) iyi pLNs içine lenf drenaj için tek yol olarak tanımlanır. Bu afferent lenfatik damarları niçin seçici olarak pLN'lere lenf akışını önleyebilir. Bu yöntem drenaj pLN lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışında girişim sağlar, afferent lenfatik damarlar, yanı sıra alan etrafında diğer lenfatik damarlar. Bu yöntem lenf etkileri yüksek endotel venülleri nasıl çalışma için kullanılmıştır (HEV) ve LN kemokin ekspresyonu, ve nasıl lenf fonksiyonel lenfatik damarların yokluğunda LN çevreleyen yağ dokusu ile akar. Lenfatik fonksiyonun öneminin giderek daha fazla tanınması ile, Bu yöntem ln mikroçevre ve bağışıklık yanıtları düzenleyen lenfatik damarların işlevini daha da çözmek için daha geniş uygulamalar alacaktır.

Lenfatik damar sütür önceki çalışmalarda kullanılmıştır15,16,17,19, lenfatik damarların moleküler biyoloji daha iyi anlaşılmadan önce lenf akışının işlevini incelemek için önemli bir araç olarak görev yaptı. Bloke lenf akımı LN homeostazı keser, Hangi HEVs LN optimal lenfosit homing için gerekli kritik gen ekspresyonu kaybetmeyol açar15,16</s...

Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş ile lenf akışını engellemek için bir protokol sunulmaktadır.

Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Bu yöntem lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışını keser, ve abluka zamanlaması kesin kontrolü ile, lenf akışının lenf düğümünde homeostazı ve bağışıklık yanıtlarını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Prosedürü niçin göstermek için yardımcı Jingna Xue, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Bir enjeksiyon cihazı hazırlamak için, polietilen boru yaklaşık 30 santimetre kesti.İğne A'nın ucunu tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir iğne çıkarmak ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın. Sonra bir mililitrelik tüberkülin şırınga iğne A takın.Kullanmadan hemen önce, tuzlu bir 10:1 ketamin-ksilazin karışımı hazırlayın. Ketamin/ksilazin karışımının 250 mikrolitresini intraperitoneal olarak enjekte ederek fareyi anestezi ettikten sonra, ayak ucu tutam ile tam anestezi sağlar. Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş, sonra bacak etrafında tüy dökücü krem uygulayın.Beş dakika sonra, artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin, sonra steril su ile bacak temizleyin. Ameliyat alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Fareyi yatkın bir konuma yerleştirin ve ameliyat alanını sağ bacakta ortaya çıkarmak için cerrahi bant kullanın.Intradermally farenin sağ ayak pedi içine enjeksiyon cihazı tüp sıvının% 1 Evans mavi boya, ya da dokuz santimetre beş mikrolitre enjekte. Sıvılenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından beş milimetre bir kesi sitesi bulmak.Bir makas kullanarak, yaklaşık beş milimetre uzunluğunda küçük bir kesi yapın. Sonra kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak için ince operasyon forseps kullanın. Popliteal lenf düğümlerine giden afferent lenfatik damarların her ikisini de tanımlayın.Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı afferent lenfatik damarlar ve safenöz arter arasında dikiş iğnesi takın. Yavaşça afferent lenfatik damarların etrafında iğne çekin. Dikkatle arkasında dikiş dize yaklaşık iki santimetre bırakarak, dikiş dize çekin.Bir cerrahın düğüm bağlamak için iğne tutucu kullanın. Yavaşça hiçbir Evans mavi boya dikiş site geçer sağlamak için ayak yastığı masaj, sonra makas ile aşırı dize kesti. Dikiş diğer afferent lenfatik damarlar, daha sonra lenfatik damarlar için kullanılan aynı dikiş ile deri kesi kapatın.Sham kontrolü için, intradermally sol ayak yastığı% 1 Evans mavi boya beş mikrolitre enjekte ve ayak pedi masaj. Bir kesi ile deri açın ve sonra damar dikiş olmadan yara kapatın. Ameliyat sonrası fareyi izlerken sağ bacakta ödem gösterilmelidir, Evans mavi boya uyluk yayılırken, kontrol bacağında evans mavi boya ayak yastığıile sınırlı olarak gösterilmelidir.Ameliyattan hemen sonra, intradermally sağ ayak pedi ve sol hem de% 2 FITC 10 mikrolitre enjekte. FITC enjeksiyonundan iki, altı ve 12 saat sonra, ötenazi yapılan farelerin fossasından popliteal lenf düğümlerini toplayın. PLN'lerin etrafındaki perinodal yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.PLN'leri, kriyo kalıbının yan tarafına bakan medüller sinüs alanı ile optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömün. 20 mikron dondurulmuş bölümleri hazırlamak için bir kriyotom kullanın. PLN'lerde FITC dağılımını belirlemek için, konfokal mikroskop altında kriyo-kesitleri görüntüleyin.Confocal görüntüler iki yakalanan, altı, ve 12 saat FITC enjeksiyonundan sonra afferent lenf damarları dikiş sonra popliteal lenf düğümlerinde FITC birikimi önemli ölçüde azaltılmış göstermektedir. PLN'lerde kalan FITC tercihen lenf nodu sinüslerinde birikmişti. Perinodal yağ dokusunun konfokal görüntüleri lenfdamarları dikiş tarafından bloke edildiğinde göstermek, FITC lenf düğümü sinüsler doku girer, ama etkili lenf düğümleri boyunca dağıtılan değil.Bu yöntemi denerken, bu kan damarı ve lenfatik damar arasında dikiş iğnesi ekleme kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu adımın başarısız lığı damarları kırabilir. Bu yöntemi yaptıktan sonra, lenf akışının bağışıklık korumasını nasıl düzenlediğini incelemek için fareleri enfeksiyon veya diğer bağışıklık stimülasyonu ile aşılamak mümkündür.Lenf akışının işlevi iyi anlaşılamamıştır. Bu yöntem lenf akımı yokluğunda lenf düğümünde hücre göçleri çalışmak için kullanılabilir.

blocking-lymph-flow-by-suturing-afferent-lymphatic-vessels-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Aynı fare zaman içinde bir bağışıklık yanıtı ilerlemesini takip etmek, lenf düğümleri sırayla ameliyatla çıkarılabilir. Burada, bu teknik gerçekleştirilebilir açıklanmıştır.

Mürin Yüzeysel lenf nodu Cerrahisi

Bu videoda, interstisyel doku boşluğunda kuyrukta şişmeye yol açan anormal bir sıvı birikimi olan murin kuyruğu lenfödemi oluşturmak için in vivo bir teknik açıklanmaktadır. Model, lenfödem mekanizmalarını ve tedavisini incelemek için uygulanır.

Murin Tail Lenfödem Modeli: Murin Tail'de Sürekli Lenfödem Oluşturmak İçin İn Vivo Bir Teknik

Bu video, bir fare modelinden kasık boşaltma lenf nodunun cerrahi izolasyon prosedürünü göstermektedir. Karın bölgesinin kesisi, cerrahi olarak alınan kasık lenf bezine erişim sağlar. Hasat edilen yarı saydam kasık lenf nodu immünolojik çalışmalar için kullanılabilir.

Bir Murin Modelinden Kasık Drenaj Lenf Nodunun Çıkarılması

Bu video, sıçanlarda mezenterik lenf kanalını kanüle etmek için bir tekniği göstermektedir. Bu yöntem, lenf sıvısında bulunan bileşenlerin tüm hacmine doğrudan erişim sağlar.

Lenf sıvısını toplamak için bir sıçan modelinde mezenterik lenf kanalı kanülasyonu

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Bu hayvan modeli, araştırmacıların farelerin arka eklerinde en az 8 hafta süren istatistiksel olarak anlamlı sekonder lenfödemi indüklemelerini sağlar. Model lenfödem patofizyolojisi çalışma ve yeni tedavi seçenekleri araştırmak için kullanılabilir.

Farelerin Hindlimb Sekonder Lenfödem Indükleme için Gözden Geçirilmiş Bir Yöntem

Lenfödem, lenfatik disfonksiyondan kaynaklanan ekstremite şişmesidir. Lenfödemin kronik bir murine kuyruk modelini ve kuyruğa genetik kargo teslimatı için doku nanotransfeksiyon teknolojisinin (TNT) yeni kullanımını anlatıyoruz.

Bir Murine Kuyruk Lenfödem Modeli

Bu protokol, mezenterik lenf düğüm zinciri boyunca dört istasyonun her biri için güvenli ve iyi tolere edilen fare mezenterik lenfadenektomyatı için bir hayatta kalma prosedürünü tanımlar. Bu prosedür, distal kolon, proksimal kolon ve/veya ince bağırsak ile lenfatik iletişimin seçici olarak bozulmasına olanak tanıyacak şekilde uyarlanabilir.

Bölgeye Özgü Bağırsakla Lenfatik İletişimin Seçici Bozulması İçin Molin Mezenterik Lenfadenektomi

Burada, diğer değişkenlerin etkisini en aza indirmek ve cerrahiye dayalı araştırmaların yürütülmesini standartlaştırmak için derin servikal lenf nodunun veya afferent lenfatik damarının sıçanda posterior fasiyal ven ile anastomoz adımlarını açıkça tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Modelinde Derin Servikal Lenfovenöz Anastomoz için Cerrahi Protokoller: Lenf Nodu ve Lenfatik Damar Anastomozları

El yazması, servikal lenfatik damarların (cLV) çeşitli fizyolojik fonksiyonlarını ve beyin drenajı ile klirens mekanizmalarının modülasyonuna yönelik terapötik stratejileri test etmek için farelerde servikal lenfatik damarların ve lenf akışının in vivo çalışması için yenilikçi bir yöntem sunmaktadır.

Farelerde Servikal Lenfatik Damarların Kasılması ve Lenf Akışının In vivo İki Foton Görüntülemesi için Tekrarlanabilir Kurulum

Öğrenin farelerde aferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme yöntemini. Bu cerrahi teknik, lenfatik endotelyal hücrelere minimal hasar vererek homeostaz ve bağışıklık yanıtlarını incelemeyi sağlar.

Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme

Daha fazla video keşfet