Böceklerde Kritik Termal Limitlerin Yüksek İş Gücü Tahlilleri
June 15th, 2020
Termal sınırlar organizmaların tolere ettiği ortamları tahmin edebilir, ki bu da hızlı iklim değişikliği karşısında değerli bilgilerdir. Burada açıklanan böceklerde kritik termal minima ve ısı nakavt süresini değerlendirmek için yüksek iş gücü protokolleri vardır. Her iki protokol de iş hacmini en üst düzeye çıkarır ve tahlillerin maliyetini en aza indirir.
Termal tolerans, tür dağılımlarının ve iklim değişikliğine tepkilerin önemli bir bileşenidir. Burada küçük böceklerde ısı ve soğuk toleransı hızla değerlendirmek için yöntemler salıyoruz. Soğuk toleransı ölçmek için kullanılan bu yöntemler, kritik termal minimum ve ısı toleransı ile, ısı devrilen zaman yoluyla yüksek üretim, yarı otomatik ve minimum ekipman gerektirir.
Prosedürü gösteren David Awde, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır. Kritik bir termal minimum tisma kurmak için, sıcaklık kontrollü sıvı banyosu nda güç ve bir program çalıştırmak için play tuşuna basın, banyo sıcaklığını 25 santigrat dereceye yükseltip koruyun. 5,08 santimetre çapında filtre ile sütunun üst kısmındaf değiştirmeden önce, sıvı banyo sütunu 25 santigrat derece ulaşmak için izin vermek için beş ila 10 dakika bekleyin.
Huni aracılığıyla sütuniçine kendi gıda şişesinden yaklaşık 40 sinek dokunun ve hızlı bir şekilde fiş ile huni değiştirin, herhangi bir sinek kaçmasına izin vermemeye özen. O zaman sineklerin yerleşmesine izin ver. Bazen sinekleri tırmanmaya teşvik etmek için alt fişe dokunarak.
Beş dakika sonra, kritik termal minima rampa programına başlamak için sıvı banyosu kazancının başlangıç düğmesine basın. Bilgisayardaki termal çift kayıt yazılımını açmak için tıklatın ve basamak süresince her saniye sütun içindeki sıcaklığı kaydetmeye başlamak için kaydı tıklatın. Sıcaklık verilerinin daha sonra Drosophila huni monitöründeki verilerle birleştirilebilmesi için her sıcaklık kaydının ikinciye özgü zaman damgasını içerdiğinden emin olun.
15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne beş mililitre %90 etanol ekleyin ve tüpü sütunun altındaki bir rafa yerleştirin. Bazen tırmanmak için alttaki sinekleri ikna etmek için sütunun alt fişe dokunun. Sineklerin çoğu bir levrek üzerinde veya sütunun üst kısmında 15 santigrat derece olacak.
15 santigrat derecede, Drosophila huni monitörüne 75 milimetrelik dış çaptaki cam huni yerleştirin. Alt fişi çıkarın ve etanol fiş hala herhangi bir sinek toplamak. Retort halkasını, huni monitörünü ve huniyi sütunun altında olacak şekilde ayarlayın.
Huninin dudağının sütunun altını tamamen mühürlediğinden ve huninin altını 15 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirdiğinden emin olun. Drosophila huni monitör yazılımını açın. Yazılım hemen sinekler kritik termal minima ulaşmak hangi zaman ve tarih kayıt başlayacaktır.
Kritik termal minima ulaşan sinekler, nöromüsküler fonksiyonlarını kaybedecek ve tüneklerinden düşecekler, Drosophila huni monitörü aracılığıyla. Tüm sineklerin kritik termal minima'larına ulaşıp ulaşmadığını izlemek için, sıcaklık azaldıkça, üst fişi kontrol edin ve sineklerin hala tünemiş olup olmadığını kontrol edin. Tüm sinekler, kritik termal minima ulaştığınızda, Drosophila huni monitörü hareket ettirin ve huni uzakta sütun açılış.
Nadir durumlarda, sinekler kritik termal minima ulaşabilir, ancak sütunsıkışmış kalır. Bu sinekleri çıkarmak için üst fişi açın. Yüksek üretim ısı sıcağı yıkmak için, bir aspiratör ve septum kapağı kullanın, tek tek karbondioksit yatıştırıcı sinekler yüklemek için, değiştirilmiş bir 96 iyi hiçbir alt plaka her kuyuiçine ve net bir sıkı montaj kapağı ile plaka mühür.
Sonra gıda bir kaynağı üzerine plaka yerleştirin ve sinekler en az 48 saat boyunca 96 iyi plaka için alışmak için izin verin. İnceleme günü, 30 dakika sonra tepsinin altındaki beyaz kağıt karşı plaka alt ile kuvöz içine sinek kültür plakası yerleştirin, 37,5 santigrat derece kuvöz ayarlayın. Tepsideki ve web kamerasının çerçevesine iyi sütun ve satır adlarının yönünü not edin ve yönünü doğrulamaya yardımcı olmak için plakanın kenarları na ve kenarlarına renkli bant yerleştirin.
Plaka konumlandığında, kuvöz kapısını kapatın ve video kayıt yazılımındaki kaydı tıklatın. İki saat sonra, tüm sinekler, son dinlenme noktasına ulaştı ve hareket durdu olup olmadığını görmek için kayıt kontrol edin. Tüm sinekler hareket durdu, durdurmak ve sinekler bertaraf tıklayın.
Video dosyasını açın ve her bir kuyudaki her bir sineğin nakavt süresini kaydedin. Denemeler ve gözlemler arasındaki kesinti süresini düşüren ısının en tutarlı ölçüsü, bir sineğin son dinlenme noktasına ulaştığı zamandır. Ardından videoyu tersten takip edin, tek bir kuyuya odaklanın ve sineğin son dinlenme noktasından ilk hareket ettiği zamanı belirtin.
Her sinek son dinlenme süresini belirlemek zor olabilir. Doğru bir analiz sağlamak için, zaman ayırın ve her iyi ayrı ayrı gözlemlemek önemlidir. Bu temsili analizde, Drosophila genetik referans paneli hattından gelen dişiler, DGRP hattı 714'teki dişilere göre anlamlı olarak daha düşük ortalama termal minima sıcaklıklarına sahipti.
Buna ek olarak, ısı 37,5 santigrat derece zaman aşağı devirdi, 73 ve 461 DGRP hatları gelen kadınlar arasında önemli ölçüde farklılık. Küçük değişikliklerle, devrilen ısıyı ölçmek için kullanılan bu yöntem, chill-coma geri kazanım süresi veya kritik termal maksimum gibi diğer termal tolerans özelliklerini ölçmek için kullanılabilir. Araştırmacılar için uygulamalı süreyi önemli ölçüde azaltarak, bu yöntemler genetik varyasyon ve termal tolerans özelliklerinin daha önce mümkün olmayan bir ölçekte araştırılmasına olanak sağlamıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, küçük böceklerde termal toleransı değerlendirerek, kritik termal minimumları ve ısı çökme süresini değerlendirmek için yöntemler sunar. İklim değişiminin hızlı temposu göz önüne alındığında, bu termal sınırları anlamak, türlerin dağılımlarını ve uyum sağlama yeteneklerini tahmin etmek için önemlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Termal tolerans
- İklim değişiminin etkisi
- Böcek fizyolojisi
Arka Plan
- Termal sınırların etkilediği tür dağılımları
- Hızlı değerlendirme protokollerinin önemi
- Küçük böcek modellerine odaklanma
Kullanılan Yöntemler
- Termal minimumlar ve ısı çökme için yüksek verimli testler
- Model organizmalar olarak Drosophila kullanımı
- Minimal ekipman ve maksimum çıktı gerektiren protokoller
Ana Sonuçlar
- Drosophila genetik çizgileri arasında termal minimumlarda önemli farklılıkların belirlenmesi
- Böceklerde ısı çökme süresini ölçmek için verimli yöntemlerin kurulması
- Bu yöntemlerin diğer termal tolerans özelliklerini araştırma potansiyeli
Sonuçlar
- Çalışma, termal toleransı değerlendirmek için etkili metodolojileri gösterir.
- Bu bulguların iklim değişikliği ve biyoçeşitlilik araştırması bağlamındaki alaka düzeyini vurgular.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding thermal tolerance in model organisms supports target validation in environmental stress response pathways and phenotypic screening for climate-resilient traits. High-throughput thermal limit assays enable mechanistic de-risking of genetic variants affecting survival under extreme conditions. These methods provide quantitative, reproducible data for predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic variation in thermal tolerance pathways to clarify functional targets.
- Operational Value: Reduces experimenter bias through automated detection of critical thermal minima and heat knockdown events.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of genetic libraries for stress response modifiers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative thermal tolerance readouts for dose-response or genetic modifier screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats for scalable, semi-automated processing.
- Reproducibility: Standardized temperature ramping and video-based endpoints ensure cross-run consistency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links genetic findings in model organisms to conserved stress response mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causality between genetic variants and thermal tolerance phenotypes.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on environmental resilience data.
Pipeline & Workflow Integration
These assays fit within early discovery to lead identification workflows, providing phenotypic readouts that inform target confidence and pathway validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in thermal stress response and biological de-risking of targets.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized outputs for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Delivers time-to-event and temperature-threshold measurements for quantitative comparison across conditions.
- Translational Research: Connects insect thermal tolerance data to conserved pathways relevant to mammalian stress response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for high-throughput environmental stress phenotyping.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing phenotypic noise and ambiguity.
- Operational Value: Low cost, minimal equipment, and rapid (~2 hour) completion enable high-throughput screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic data on environmental stress resilience.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of targets with validated stress response modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect handling and thermal assay setup.
- Needs temperature-controlled fluid bath, infrared sensors, and video recording equipment.
- Standardization across labs requires consistent temperature ramping rates and well plate orientations.
- Adaptation to other insect species may require perch size and temperature range adjustments.
- Practical limitation: Assay duration limits use for traits requiring longer recovery or acclimation periods.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Critical Thermal Minima (CTmin) Assay Setup
1:29
Critical Thermal Minima (CTmin) Assay
3:46
High-Throughput Heat Knockdown (KD) Assay Setup
4:19
High-Throughput Heat Knockdown (KD) Assay
5:45
Results: Representative Lower and Upper Thermal Limits of Select Lines from theDrosophila Genetic Reference Panel (DGRP)
6:16
Conclusion
