Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme
14 Mayıs 2020
Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş ile lenf akışını engellemek için bir protokol sunulmaktadır.
Bu yöntem lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışını keser, ve abluka zamanlaması kesin kontrolü ile, lenf akışının lenf düğümünde homeostazı ve bağışıklık yanıtlarını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Prosedürü niçin göstermek için yardımcı Jingna Xue, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Bir enjeksiyon cihazı hazırlamak için, polietilen boru yaklaşık 30 santimetre kesti.
İğne A'nın ucunu tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir iğne çıkarmak ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın. Sonra bir mililitrelik tüberkülin şırınga iğne A takın.
Kullanmadan hemen önce, tuzlu bir 10:1 ketamin-ksilazin karışımı hazırlayın. Ketamin/ksilazin karışımının 250 mikrolitresini intraperitoneal olarak enjekte ederek fareyi anestezi ettikten sonra, ayak ucu tutam ile tam anestezi sağlar. Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş, sonra bacak etrafında tüy dökücü krem uygulayın.
Beş dakika sonra, artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin, sonra steril su ile bacak temizleyin. Ameliyat alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Fareyi yatkın bir konuma yerleştirin ve ameliyat alanını sağ bacakta ortaya çıkarmak için cerrahi bant kullanın.
Intradermally farenin sağ ayak pedi içine enjeksiyon cihazı tüp sıvının% 1 Evans mavi boya, ya da dokuz santimetre beş mikrolitre enjekte. Sıvılenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından beş milimetre bir kesi sitesi bulmak.
Bir makas kullanarak, yaklaşık beş milimetre uzunluğunda küçük bir kesi yapın. Sonra kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak için ince operasyon forseps kullanın. Popliteal lenf düğümlerine giden afferent lenfatik damarların her ikisini de tanımlayın.
Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı afferent lenfatik damarlar ve safenöz arter arasında dikiş iğnesi takın. Yavaşça afferent lenfatik damarların etrafında iğne çekin. Dikkatle arkasında dikiş dize yaklaşık iki santimetre bırakarak, dikiş dize çekin.
Bir cerrahın düğüm bağlamak için iğne tutucu kullanın. Yavaşça hiçbir Evans mavi boya dikiş site geçer sağlamak için ayak yastığı masaj, sonra makas ile aşırı dize kesti. Dikiş diğer afferent lenfatik damarlar, daha sonra lenfatik damarlar için kullanılan aynı dikiş ile deri kesi kapatın.
Sham kontrolü için, intradermally sol ayak yastığı% 1 Evans mavi boya beş mikrolitre enjekte ve ayak pedi masaj. Bir kesi ile deri açın ve sonra damar dikiş olmadan yara kapatın. Ameliyat sonrası fareyi izlerken sağ bacakta ödem gösterilmelidir, Evans mavi boya uyluk yayılırken, kontrol bacağında evans mavi boya ayak yastığıile sınırlı olarak gösterilmelidir.
Ameliyattan hemen sonra, intradermally sağ ayak pedi ve sol hem de% 2 FITC 10 mikrolitre enjekte. FITC enjeksiyonundan iki, altı ve 12 saat sonra, ötenazi yapılan farelerin fossasından popliteal lenf düğümlerini toplayın. PLN'lerin etrafındaki perinodal yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
PLN'leri, kriyo kalıbının yan tarafına bakan medüller sinüs alanı ile optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömün. 20 mikron dondurulmuş bölümleri hazırlamak için bir kriyotom kullanın. PLN'lerde FITC dağılımını belirlemek için, konfokal mikroskop altında kriyo-kesitleri görüntüleyin.
Confocal görüntüler iki yakalanan, altı, ve 12 saat FITC enjeksiyonundan sonra afferent lenf damarları dikiş sonra popliteal lenf düğümlerinde FITC birikimi önemli ölçüde azaltılmış göstermektedir. PLN'lerde kalan FITC tercihen lenf nodu sinüslerinde birikmişti. Perinodal yağ dokusunun konfokal görüntüleri lenfdamarları dikiş tarafından bloke edildiğinde göstermek, FITC lenf düğümü sinüsler doku girer, ama etkili lenf düğümleri boyunca dağıtılan değil.
Bu yöntemi denerken, bu kan damarı ve lenfatik damar arasında dikiş iğnesi ekleme kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu adımın başarısız lığı damarları kırabilir. Bu yöntemi yaptıktan sonra, lenf akışının bağışıklık korumasını nasıl düzenlediğini incelemek için fareleri enfeksiyon veya diğer bağışıklık stimülasyonu ile aşılamak mümkündür.
Lenf akışının işlevi iyi anlaşılamamıştır. Bu yöntem lenf akımı yokluğunda lenf düğümünde hücre göçleri çalışmak için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, afferent lenfatik damarların cerrahi olarak dikilmesi yoluyla lenf akışının engellenmesine yönelik bir protokol sunmaktadır. Yöntem, lenfatik endotel hücrelerine minimum düzeyde zarar verilmesine ve blokaj zamanlamasının hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanıyarak, lenf akışının homeostaz ve bağışıklık yanıtları üzerindeki etkilerinin incelenmesini kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- İmmünoloji
- Vasküler Biyoloji
Arka Plan
- Lenfatik damarlar, bağışıklık yanıtlarında kritik bir rol oynar.
- Lenf akışını anlamak, homeostazın incelenmesi için gereklidir.
- Mevcut yöntemler lenfatik endotel hücrelerine zarar verebilir.
- Deneysel doğruluk için lenf akışının hassas bir şekilde kontrol edilmesi gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Lenf akış blokajı için cerrahi bir protokol sunmak.
- Lenf akışının immün yanıtlar üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Deneyler sırasında lenfatik yapıların zarar görmesini minimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Afferent lenfatik damarların cerrahi olarak sütüre edilmesi.
- Polietilen tüpler kullanılarak bir enjeksiyon düzeneğinin hazırlanması.
- Hassas enjeksiyon için şırıngaların ve iğnelerin bağlanması.
- Prosedürün bir lisansüstü öğrencisi tarafından gösterilmesi.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, lenfatik akışı etkili bir şekilde engellemektedir.
- Lenfatik endotel hücrelerinde minimum düzeyde hasar gözlemlenmiştir.
- Blokaj zamanlaması üzerinde hassas kontrol sağlanmıştır.
- Prosedür, lenfatik fonksiyonların ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır.
Sonuçlar
- Cerrahi protokol, lenfatik araştırmalar için değerli bir araçtır.
- Lenf akışının anlaşılması, bağışıklık yanıtları hakkındaki bilgileri artırabilir.
- Bu yöntem, çeşitli deneysel düzeneklere uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Afferent lenfatik damarların cerrahi olarak dikilmesi yoluyla lenf akışının engellenmesi, immün homeostaz ve antijen transportundaki lenfatik fonksiyonun hassas bir şekilde incelenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, lenf bağımlı mekanizmaları izole ederek immünomodülatör ilaç geliştirme süreçlerinde hedef doğrulamasını destekler. Lenf nodu mikroçevre modülasyonunu değerlendiren preklinik modeller için mekanistik bir risk azaltma aracı sunar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değeri: İmmün düzenleme yolaklarındaki lenf bağımlı hedeflerin fonksiyonel doğrulamasını sağlar.
- Operasyonel Değeri: Lenf akışının kemokin ekspresyonu ve yüksek endotelyal venül fonksiyonu üzerindeki etkisine dair hipotez testlerine olanak tanır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşiklerin lenf yoluyla antijen taşınımı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için valide edilmiş lenfatik blokaj sistemlerini hazırlar.
- Operasyonel Değer: Lenfatik fonksiyon taramalarındaki standart analiz koşulları için tekrarlanabilir blokaj zamanlaması sağlar.
Translasyonel ve Klinik Öncesi Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnflamasyon ve bağışıklık yanıtı çalışmalarında, lenf düğümü mikroçevresinin hastalıkla ilişkili modellenmesini destekler.
- Operasyonel Değer: Müdahale sırasında lenfatik yapı bütünlüğünü koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürecin sürekliliğini sağlar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden lenf modüle eden terapötiklerin preklinik validasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliği kapsamında yer almaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Bağışıklık hücresi taşınmasında ve LN homeostazında lenf akışının mekanistik sorgulamasını destekler.
- Tarama: Lenfatik blokaj etkinliği için fonksiyonel bir çıktı olarak FITC antijen birikiminin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Lenf nodlarında ve perinodal dokudaki antijen dağılımının konfokal görüntüleme tabanlı kantifikasyonunu kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Klinik öncesi hastalık modellerinde lenfatik fonksiyonu bağışıklık yanıtı sonuçlarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla bağışıklıkla ilgili hedef doğrulaması boyunca lenf akışını modüle etmek için yeniden kullanılabilir bir cerrahi platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Blokajın kesin zamansal kontrolünü sağlayarak lenf-immün etkileşimlerdeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Endotel hücre hasarını en aza indirerek boylamsal immün izleme için doku canlılığını korur.
- Stratejik Değer: Lenf bağımlı etki mekanizmalarını netleştirerek immünomodülatör geliştirmedeki devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İmmün korumadaki lenf akışı bağımlılığına dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Damar tanımlama ve sütür tekniği konusunda mikrocerrahi uzmanlığı gerektirir.
- Aferen lenfatik damara erişim için diseksiyon mikroskobu ve hassas enstrümantasyon gereklidir.
- Fonksiyonel doğrulama için ödem ve boya difüzyonuna yönelik standartlaştırılmış postoperatif izleme gerektirir.
- Fare suşları arasındaki farklılıklar ve lenfatik damar değişkenliğine göre adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Zamanla oluşabilecek kompansatuar lenfatik yeniden yapılanma nedeniyle akut blokaj çalışmalarıyla sınırlıdır.
