Name: Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSClerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin iPSC'lerin farklı ekstraselüler matris kaplamaları üzerindeki büyüme hızlarını otomatik görüntüleme ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol hücre sayımı yapmadan hızlı analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Fondazione Bambino Gesù ve Ricerca Corrente'den (İtalya Sağlık Bakanlığı) C.C.'ye yapılan hibelerle desteklendi.  Dr. Enrico Bertini'ye (Nörobilim Dalı, Nöromüsküler ve Nörodejeneratif Hastalıklar Birimi, Moleküler Tıp Laboratuvarı, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Dr. Stefania Petrini'ye (Konfokal Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Araştırma Laboratuvarları, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Giulia Pericoli'ye (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) teşekkür ederiz. ve Roberta Ferretti (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) bilimsel tartışmalar ve teknik yardım için. Maria Vinci, "Kanserli Çocuklar İngiltere bursu" sahibidir.

1. 96 kuyu plakalarının kaplanması
NOT: Farklı kaplamalar aynı plakada ancak ayrı kuyucuklarda test edilmiştir ( Ek Dosyaya bakınız).
<ol><li>DMEM'de Matrigel 1:100'ü seyreltin. 96 kuyucuk plakasına kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Bunu takiben, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukları iki kez 100 μL DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>PBS'de laminini (20 μg / mL, LN-521) seyreltin (kalsiyum ve magnezyum ile). Kuyuya 100 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri tohumlamadan önce DMEM ile iki yıkama yapın.</li>
	<li>Vitronektini (10 μg/mL) seyreltme tamponunda seyreltin. 96 kuyucuklu plakaya kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri kaplamadan önce kuyucukları PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.</li>
	<li>HU-Fibronektini (30 μg / mL) ddH2O'da seyreltin Kuyucuklara 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Bunu takiben, hücreleri tohumlamadan önce kuyucukları ortamla yıkayın.</li>
</ol>2. Kültürde iPSC'lerin bakımı
NOT: iPSC'ler ticari olarak satın alınmıştır. iPSC'ler sağlıklı insan fibroblastlarından türetildi ve epizomal teknoloji kullanılarak yeniden programlandı.
<ol><li>-80 °C dondurucudan veya sıvı azottan, kriyokorunmuş iPSC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda çözün. Hücreleri içeren şişeyi biyolojik güvenlik kabinine taşımadan önce% 70 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu, 15 mL'lik steril konik bir tüp içinde 1000 μL'lik bir pipetle 5 mL'lik önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamına (örneğin, mTeSR1) damla damla ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 304 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve hücre peletini 4 mL hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu, fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) daha önce kaplandığı 6 kuyucuklu hücre kültürü kabı başına 10 5 iPSC) iki kuyucuğuna (6 kuyucuklu hücre kültürü kabı başına 105 iPSC) yerleştirin. DMEM'de 2.4 x 104/cm2 yoğunlukta iPSC'lerin kaplanmasından iki gün önce tohum MEF'leri (% 10 Fetal Sığır Serumu,% 1 L-glutamin ve% 1 Penisilin-Streptomisin içerir).</li>
	<li>Tohumlamadan sonra, hücre ortamını 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 ile destekleyin.</li>
	<li>iPSC'leri ilk 4-5 hafta boyunca MEF'lerde ve daha sonra mTeSR1'deki ilgili kaplamalardan birini (bkz. adım 1 ve Tablo 1) kullanarak besleyicisiz durumda (MEF içermeyen koşul) büyütün.</li>
	<li>iPSC'ler% 70-80 birleştiğinde, RT'de 3-5 dakika boyunca 0,5 mM EDTA işlemi kullanarak 1:4 geçiş. 6 kuyucuklu bir plaka için 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin (veya diğer plaka türleri için orantılı miktarlar). Besleyicisiz koşullarda yeni kuyulara aktarın ve 37 °C, %5 CO2, %20 O2'de inkübeedin.</li>
	<li>Medyayı her gün taze mTeSR1 ile değiştirin ve hücreleri her 2 günde bir bölün.</li>
</ol>3. Hücre birleşmesinin karakterizasyonu
<ol><li>Deneyler için 96 kuyu plakası kullanın.</li>
	<li>MEF'lerin geçmediğinden emin olmak için besleyicisiz durumda en az 1 aylık kültürlemenin ardından kuyu başına 10.000 hücre tohumlayın. Optik mikroskopla hücreleri saymak için tek kullanımlık sayma slaytları kullanın.</li>
	<li>Deneyleri üçlü olarak gerçekleştirin. Bu nedenle, her tohumlama durumunu üç kuyucukta test edin.</li>
	<li>Parlak alan modunda bir sitometre kullanarak tohumlamayı takip eden 1. günden itibaren otomatik görüntü alma işlemini gerçekleştirin. 5 gün boyunca her 24 saatte bir otomatik görüntü alma işlemi gerçekleştirin. Deneysel parametreler hakkında ayrıntılı bilgi için, Ek Dosya'ya bakın.</li>
	<li>Hücreleri daha iyi görselleştirmek için otomatik kontrast ve otomatik pozlamayı kullanın.</li>
	<li>Kuyuların sınırındaki ışık kırılması nedeniyle odaktaki değişiklikleri değerlendirmek için kuyu başına %60, %80 ve %100'lük bir maske uygulamak üzere birleşim analizi için analiz ayarını (Ek Dosya'ya bakın) ayarlayın. Her zaman noktasında hücre birleşmesini analiz etmek için yukarıda belirtilen farklı maske analizi ayarını kullanın.</li>
</ol>4. İstatistiksel analizler
<ol><li>Kantitatif sonuçları, ortalamanın standart hatası (SEM) ± ortalamalar olarak raporlayın.</li>
	<li>Farklı kaplama koşullarının genel farklılıklarını karşılaştırmak için, aynı numuneleri kullanarak veri elde edin ve Öğrencinin çift numune t-testini gerçekleştirin. 0.05'ten küçük P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir ve bildirilen tüm p değerleri iki taraflıdır.</li>
</ol>5. Sitoiskelet mikrofilamentlerinin karakterizasyonu
<ol><li>RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit (% 4 PFA) içeren hücreleri sabitleyin, ardından PBS'de iki yıkama (toplam 10 dakika).</li>
	<li>RT'de 1 saat boyunca her bir kuyucuğa 100 μL blokaj çözeltisi (PBS'de %5 BSA, %0,1 Triton'dan oluşur) ekleyin.</li>
	<li>Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve numuneleri PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>Örnek başına 100 μL falloidin-konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>PBS ile hücreleri iki kez yıkayın (RT'de 10 dakika).</li>
	<li>Hoechst 33342'li leke çekirdekleri, RT'de 10 dakika boyunca PBS'de 1:10000 seyreltildi.</li>
	<li>Hoechst çözeltisini çıkarın ve hücreleri her seferinde 10 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>NumuneyiH2O ile yıkayın ve kimyasal bir başlık altında kurumaya bırakın.</li>
	<li>Hücreleri örtmek ve numunelerin floresansını korumak için 100 μL montaj ortamı (yani PBS: gliserol, 1: 1) ekleyin.</li>
	<li>Ex/Em 493/517 nm'deki hücreyi, beyaz ışık lazer (WLL) kaynağı ve 405 nm diyot lazer ile donatılmış lazer taramalı bir konfokal mikroskopta gözlemleyin. HC PLAPO 40x yağa daldırma hedefi kullanarak sıralı konfokal görüntüler elde edin. İncelenen tüm numuneler için aynı lazer gücünü, ışın ayırıcıları, filtre ayarlarını, iğne deliği çaplarını ve tarama modunu kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Hastalık modelleme ve gelecekteki ilaç taraması için iPSC'lerin kullanımı, hassas tıpta olası uygulamaları ile birlikte onu büyük önem taşıyan bir teknoloji haline getirmektedir ve bu nedenle embriyonik kök hücrelerin fizyolojik durumuna daha iyi benzeyen in vitro kültürleme durumunu açıkça anlamanın gerekli olduğuna inanıyoruz. Bu bağlamda, hücrelerin sağlıklı ve farklılaşmamış bir durumda kalmasına izin veren koşulları anlamak için vahşi tip iPSC'ler kullanarak farklı ECM kaplamalarını test ettik. Buna ek olarak, kriti...

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) somatik hücrelerden elde edilir ve farklı hücre tiplerine ayrılabilir. Genellikle hastalık patogenezini modellemek veya ilaç taraması yapmak için bir sistem olarak kullanılırlar ve ayrıca kişiselleştirilmiş tıp bağlamında kullanılma potansiyeli sunarlar. iPSC'ler büyük bir potansiyele sahip olduklarından, güvenilir bir model sistemi olarak kullanılmak üzere onları tam olarak karakterize etmek önemlidir. Daha önce hipoksik bir ortamda iPSC'lerin yetiştirilmesinin önemini göstermiştik, çünkü bu hücreler glikolize dayanır ve aerobik bir ortam redoks dengesizliğine neden olabilir1. iPSC'ler ayrıca diğer kültür koşullarına, özellikle de hücre dışı ortama karşı savunmasızdır. Kültür koşullarının optimizasyonu, onları sağlıklı ve çoğalır tutmak için kilit bir konudur. Sağlıklı bir iPSC kültürü, genellikle belirli insan bozukluklarının veya hücresel süreçlerin moleküler, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini anlamak için kullanılan modelin son noktası olan sağlıklı farklılaşmış hücrelere yol açacaktır.
Bu çalışmada, ayrı kuyucuklarda farklı kaplama koşulları kullanarak iPSC'lerin birleşmesini test etmek için basit bir protokol kullanılmıştır. iPSC'ler, düzgün bir şekilde bağlanması için bir murin embriyonik fibroblast (MEF) besleyici tabakasına ihtiyaç duyar, ancak iPSC'lerin ve MEF'in bir arada bulunması, iki hücre popülasyonu bulunduğundan RNA veya protein ekstraksiyonu gibi analizlerin yapılmasını zorlaştırır. Besleyici tabakadan kaçınmak için, doğal hücre nişini yeniden oluşturmak ve besleyicisiz iPSC kültürüne sahip olmak için hücre dışı matrise (ECM) ait farklı proteinler kullanılmıştır. Özellikle, Matrigel, hücre dışı matriks proteinleri (yani laminin, kollajen IV, heparan sülfat proteoglikanlar, entactin / nidogen ve büyüme faktörleri) ile zenginleştirilmiş Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan ekstrakte edilen çözünür bir bazal membran preparatıdır 2,3. Kullanılan diğer kaplama koşulları, ECM'lerin yapımında bilinen alakası olan saflaştırılmış proteinlerdir: laminin-521'in, embriyonun iç hücre kütlesindeki insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) tarafından salgılandığı bilinmektedir ve doğumdan sonra vücuttaki en yaygın lamininlerden biridir 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin, hPSC 12,13,14,15,16'nın büyümesini ve farklılaşmasını desteklediği bilinen kseno içermeyen bir hücre kültürü matrisidir; fibronektin, omurgalı gelişimi ve embriyonik kök hücrelerin pluripotent bir durumda bağlanması ve bakımı için önemli bir ECM proteinidir 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Farklı kaplama koşulları mevcut olduğundan, bunları iPSC'lerin birleşmesi üzerindeki etkileri açısından karşılaştırıyoruz.

<table><tbody><tr><td>10 mL Stripette Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Kağıt/Plastik Ambalajlı, Steril</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>Alet</td></tr><tr><td>15 mL yüksek berraklıkta polipropilen (PP) konik santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Aleti</td></tr><tr><td>1x PBS (Ca2+ ile; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Orta</td></tr><tr><td>1x PBS (Ca2+ olmadan; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td>Orta</td></tr><tr><td>5 mL Stripet Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Kağıt/Plastik Ambalajlı, Steril</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>Takım</td></tr><tr><td>Hücresi kültürü mikroplakası, 96 KUYU, PS, F-Alt</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Destek</td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakası, 6 kuyulu</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Desteği</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozu)</td> <td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Orta</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Epi Epizomal iPSC Yeniden Programlama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>HIZLI - OKUYUN 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Aracı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Orta</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>Kaplama</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>77003</td><td>Kaplama</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>LS25030081</td><td>Reaktifi</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel hESC Nitelikli Matriks</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Kaplama Fare embriyonik fibroblastları (MEF)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A24903</td><td>Kaplama</td></tr><tr><td>MTESR1 Orta</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85851</td><td>Orta</td></tr><tr><td>MTESR1 Takviyesi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85852</td><td>Orta</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Reaktifi</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Vitronektin</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7180</td><td>Kaplama</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Reaktifi</td></tr></tbody></table>

otomatik görüntüleme sistemi kullanarak ipsc'lerin birleşme noktasının Ölçülmesi.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Bu çalışma, farklı ECM kaplama substratları üzerinde büyüyen iPSC'lerin hücre birleşmesini nasıl etkileyebileceğini anlamaya odaklanmaktadır. Herhangi bir büyüme bozulmasını önlemek için tek hücre süspansiyonundaki hücreleri saymaya gerek kalmadan iPSC birleşmesini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Zaman içinde 4 farklı ECM'de iPCS birleşimini otomatik bir şekilde değerlendirmek için yüksek içerikli bir görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Yapışkan iPSC'lerin hücre birleşimini değerlendirmek için farklı analiz ayarları kullanılmış ve %60, 80 veya 100 maske uygulanıp uygulanmadığına dair sadece küçük bir fark (laminin ile 24 ve 48 saatte) gözlenmiştir. Ayrıca lamininin Matrigel, vitronektin ve fibronektin ile karşılaştırıldığında en iyi birleşmeye yol açtığını gösteriyoruz.

Bu çalışmada, iPSC'lerin farklı kaplama koşullarında yetiştirildiğinde birleşimini araştırdık. Bir sitometre kullanarak, 5 gün içinde üçlü olarak kolayca bilgilendirici sonuçlar elde edebildik. iPSC'ler plastik kaplara neredeyse hiç yapışmadığından ve çoğalmalarını desteklemek için bir kaplama gerektiğinden, hücre kültürünün sağlığının bir göstergesi olduğu ve farklılaşma potansiyellerini yansıtabileceği için insan iPSC'lerinin birleşmesini izlemeye karar verdik. İn vitro genişlemeden sonra, iPSC'leri farklı ECM substrat...

Protokolün amacı, diferansiyel kaplamanın indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) büyüme hızını nasıl etkilediğini değerlendirmek için farklı hücre dışı matris (ECM) kaplama koşullarını karşılaştırmaktır. Özellikle, iPSC kültürlerinin optimum büyümesini sağlamak için koşullar oluşturmayı amaçlıyoruz.

Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Bu protokol önemlidir, çünkü farklı hücre dışı matris kaplama substratları üzerinde indüklenmiş pluripotent kök hücre birleşmesinin gerçek zamanlı olarak hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir. Bu protokolün ana avantajı, tek hücreli süspansiyon sayımını gerektirmemesi ve böylece paslaşmaya duyarlı olan iPSC'lerde büyüme bozulmasını önlemesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Valentina Magliocca olacak.Bazal membran matrisi kaplı plakaları ayarlamak için, bazal membran matrisini seyreltin, DMEM'de 1 ila 100 oranı ayarlayın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna elde edilen çözeltiden 100 mikrolitre ekleyin. Tüm kuyucuklar kodlandığında, plakayı bir saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, bazal membran matris çözeltisini atın ve her bir kuyucuğu kuyu başına 100 mikrolitre taze DMEM ile iki kez yıkayın.Laminin kaplı plakaları ayarlamak için, PBS'de mililitre başına 20 mikrogram laminini kalsiyum ve magnezyum ile seyreltin ve yeni bir 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre laminin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, gösterildiği gibi kuyucukları iki kez taze DMEM ile yıkamadan önce plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Vitronektin kaplı plakaları kurmak için, seyreltme tamponunda mililitre Vitronektin başına 10 mikrogram seyreltin ve yeni bir 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre tampon ekleyin.Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyondan sonra, kuyucukları kuyucuk başına kalsiyum ve magnezyum içermeyen 100 mikrolitre PBS ile yıkayın. İnsan fibronektin kaplı plakaları hazırlamak için, çift damıtılmış suda mililitre fibronektin başına 30 mikrogram seyreltin ve yeni bir 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre fibronektin çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, kuyucukları gösterildiği gibi taze DMEM ile yıkayın.Bir iPSC kültürü kurmadan iki gün önce, fare embriyonik fibroblastlarını tam hücre kültürü ortamında santimetre kare başına 2.4 x 10 ila dördüncü yoğunlukta tohumlayın, altı oyuklu hücre kültürü plakalarının iki oyuğunun her birine yerleştirin ve plakaları hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir iPSC kültürü kurmak için, 37 santigrat derece su banyosunda kriyoprezervasyonlu iPSC'lerden oluşan bir stok çözeltisini ısıtın. Hücreler yeni çözüldüğünde, şişeyi% 70 etanol ile temizleyin ve hücreleri biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin.1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, hücreleri damla damla beş mililitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı içeren steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti dört mililitre taze hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra 1'e 10 ila beşinci hücrelere plaka fare embriyonik fibroblast tohumlu altı oyuklu plakaların her birine yerleştirin.Tohumlamadan sonra, hücre kültürlerini 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632 ile destekleyin ve plakaları dört ila beş hafta boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreler% 70 ila 80 birleşmeye ulaştığında, her kültüre oda sıcaklığında üç ila beş dakika boyunca bir mililitre 0.5 milimolar EDTA uygulayın. Hücreler ayrıldığında, hücreleri taze hücre kültürü ortamında bir ila dört oranında bölün ve hücreleri, besleyici içermeyen koşullar altında altı oyuklu plakanın kalan dört oyuğunun her birine yerleştirin.Ardından plakaları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Besleyici içermeyen koşullar altında en az bir aylık kültürden sonra farklı kaplamaların hücre birleşmesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, bir sayma odası kullanarak her kültürden hücreleri saymak için tek kullanımlık sayma slaytları kullanın. Hücreleri, 200 mikrolitre orta konsantrasyon başına 10 ila dördüncü hücreye kadar seyreltin ve hücreleri, koşul başına bir örtü kaplı 96 oyuklu plakanın üç oyuğunun her birine üç nüsha halinde tohumlayın.Tüm hücreler kaplandıktan sonra, plakaları 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün ve sonraki beş gün boyunca her gün, optimum görselleştirme için otomatik kontrast ve otomatik pozlama ayarlarını kullanarak hücrelerin otomatik görüntülemesini gerçekleştirin. Kuyucukların sınırındaki ışık kırılması nedeniyle odaktaki değişiklikleri değerlendirmek için, kuyu başına %60, 80 veya 100'lük bir maske uygulamak için analiz ayarlarını birleşme analizine ayarlayın ve her zaman noktasında hücre birleşmesini analiz etmek için farklı maske analizi ayarlarını kullanın.Farklı kodlama koşullarının genel farklılıklarını karşılaştırmak için, öğrencinin eşleştirilmiş örneklem T-testini gerçekleştirmek için örnek verileri kullanın ve nicel sonuçları, ortalamanın standart hatası artı veya eksi olarak birleşmedeki ortalama değişiklikler olarak rapor edin. Hücre iskeleti mikrofilamentlerinin karakterizasyonu için, önce hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca oyuk başına PBS'de 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, ardından yıkama başına 200 mikrolitre PBS'de 10 dakikalık iki yıkama yapın. Önceden yerleştirilmiş lameti plakadan mikroskop lamına aktarın.Spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı engellemek için oda sıcaklığında bir saat boyunca her bir oyuğa 100 mikrolitre% 5 sığır serumu ve% 0.1 Triton ekleyin ve numuneleri gösterildiği gibi iki adet 10 dakikalık PBS yıkaması ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için numune başına 100 mikrolitre Phalloidin konjuge çalışma solüsyonu ekleyin, ardından PBS'de 10 dakikalık iki yıkama yapın. Daha sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de bir ila 10.000 konsantrasyona seyreltilmiş Hoechst 33342 ile boyayın ve ardından iki PBS yıkaması yapın.İkinci yıkamadan sonra, hücreleri suyla durulayın ve plakaları kimyasal bir kaputun altında kurumaya bırakın. Cam lamel kuruduğunda, hücreleri oyuk başına 100 mikrolitre uygun bir montaj ortamı ile örtün ve hücreleri, uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında beyaz ışık lazer kaynağı ve 405 nanometre diyot lazer ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskopta bulun. Ardından 63x yağa daldırma hedefini seçin ve hücrelerin sıralı konfokal görüntülerini elde edin.Phalloidin boyama, bir kabın yüzeyine hücre yapışma derecesinin ve özellikle damar için kullanılan kaplamanın görselleştirilmesine izin verir. Bir kaplamaya yapışan hücreler, çökmüş mikrofilamentler yerine açıkça görülebilen hücre iskeleti mikrofilamentleri gösterir. Parlak alan görüntüleme, iPSC'lerin kaplanmış yüzeylere yapışma seviyesinin görüntülenmesine de olanak tanır.Laminin üzerine ekilen iPSC'ler, diğer kaplamalara kıyasla zaman içinde doğrusal bir şekilde yüksek oranda hücre proliferasyonu gösterir. Buna karşılık, bazal membran matriksi, Vitronektin ve insan fibronektini üzerine ekilen hücreler, kullanılan maskeden bağımsız olarak son 24 saat içinde birleşme eğrisinde artan bir eğim ile ilk 96 saatte doğrusal bir proliferasyon oranı sergiler. Farklı kaplamalar için 24 saatlik ilk fark, hücre bağlanmasındaki farklılıklardan kaynaklanabileceğinden, hücre büyümesi daha sonraki zaman noktaları için 24 saatlik verilere normalleştirilebilir.Gözlemlendiği gibi, farklı kaplamalar arasında birleşme açısından herhangi bir fark yoktur, bu da laminin kaplı kültürlerde gözlenen farklılıkların büyük olasılıkla iPSC'lerin geçtiğinde bu kaplamaya yapışma kabiliyetinin artmasından kaynaklandığını düşündürmektedir. Bu çalışma, iPSC'lerin kültürlenmesi için standartlaştırılmış metodolojilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir ve kliniklerde gelecekteki olası kullanımlarına yardımcı olabilir. Şu anda, hücre-ECM temaslarına aracılık eden ve kendini yenileme yeteneklerinin korunmasından sorumlu olabilecek ana hücre yüzeyi reseptörlerinin biyolojisini araştırıyoruz.

measuring-the-confluence-of-ipscs-using-an-automated-imaging-system

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Biz indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) için ayrı bir damlacık örnek giriş sistemi sunuyoruz. Bu 90 ila 7000 Hz arası frekanslarda 40-60 um boyut aralığında yüksek tek dağılımlı damlacıklarını üreten ucuz ve tek kullanımlık mikroakışkan çip dayanmaktadır.

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Bu çalışmada, SMPS ve ICPMS sistemlerinin bağlantısının kurulması için farklı adımları anlatan ve bunları nasıl kullanacağınızı anlatan pratik bir rehber sunulmaktadır. Üç açıklayıcı örnek sunulmuştur.

Tarama Hareketlilik Cetvelini ve İndüktif olarak Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresini (SMPS-ICPMS) birleştiren Pratik Bir Kılavuz

Hedef reseptörleri hücre yüzeyinde bağlanan antikorlar uyum ve küme değişikliklerini görüşmek. Bu dinamik değişiklikler ilaç geliştirme hedef hücrelerdeki karakterize konusunda da etkileri vardır. Bu iletişim kuralı confocal mikroskobu ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile hücre yüzeyinde kümeleme reseptör kapsamını ölçmek için ImageJ/FIJI kullanır.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

Mikropatterned diziler kullanılarak tek hücrelerden floresan muhabir zaman kurslarının alınması için bir yöntem sunuyoruz. Protokolde, tek hücreli dizilerin hazırlanması, canlı hücre tarama zaman atlamalı mikroskopinin kurulumu ve çalışması ve otomatik önseçim, görsel kontrol ve yapıştırma alanı başına hücre entegre floresan zaman kurslarının izlenmesi için açık kaynaklı bir görüntü analiz aracı açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

Öğrenin iPSC'lerin farklı ekstraselüler matris kaplamaları üzerindeki büyüme hızlarını otomatik görüntüleme ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol hücre sayımı yapmadan hızlı analiz sağlar.

Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.

Daha fazla video keşfet