Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Tekstilde mevcut protokol değerlendiriciler, hücre içi kompartmana özgü bir şekilde redoks durumu değişir. Protokolümüz oksidatif stresin tüm fizyolojik veya patofizyolojik mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve izlenmesini sağlar. Bu teknik, sinyal ifade düzeyleri, fotoğraf ağartma ve algılama hassasiyetleri arasındaki farkları dengelemek için bir oran metrik çıktı kullanarak bozulmamış hücrelerde kiremit göz sülfür oranının kesintisiz nicelik sağlar.

Bu protokol bitkilerdeki bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli organizmalara uygulanabilir. Deneyin ilk gününde iki dakika boyunca bir kabarık meme kanseri hücre hattından hücreleri tedavi, edta% 5, 0.2 iki mililitre ile. Hücreler parçalanmaya başladığında reaksiyonu altı mililitre tam orta ile tutuklar ve hücreleri santrifüj le tortular.

Taze, tam orta beş mililitre pelet askıya Re, hücreleri saymak ve 1.5 kez 10 tam orta bir mililitre başına beşinci hücrelere seyreltmek. Sonra tohum 1.5 kez 10 iyi bir 6 kuyu plaka başına hücrelerin mililitre başına beşinci hücrelere, ve hücre kültürü kuluçka hücre hücreleri bir gecede kuluçka. Veya hiçbir viral satır GFP transdüksiyon ekleyin.

Ertesi sabah, 12.5, 25 ve 50 mikrolitre bir ila 100 seyreltilmiş altı kez 10 mililitre başına 10 plak şekillendirme birimleri eklemek hiçbir viral aşındırılmış GFP çözeltisi eklemek, tam ortamda ekleyin. Uygun kuyular veya 6 kuyu plaka sırasıyla 50, 100 ve 200 enfeksiyon çarpAr hücreleri ile aktamak için ekleyin. Tüm örnek Wells virüs ile transe kten sonra, 16 ila 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için hücreleri iade edin.

Ertesi gün, floresan mikroskobu ile hücreleri görselleştirmek ve orta ile supernatant yerine, virüs olmadan hücrelerin ek bir 24 saat kurtarmak için izin vermek. Optimal transdüksiyon verimliliğini belirlemek için, akış sitometrisi ile hücrelerin floresan yoğunluğunu ve morfolojisini değerlendirin. Biyogüvenlik seviyesi iki sertifikalı biyolojik güvenlik kabini içinde aerosoller veya sıçramalardan enfeksiyona neden olabilecek tüm prosedürleri uyguladığınızdan emin olun.

Hücrelerin redoks durumunu değerlendirmek için, ertesi sabah, hücreleri ve 10 mikromolar hidrojen peroksit ile 6 kuyu plaka uygun Wells kuluçka, edta başına 0.2% 5 damla 750 mikrolitre ile hücreleri ayırmadan önce, iyi gösterdi. Kuyu başına tam orta iki mililitre ile reaksiyonu durdurun ve ayrı 15 mililitre konik tüpler her durum için supernatants çekin. Hücreleri santrifüj ile çökün ve peletleri 500 mikrolitre PBS'de iki kez santrifüjlerle yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, hücre süspansiyonlarını 40 mikro metre kafesten, ışıktan korunan buz üzerinde akış sitometriuyumlu tüplere filtreleyin. Akış sitometre yazılımında, enfeksiyon kontrol örneğinin sıfır çokluğunu çalıştırın. Sonra hidrojen peroksit ve tedavi edilmemiş hücreleri analiz edin.

Bu belirtilen formülü kullanarak, satır GFP azaltılmış formları arasında ortalama floresan yoğunluk oranı nın hesaplanmasına olanak sağlayacaktır. Burada akış sitometri tarafından hücrelerin çok sayıda seçmek için gating stratejisi gösterilir. Akış sitometrisi, sıra GFP analizi için doz yanıt eğrisini ve enfeksiyon girişinin en verimli çokluğunu belirlemek için de kullanılabilir.

Enfeksiyonun çokluğuna göre, bu temsili analizde doz yanıt eğrisi, enfeksiyonun 200 çokluk en yüksek yol GFP ekspresyonu verdi, ancak hücre morfolojisi sitotoksisite düşündüren etkili oldu. Bu nedenle optimum transdüksiyon verimi 100 enfeksiyon çokluğu olarak belirlenmiştir. Bu redoks durum analizinde, araç için akış sitometri analizi ve dört adet 10 mikromolar pozitif kontrol hidrojen peroksit tedavisi ile okside ve azaltılmış sıra GFP ortalama floresan yoğunlukları elde edilmiştir.

Overlaid histogramlar 10 mikromolar hidrojen peroksit ve araç tedavi grupları veya azaltılmış ve oksitlenmiş erode GFP hücre numarasındaki kaymaları temsil eder. Bu analiz için oksitlenmiş ve azaltılmış sıra GFP arasındaki oranın hesaplanmasında 10 mikromolar hidrojen peroksitin araç tedavisine göre sıra GFP'nin oksidasyonunda üç kat artışa neden olduğu ortaya konmıştır. Doğru hücre numaralarına sahip olmak MRI hesaplamaları ve tekrarlanabilirlik için önemlidir.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, araştırmacılar iyice homojen süspansiyonlar elde etmek için antiviral çözeltileri karıştırmak gerekir. Bu protokol, araştırmacıların hızlı redoks değişimlerini normal hücresel süreçlerin ve hastalığın gerçek zamanlı ilerlemesinin ayrılmaz bir parçası olarak incelemelerine olanak tanır.