Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Fare tahlillerinden nöronal farklılaşma, nörogenezde yer alan temel mekanizmaları göstermek için mükemmel bir modeldir. Bir şirket toro tarama stratejisi kullanarak embriyoid nörojenez için optimize edilmiş bir yöntem gösteriyoruz. Bu teknik, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve kolay kullanım avantajlarına sahiptir ve laboratuvarlar arasında popülerleştirme için uygundur.

Sinirbilim araştırmaları için güçlü bir araçtır. Birinci protokolü kullanarak farklılaşma yapmak için, iki mililitre bazal farklılaşma ortamında 20.000 fare embriyoid kök hücresini% 0.1 jelatin kaplı altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tohumlayın. Hücre bağlandıktan sonra, hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve her bir oyuğa iki mililitre bazal farklılaşma ortamı ekleyin, ardından hücreleri inkübatöre geri koyun.

Hücrelerin sekiz gün boyunca farklılaşmasına izin verin ve ortamı her iki günde bir değiştirin. İkinci protokolü gerçekleştirmek için, 10 mililitre bazal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan bir bakteri kabına 1,5 milyon fare embriyoid kök hücresi ekleyin ve embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İki gün sonra, hücre agregalarını 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile çökelmelerine izin verin.

Süpernatanı çıkarın ve embriyoid cisimciklerini yeniden askıya almak için 10 mililitre taze bazal farklılaşma ortamı ekleyin. Daha sonra onları yapışkan olmayan yeni bir kaba tekrar yerleştirin ve iki gün daha inkübe edin. Oyuk başına iki mililitre bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 50 embriyoid cismi toplayın ve jelatin kaplı altı oyuklu bir plakaya tohumlayın.

Retinoik asit indüksiyonu için, her bir oyuğa iki mikrolitre RA stoğu ekleyin, bir mikromolar nihai konsantrasyona kadar. Plakayı inkübatöre geri koyun ve hücreleri dört gün daha ayırt edin. Üçüncü protokolü kullanarak farklılaşma yapmak için, ikinci protokolü tekrarlayın, ancak embriyonik vücut oluşumu için sadece iki gün ve RA indüksiyonu için altı gün izin verin.

Embriyoid cisim oluşumunun kalite kontrolü mikroskopi kullanılarak yapılmalıdır. Sadece parlak çekirdeğe sahip olanlar sonraki süreçte başarılı bir şekilde farklılaşabilir. Dördüncü protokol için, 20.000 fare embriyonik kök hücresini jelatin kaplı plakalara tohumlayın ve birinci protokolü izleyin.

Hücrelerin dört gün boyunca farklılaşmasına izin verdikten sonra, her bir oyuğa tüm trans RA stokundan iki mikrolitre ekleyin ve plakayı dört gün daha inkübe edin. Beşinci protokolü gerçekleştirmek için, dördüncü protokolü tekrarlayın, ancak sadece iki günlük farklılaşmadan sonra RA indüksiyonuna başlayın. Altıncı protokol için, 1.5 milyon kök hücreyi 10 mililitre N2B27 ortam ikide yapışkan olmayan bir bakteri kabına yerleştirin ve embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

İki gün sonra, daha önce tarif edildiği gibi hücre agregatlarını toplayın ve embriyoid cisimciklerini 10 mililitre taze N2B27 orta iki ile yeniden süspanse edin. Onları yapışkan olmayan yeni bir bakteri kabına yeniden dikin ve iki gün daha farklılaşmasına izin verin. Dördüncü günde, iki mililitre N2B27 orta iki ile jelatin kaplı altı oyuklu plakalara oyuk başına yaklaşık 50 embriyoid cisim toplayın ve tohumlayın.

Her bir kuyucuğa tüm trans RA stokundan iki mikrolitre ekleyin ve dört gün daha farklılaşmaya neden olun. Yedinci protokolü gerçekleştirmek için, jelatin kaplı plakalar üzerine kuyu başına iki mililitre bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 20.000 hücre tohumlayın. Hücre bağlanması ve PBS ile iki yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa iki mililitre N2B7 ortamı ekleyin ve hücrelerin sekiz gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte farklılaşmasına izin verin.

Üçüncü protokolü kullanarak birinci aşama farklılaşmasını gerçekleştirdikten sonra, yaklaşık 500.000 fare embriyonik kök hücre türevini oyuk başına iki mililitre bazal farklılaşma ortamında %0.1 jelatin kaplı plakalara tohumlayın. Üç fazlı iki farklılaşma protokollerini test etmek için türevleri rastgele üç gruba ayırın. Plakayı altı saat inkübe edin, daha sonra hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve protokole bağlı olarak her bir oyuğa iki mililitre bazal farklılaşma ortamı N2B27 orta veya N2B27 orta iki ekleyin.

Bıçakları inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 10 gün daha farklılaşmasına izin verin ve ilgili ortamı her iki günde bir değiştirin. Genel öncü hücrelerde veya NPC'lerde fare embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması için en uygun protokolü belirlemek için yedi protokol test edildi. Protokoller hem A2lox kilitleri hem de 129 hücre üzerinde test edildi ve her grubun farklılaşma durumu bir ışık mikroskobu kullanılarak izlendi.

Çoğu A2lox ve 129 türevi, NPC'lerin oluşumunu gösteren üçüncü protokol altında iyi yığılmış ve nörit benzeri morfolojiler gösterdi. Bununla birlikte, ikinci protokol kullanılarak farklılaşan hücreler, embriyoid cisimciklerindeki besin eksikliğinden kaynaklanabilecek apoptotik göründü. NPC'lerin oluşumunu daha da doğrulamak için, nestin pozitif hücreler bir immünofloresan testi kullanılarak tespit edildi.

Üçüncü protokol, A2lox ve 129 türevlerinde sırasıyla %78 ve %69'a ulaşan en yüksek nestin pozitif hücre yüzdesi ile sonuçlandı. NPC'lerin nöronlara farklılaşması için üç protokol test edildi. Üçüncü protokolün farklılaşmayı en etkili şekilde indüklediği belirlendi.

İkinci faz protokoldeki çoğu A2lox ve 129 türevi, berrak nöritler ve hücre gövdesi uzantıları olan uzun süreli nöron benzeri yapılara sahipti. İmmünofloresan deneyleri, üçüncü protokol kullanılarak A2lox ve 129 türevlerinde sırasıyla %68 ve %59'a kadar beta tubulin üç pozitif hücre yüzdesi ile nöron oluşumunu daha da doğruladı. Bu prosedürü denerken, farklılaşmadan önce fare tahlillerinin sağlıklı ve farklılaşmamış olduğundan emin olmak önemlidir.

Ek olarak, sondaj gövdelerinde oluşumdan sonra ve ikinci aşama farklılaşmasından önce sıkı kalite kontrolü yapılmalıdır. Bu teknik, nörobiyoloji ve gelişim biyolojisi araştırmacıları için standart bir model sağlar ve nörogenezde yer alan temel mekanizmaları göstermek için güçlü bir araç olması beklenir.