Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi
June 18th, 2020
Hücre ölümü sırasında salınan ekstrasellüler DNA (ekDNA) proinflamatuar ve inflamasyona katkıda bulunur. Yaralanma yerinde ekDNA ölçümü hedef organda terapötik tedavinin etkinliğini belirleyebilir. Bu protokol böbrek dokusunda ekDNA ölçümü otomatikleştirmek için bir makine öğrenme aracı nın kullanımını açıklar.
Glomerülonefrit önemli hücre ölümü ve ekstrasellüler DNA salınımı ile patolojik glomerüler yaralanmaya neden olur. Bu protokol, patolojik yaralanma sırasında serbest bırakıldığı yerde hücre dışı DNA'nın görüntülenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin avantajı böbrekhücre ölümü ekstrahücre DNA ölçer olmasıdır.
Serum veya idrarın aksine, hücre dışı DNA ölçümü patolojik hasar için bir taşıyıcı belirteçtir. Bu yöntemin önemi hem ekstrasellüler DNA boyama ve görüntü analizi kolayca romatoid artrit ve lupus gibi diğer otoimmün hastalıklara aktarılabilir olmasıdır. Bu yöntem böbrek histolojisi temel bir bilgi gerektirir.
Glomerüler ekstrasellüler DNA'nın doğru saptanmasını sağlamak için, araştırmacı glomeruli doğru tanımlamak gerekir. Hücre dışı DNA boyama için, ilk ısı 60 santigrat derece bir slayt raf ilgi örnekleri 60 dakika boyunca bir duman kaputuna çözücü iki 40 dakikalık değişiklikler slaytlar daldırma önce. İkinci daldırma sonra, tedavi başına beş dakika için% 100 etanol iki kez ve% 70 etanol bir kez rehydrate.
Son tedaviden sonra, 10 dakika yüksek bir düdüklü tencerede kaynayan antijen alma çözeltisi içine slaytlar yerleştirmek için maşa kullanın. Antijen epitopsların maskesini attıktan sonra düdüklü tencereyi sıcaktan lavaboya aktarın ve hemen kapağın üzerinde soğuk musluk suyu çalıştırın. Slaytların, numuneleri 0,01 molar PBS'de iki kez yıkama başına beş dakika boyunca orbital shaker'da iki kez yıkamadan önce antijen alma çözeltisinde 20 dakika boyunca dengelemesine izin verin.
İkinci yıkamadan sonra, böbrek dokusu örnekleri etrafında daire çizmek ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albumin% 10 tavuk serum 60 mikrolitre ile nonspesifik boyama engellemek için bir hidrofobik kalem kullanın. Kuluçka sonunda, bir gecede nem haznesinde 4 santigrat derecede birincil antikor 60 mikrolitre ile engelleme çözeltisi değiştirin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında 40 dakikalık kuluçka için her slaytiçin uygun bir florofor konjuge ikincil antikor 60 mikrolitre eklemeden önce yıkama başına iki dakika PBS bir orbital shaker slaytlar yıkayın.
Kuluçka sonunda, pbs slaytlar gösterildiği gibi yıkayın, herhangi bir potansiyel formalin indüklenen otofloresan söndürmek için% 70 etanol% 0.3 Sudan siyah tedavi izledi. 30 dakika sonra, herhangi bir çökelti kaldırmak için musluk suyunda slaytlar yıkayın ve daha fazla Sudan siyah çökelti oluşumunu önlemek için 10 dakika PBS slaytlar batırın. Kuluçka sonunda, dapi ile takviye montaj çözeltisi üç 60 mikrolitre damla ile konfokal cam kapakları üzerine slaytlar monte ve oje ile kapakları mühür.
Slaytların oda sıcaklığında 24 saat boyunca tedavi etmesine izin verin. Standart protokollere göre konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüye kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme sırasında herhangi bir hareketi önlemek ve görüntüleme çözünürlüğünü artırmak için etanol kapakları temizlemek için oje ile kapakları mühür emin olun.
Slayt başına 20 glomeruli görüntüledikten sonra ImageJ'deki eğitilebilir Weka Segmentasyon eklentisini açın ve ilk görüntüyü ImageJ araç çubuğuna bırakın. Görüntü, renk ve bölünmüş kanalları tıklatın. Birincil antikor boyama gösteren bir görüntü görünür.
Tek görüntülerin birleştirilmiş dosyasını oluşturmak için renk ve birleştirme kanallarını tıklatın. Bir açılır pencere kutusu, her kanala atanacak bir renk isteyen görünür. Bileşik oluştur'u işaretleyin ve kaynak resim kutularını tutun ve Tamam'ı tıklatın. Birleştirilmiş bileşik görüntü görüntülenir.
Bir kılavuz olarak birincil antikor boyama kullanarak, glomerüler tuft etrafında ilgi bir bölge çizin. Tek mavi DAPI görüntüsünde Gaussian bulanıklığı gerçekleştirmek için işlem, filtreler ve Gaussian bulanıklığı tıklatın. Bulanıklığı 1'e iki olarak ayarlayın.
Görüntü biraz bulanık olacak, ama çekirdekleri pürüzsüz görünecektir, arka plan yumuşamış olacak. Ardından, eklentileri, segmentasyonu ve eğitilebilir Weka Segmentasyon'u tıklatın ve bozulmamış çekirdekleri izlemek için serbest el aracını kullanın. İlgi çeken tüm çekirdekler eklendiğinde, birinci sınıf ekle kutusu, arka plan alanlarını sınıf iki kutusuna göre sınıflandırmak için satır aracını kullanın.
Yeni sınıf oluştur'u tıklatın ve DAPI lekeli nükleer olmayan DNA'yı anahatlamak için satır aracını kullanın. Tren sınıflandırıcısı'nı tıklatın ve olasılık elde edin. Beyaz olarak vurgulanan seçim nesnesi ile tüm bileşenlerin siyah beyaz bir görüntü elde etmek için fareyi geçiş.
Bu resmi çoğaltmak için resmi tıklatın ve çoğaltın. Görüntü altında, ayarlayın ve eşik. Yalnızca hücre dışı DNA gözlemlenene kadar eşiği ayarlamak için fare düğmesini kullanın.
Eşik ten sonra, işlem, ikili tıklatın ve ikili yapmak ve ilgi daha önce oluşturulan glomerüler bölge kopyalayın. Düzenleme, seçim ve seçimi geri yüklemek için seçmek için Kontrol Kaydırma E tuşuna basın. Glomerulus içinde sadece hücre dışı DNA parçacıklarını ölçmek için, parçacıkları analiz ve Tamam'ı tıklatın. Parçacık sayısını, alanını, ortalama pikselleri ve hücre dışı DNA içeren glomerülin yüzdesini gösteren bir sonuç sayfası oluşturulacaktır.
Sınıflandırıcıyı hücre dışı DNA sınıflandırıcısı olarak kaydetmek için sınıflandırıcıyı kaydet'i tıklatın ve verileri kaydedin. Modeli sonraki görüntülere yeniden uygulamak için, yük sınıflandırıcısı ve kaydedilen sınıflandırıcı dosyasını seçmeden önce gösterildiği gibi ilk görüntü işlemini tekrarlayın. Günlük menüsü açılır ve modeli çalıştırın.
Model çalıştırdıktan sonra, yük verilerini tıklatın ve extracellularDNA.arff'ı seçin. Ardından sonuç oluştur'u tıklatın. Ortaya çıkan görüntü tüm çekirdekleri, arka planı veya hücre dışı DNA'yı almayı başaramadıysa, sınıflandırıcıyı yeniden eğit'i tıklatın ve gerektiğinde daha fazla sınıflandırıcı ekleyin.
Burada temsili DNA ve beta aktin boyama gösteren tek kanallı görüntüler gösterilmiştir. İki görüntünün birleştirilmesi, gösterildiği gibi eğitilebilir Weka Segmentasyonu kullanılarak fare böbrek glomerüli içindeki hücre dışı DNA'nın ölçülmesi için glomerüler alanın etrafına ilgi çekici bir bölge çizilmesine olanak sağlar. Bu model, kontrol eden bir hastadan alınan böbrek biyopsisi örneklerindeki hücre dışı DNA'yı belirlemek veya miyeloperoksidaz ANCA ilişkili vaskülitli bir hastanın böbrek biyopsisi ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir.
Buna ek olarak, bu program böbrek dokusu örnekleri içinde diğer lekeler tercüme edilebilir, örneğin, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar ve ANCA ilişkili vaskülit hücre dışı miyeloperoksidaz birikimi için leke. Daha da önemlisi, aynı veriler birden çok kullanıcı tarafından analiz edildiğinde önemli bir fark gözlenmez. Analizin en kritik adımı, Weka Segmentasyon programı için dersleştirici olarak glomeruli ile arka plan, çekirdekve hücre dışı DNA yeterli örnekler sunmaktır.
Bu yöntem kolayca aktarılabilir. Örneğin, hücre ölümü farklı türleri daha fazla analiz apoptoz veya nekroz için belirteçleri karşı belirli antikorlar için boyama yoluyla araştırılabilir. Tekniğimiz otoimmün böbrek hastalığında TLR ekspresyonunun değerlendirilmesi veya insan böbrek biyopsilerinde hücre dışı miyeloperoksidaz ekspresyonu gibi diğer inflamatuar süreçlerde kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, böbrek dokusunda hücre ölümü sırasında salınan hücre dışı DNA'nın (ecDNA) görselleştirilmesini sağlar ve bu da patolojik glomerüler hasarı anlamak için çok önemlidir. Yöntem, ecDNA'nın böbrek hasarı için bir vekil belirteç olarak ölçülmesini sağlayarak tedavi etkinliği hakkında bilgiler verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Patoloji
Arka Plan
- Glomerülonefrit önemli hücre ölümüne ve ecDNA salımına yol açar.
- ecDNA proinflamatuardır ve enflamasyona katkıda bulunur.
- ecDNA ölçümü tedavi tedavi etkinliğini gösterebilir.
- Bu teknik diğer otoimmün hastalıklara da uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Böbrek hasarı sırasında ecDNA'nın salım yerinde görselleştirilmesi.
- ecDNA'nın patolojik hasar için bir belirteç olarak belirlenmesi.
- Diğer durumlara uyarlanabilecek bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Böbrek dokusunda ecDNA'nın görselleştirilmesi.
- ecDNA'yı kantitatif olarak ölçmek için görüntü analizi.
- Böbrek histolojisine ilişkin temel bilgi gereklidir.
- Otomasyon için makine öğrenimi araçlarının uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Böbrek dokusunda ecDNA'nın başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- ecDNA seviyeleri ve böbrek hasarı arasında korelasyon gösterilmesi.
- Yöntemin diğer otoimmün hastalıklara aktarılabilir olması.
- Hasar değerlendirmesi için güvenilir bir vekil belirteç sağlanması.
Sonuçlar
- ecDNA ölçümü, böbrek patolojisini anlamak için değerli bir araçtır.
- Teknik, terapötik izlemeyi artırabilir.
- Otoimmün hastalık araştırmasında daha geniş uygulamalar için potansiyel.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables objective, automated quantification of extracellular DNA (ecDNA) in formalin-fixed paraffin-embedded kidney tissue, addressing a critical gap in measuring cell death directly at the site of pathological injury. By leveraging trainable Weka segmentation for image analysis, the method reduces manual annotation burden and provides reproducible, quantitative readouts that support mechanistic de-risking in autoimmune disease models. The approach enhances target validation confidence by linking ecDNA release to specific cell death pathways (apoptosis, necrosis, NETs) in glomerulonephritis, offering translational relevance for biomarker development and preclinical efficacy assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying ecDNA as a direct readout of glomerular cell death in disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by distinguishing ecDNA levels between healthy and diseased tissue, clarifying mechanism of action.
- Predictive Value: Generates quantitative data to assess target engagement and biological de-risking in preclinical vasculitis models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs (particle count, area, percentage glomeruli positive) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Demonstrates no significant inter-user variability when sufficient training examples are provided, supporting assay robustness.
- Scalability: Trained classifier can be applied to subsequent images, enabling batch processing and reducing manual intervention in large-scale studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a consistent ecDNA measurement approach across murine models and human FFPE biopsies.
- Biomarker Alignment: ecDNA serves as a disease-relevant surrogate marker for renal injury, aligning with pathophysiological processes in ANCA-associated vasculitis.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective comparison of ecDNA levels across treatment groups to inform go/no-go criteria in therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, enabling standardized assay deployment in screening, and providing quantitative analytics for translational decision-making.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking ecDNA release to specific cell death mechanisms (e.g., NETosis, apoptosis) in glomerulonephritis models.
- Screening: Generates standardized, quantitative image-based readouts that support assay reproducibility and compound effect evaluation.
- Analytics: Delivers measurable outputs (ecDNA particle area, count, glomerular occupancy) that allow comparative analysis between experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity from murine GN models to human kidney biopsy analysis via conserved ecDNA detection in FFPE tissue.
- Enterprise Reuse: Trainable Weka classifier is a reusable asset adaptable to other organs and stains (e.g., NETs, ecMPO) beyond initial ecDNA application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing objective, spatially resolved ecDNA quantification in the target organ.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through machine learning–driven segmentation, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by delivering quantitative, mechanism-linked biomarkers for preclinical vasculitis programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on ecDNA modulation efficacy in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kidney histology to accurately identify glomeruli and define regions of interest.
- Depends on confocal imaging infrastructure and ImageJ with trainable Weka segmentation plugin for analysis.
- Necessitates standardization of staining, antigen retrieval, and autofluorescence quenching steps across laboratories.
- Requires sufficient training data (background, nuclei, ecDNA examples) to build a robust classifier for reliable segmentation.
- Limited to 2D image analysis; z-stack or 3D ecDNA quantification would require additional validation.
