Name: Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Öğrenin yağ hücrelerinden tek çekirdek izolasyonu yöntemini, yüksek kaliteli tek hücreli transkriptom profilleme için. Bu protokol, çekirdek agregalarını ve hücresel kalıntıları en aza indirerek sağlam bir analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Albert Einstein Genomik çekirdeğinden David Reynolds'a ve Flow Sitometri Çekirdeği'nden Jinghang Zhang'a teknik destek için teşekkür ederiz. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (DK110426) ve Einstein-Mount Sinai Diyabet Araştırma Merkezi (DK020541) ve New York Obezite Araştırma Merkezi'nden (DK026687) (hepsi K.S.'e) pilot ve fizibilite hibelerinden destek kabul ediyoruz. Biz de albert Einstein Kanser Merkezi (CA013330) çekirdek desteği için teşekkür etmek istiyorum.

Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre hayvan bakımı ve deneyleri gerçekleştirildi.
1. Doku sindirim ve lysis tamponlarının hazırlanması
<ol><li>Doku sindirim tamponu hazırlayın.<ol>
<li>Yağ dokusunun her gramı için ~1 mL sindirim tamponu hazırlayın.</li>
		<li>Tartmak 1.5 U / mL kollajenaz D ve 2.4 U / mL dispase II ve fosfat tamponlu salin ekleyin (PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdek hazırlama tamponu (NPB) hazırlayın.<ol>
<li>10 mM HEPES, 1,5 mM magnezyum klorür, 10 mM potasyum klorür, 250 mM sakaroz ve %0,1 NP-40 çekirdeksiz suda hazırlayın. İyi bir şekilde karıştırın. Sakarozun çözülmesi diğer bileşenlerden daha fazla zaman alabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%0.5 büyükbaş serum albumin (BSA) çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>EDTA içeren PBS'de %0,5 BSA hazırlayın. Steril filtrelenmiş hücre kültürü sınıfı PBS kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Yağ dokusunun enzimatik sindirimi
<ol><li>Aune ve ark.13'egöre yağ dokusu çıkarmak için fareleri inceleyin. PBS içeren bir çanak izole doku toplamak. Kuruması için dokuyu kağıt havluya aktarın. Sonra temiz bir tabak içinde doku yerleştirin.</li>
	<li>10 mM'lik son konsantrasyona sindirim tamponuna kalsiyum klorür ekleyin. Çanak sindirim tampon küçük bir hacim ekleyin ve iyice yağ dokusu kıyma. Gerekli sindirim tampon hacmi izole doku miktarına göre olacaktır. Genellikle ~1 mL veya daha az kullanılır.</li>
	<li>Kıymalı dokuya hazırlanan sindirim tamponu miktarının yaklaşık yarısını (örneğin, beş fare için ~10 mL) ekleyin. Serolojik pipet kullanarak, numuneyi 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Yemeği yıkamak için kalan tampon miktarını ekleyin ve numuneyi içeren 50 mL'lik tüpe aktarın. Pipet birkaç kez yukarı ve aşağı. Daha sonra 12-15 dakika boyunca 37 °C'de 200-210 rpm sallayarak inkübte.</li>
</ol>3. Adiposit izolasyonu
<ol><li>Kuluçkadan sonra numuneye 1:1 oranında %0,5 BSA ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Stromal vasküler fraksiyonu (SVF) aşağı spin oda sıcaklığında (RT) 5 dakika için 300 x g örnek santrifüj. Adiposit fraksiyonu örneğin üst katmanında kalır.</li>
	<li>50 mL'lik konik santrifüj tüpünün üzerine 40 m'lik bir hücre filtresi yerleştirin ve üst katmanı toplayarak ve tüpün altındaki SVF'yi geride bırakarak numuneyi filtreleyin. Filtreyi tüpün üzerine ters çevirerek ve filtreyi ters yıkamak ve numuneyi tüpte toplamak için %0,5 BSA kullanarak üst katmanı (adiposit fraksiyonu) yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Numune boyutuna ve pipete göre %0,5 BSA'lık toplam hacmi serolojik pipetle yukarı ve aşağı doğru 10-15 mL'ye getirin veya numuneyi karıştırmak için kısa bir süre çalkalayın. Numuneyi rt'de 5 dk için 300 x g'da tekrar santrifüj edin.</li>
</ol>4. Çekirdek izolasyonu
<ol><li>Geniş delikli bir pipet ucu kullanın ve numunenin üst tabakasını buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş tüpün üzerine yerleştirilen 100 μm hücreli filtreye dikkatlice aktarın ve geriye kalan SVF'yi geride bırak.</li>
	<li>Filtreyi yeterli miktarda NPB ile durula/yıkayın ve filtreyi atın. Bu adımdan itibaren mümkün olduğunca sık buz üzerinde örnek var ve sızıntılı ve / veya sağlıksız çekirdekleri önlemek için hızlı bir şekilde çalışır. Bu buz üzerinde gelecekteki adımlarda kullanılmak üzere prechill mikrosantrifüj tüpler için yararlıdır.</li>
	<li>Karıştırmak için tüp aralıklı nazik ters ile en fazla 2 dakika buz üzerinde örnek yerleştirin. Buzdaki kuluçka süresi örnek boyutu ve adiposit tipi için optimize edilmelidir. 10 dk için 4 °C'de 1.000 x g santrifüj.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve NPB 1 mL pelet resuspend. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarırken, enkaz ve lipid içeren tüp, duvarlara dokunmaktan kaçının. Numuneye 0,6 U/μL RNase inhibitörü ekleyin ve karıştırın. 10 dk için 4 °C'de 1.000 x g tekrar santrifüj. NOT: Daha küçük numuneler için bu adımda santrifüj hızı ve zamanı azaltılmalıdır.</li>
	<li>1 mL'lik Nüklei Yıkama Tamponu'nda süpernatantı çıkarın ve yeniden askıya alın (%2 BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibitörü).</li>
	<li>Istiflenebilir 30 μm filtreleri ile temiz bir tüp içine çift filtre. Küçük hacimli (~300 μL) Çekirdek yıkama Tamponu ile filtreyi yıkayın. Alternatif olarak, daha küçük numuneler için mikrosantrifüj tüpüne sığan 30 μm'lik bir filtre kullanın ve doğrudan filtre uygulayın.</li>
	<li>Sağlıklı çekirdeklerin başarılı bir şekilde izole edilebiyi onaylayın.<ol>
<li>Deneyin küçük bir aliquot trypan ile leke ve ortalama ölü boyutu ve yüzde ölü hücreleri değerlendirmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Çoğunlukla çekirdek içeren bir numunenin ortalama ölü boyutu 7-10 μm arasında olmalıdır.</li>
		<li>Dapi ile numunenin küçük bir aliquot leke ve 20x hedefi veya daha yüksek bir mikroskop altında inceleyin. Nükleer zar sağlam olmalı ve çekirdekler yuvarlak olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACS temizleme ve çekirdek konsantrasyonu adımı
<ol><li>Çekirdekleri temizlemek ve herhangi bir fazla enkaz kaldırmak için FACS adım hemen devam edin. Toplama tamponu Nuclei Wash Tampon içermelidir. FACS sırasında arabellek seyreltilir. Sıralama sırasında seyreltme için daha yüksek bir BSA ve RNase inhibitörü konsantrasyonu hazırlanması yararlıdır. FACS toplama bloğu soğutma modunda olmalıdır.</li>
	<li>Çekirdekleri sıraladıktan sonra, numuneyi yoğunatmak için 5 00x g'de 5 dk 4 °C'de santrifüj. 500-1.500 çekirdek/μL konsantrasyonu elde etmek için uygun bir hacimde Çekirdek Yıkama Tamponu yeniden oluşturun. Tüm supernatant kaldırmaya çalışmayın. Bunu yapmak çekirdek kaybına neden olur.</li>
	<li>Son sayım için hemositometre ve DAPI lekeli aliquot kullanın ve çekirdekleri görselleştirin. Daha sonra üreticinin protokolüne göre hemen snRNA-seq ile devam edin.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Tek çekirdekleri izole etmek ve yağ dokusu heterojenliğini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sunulmuştur. Tüm doku RNA dizile karşılaştırıldığında, bu iş akışı hücresel heterojenite ve popülasyona özgü belirteçlerin tarafsız bir görünümünü sunar. Bu önemli ve adiposit biyoloji, moleküler metabolizma ve obezite araştırma gelişimi için yenilikçi.
Bu protokol özellikle snRNA-seq downstream uygulaması için optimize edin. MoFlo XDP Yüksek Hızlı Sorter ile sağlıklı çekirdeklerin izolasyoneld...

Çalışmalar kahverengi yağ dokusu (BAT) enerji dağıtmak için dikkate değer bir kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir. Farklı gelişimsel özelliklere sahip iki tip termojenik adiposit ler hem kemirgenlerde hem de insanlarda bulunur: bej adipositler ve klasik kahverengi adipositler. Klasik kahverengi adipositler çoğunlukla interscapular BAT depolarında bulunurken, bej adipositler kronik soğuk maruziyet, "esmerleme" veya "beiging" olarak adlandırılan bazı fizyolojik ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda (WAT) düzensiz olarak ortaya çıkarlar. Gelişmiş görüntüleme kullanımı sayesinde, yetişkin insanların ucp1 önemli depolar olduğu açıktır+ BAT, özellikle supraclavicular bölgede1,2,3,4. Yetişkin insan BAT miktarı ters yağ oranı ile ilişkilidir ve kronik soğuk maruziyet5,,6 veya β3-adrenerjik reseptör agonist7gibi dış ipuçları ile artabilir. BAT aracılı enerji harcamaları obezite ile mücadele için uygun bir yaklaşım sunabilir.
Yakın zamana kadar, termojenik adipositler homojen bir popülasyon olarak kabul edilmiştir. Ancak, çalışmalar gelişimsel kökenli farklı birden fazla alt tip veya alt popülasyonların varlığını ortaya koymuştur, substrat kullanımı, ve transkripsiyon8,9,10. Örneğin, tercihen termogenez için glikoz kullanan bej adiposit bir tür, g-bej adiposit, son zamanlarda tarif edildi10. Kahverengi ve bej yağ dokusundaki hücre tiplerinin eksik anlaşılması ve spesifik belirteçlerin olmaması biyolojik işlevlerinin incelenmesi için kritik bir engel oluşturmaktadır.
Hücrelerin alt popülasyonlarını yalıtma amaçlı geleneksel yöntemler, bilinen sadece birkaç marker geninin ekspresyonuna dayanır. Tek hücreli genomikteki son gelişmeler, tek hücreli küresel gen ekspresyonu verilerinin kullanılmasını sağlayarak bir dokudaki alt popülasyon sayısının tarafsız bir tahminini sağlar. Bu protokolün nihai amacı, tek hücreli çözünürlükte çeşitli termojenik uyaranlar altında tüm yağ dokusu alt tiplerini belirlemektir. Diğer doku ve hücre tiplerinin aksine, yağ dokusunun hücresel alt tiplerini belirlemek lipid dolu adipositlerin kırılganlığı nedeniyle zordur. Bu kağıt, tek çekirdekleri yağ dokusundan aşağı akım uygulamasına ve snRNA dizilimine izole etmek için sağlam bir protokol sunar. Daha da önemlisi, iyi eşleşen tek çekirdekli RNA sıralama (snRNA-seq) ve tek hücreli RNA sıralama (scRNA-seq) veri setleri karşılaştıran son literatür snRNA-seq hücre tipi algılama scRNA-seq karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koymuştur, ve beyin gibi karmaşık bir doku için hücresel kapsama üstün11. Bu protokol, Rosen ve ark.12 tarafından yağ dokuları için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüj yöntemini Bir MoFlo XDP Yüksek Hızlı Sorter ile bir çekirdek "temizleme" adımı ile birleştirir. Temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, fare interscapular kahverengi yağ dokusundan 7.500 tek çekirdek analizi görünüşte homojen kahverengi adipositler içinde birden fazla hücre tipi tespit. Genel olarak, bu basit ve sağlam protokol, adipositlerin ve yağ-yerleşik hücrelerin doku düzeyinde organizasyonu, alt tipe özgü marker genlerinin tanımlanması ve yağ seçici nakavt/transgenik farelerin gelişim fenomeniinin incelenmesi için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Durulama Solüsyonu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>EDTA'lı PBS; steril filtreli</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Hücre filtresi 100 & mu; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Hücre filtresi 40 & mu; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td> <td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS Akıllı Süzgeçler (30 & mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>İstiflenebilir filtreler</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Hücre Sıralayıcı</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Koruyucu RNaz İnhibitörü</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücreli genomik uygulamalar için yağ dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Kahverengi ve bej yağ UCP1 (Uncoupling Protein-1) bağımlı ve bağımsız yollar tarafından termogenez için enerji dağıtmak özel yağ dokuları vardır. Yakın zamana kadar, termojenik adipositler homojen bir popülasyon olarak kabul edildi. Ancak, son çalışmalar, gelişimsel köken, substrat kullanımı ve transkripsiyon olarak farklı birden fazla alt tip veya alt popülasyon olduğunu göstermiştir. Tek hücreli genomik gelişmelere rağmen, yağ dokularının hücre alt tiplerine tarafsız ayrışması lipid dolu adipositlerin kırılgan doğası nedeniyle zor olmuştur. Sunulan protokol, rna dizilimi de dahil olmak üzere, aşağı akım uygulamaları için yağ dokusundan tek çekirdeklerin etkili bir şekilde izole edilerek bu engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Hücresel heterojenlik daha sonra RNA dizilimi ve biyoinformatik analizler ile analiz edilebilir.

Sıralanmamış adiposit çekirdekleri, tek hücreli RNA sıralamasında gürültü ve yüksek arka plan oluşturan enkaz ve doublets içerir. Temsili FACS kapı stratejisi Şekil 1'degösterilmiştir. Çekirdekler ilk olarak ileri dağılım (FSC) ve yan dağılıma(SSC) (A)göre seçilmiştir, daha sonra, ssc(B)genişliği ve yüksekliklerinin birleşimine göre sadece singlet'ler seçilmiştir. Son olarak, yalnızca DAPI pozitif olaylar seçildi ve toplama a...

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Adiposit kırılgan doğası nedeniyle alt tiplere yağ dokusunun ayrışması zor olmuştur. Bu protokol, tek çekirdeklerin etkin bir şekilde izole edilmesiyle bunun üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Bu iş akışı, en aza indirgenen nükleer agregalar ve hücresel enkaz ile yüksek oranda saflaştırılmış tek çekirdek sağlar.Bu, binlerce hücrenin tek hücreli transkripsiyon profilini çıkarmada avantajlıdır. Bu basit ve sağlam protokol, yağ daki yerleşik hücrelerde adipositin doku düzeyinde ki organizasyonunu incelemek için uygulanabilir. Ve özellikle, geliştirme fenotipleme için, nakavt ve transgenik fareler yağ.Bu protokolün görsel gösterimi, adiposit kullanımında fazla deneyimi olmayan kişilerin yağ heterojenliğini çoğaltabilmesi ve anlayabilmesi için önemlidir. Farelerden yağ dokusu topladıktan sonra, bir kağıt havlu ile kuru pat, ve temiz bir tabak yerleştirin. 10 mM'lik son konsantrasyona sindirim tamponuna kalsiyum klorür ekleyin.Sonra, doku ya küçük bir hacim ekleyin ve iyice kıyma. Kıyma doku için hazırlanan sindirim tampon yaklaşık yarısı miktarını ekleyin. Ve numuneyi 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarmak için serolojik pipet kullanın.Kalan tampon ile çanak yıkayın ve 50 mL tüp ekleyin. Pipet örnek yukarı ve aşağı birkaç kez. Daha sonra, 200-210 rpm sallayarak 37 santigrat derece 12 ila 15 dakika kuluçka.Kuluçkadan sonra numuneye 1 ila 1 hacim oranında %0,5 BSA ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Stromovasküler fraksiyonu aşağı döndürmek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 xg'de numuneyi santrifüj edin ve adiposit fraksiyonu üstte bırakın. 400 m hücre filtresine rağmen üst kısmı 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin.Daha sonra filtreyi tüpün üzerinde ters çevirin ve filtreyi ters yıkamak için %0,5 BSA kullanarak adipositleri yeni bir tüpe aktarın. BSA'nın toplam hacmini 10 ila 15 mL'ye getirin ve numuneyi serolojik pipetle yukarı ve aşağı inip çıkarın. Sonra, oda sıcaklığında beş dakika için 300 xg tekrar santrifüj.Santrifüjden sonra, numunenin üst tabakasını buz üzerinde önceden soğutulmuş yeni bir tüpün üzerine 100 m hücre filtresine dikkatlice aktarmak için geniş bir pipet ucu kullanın. Filtreyi yeterli miktarda çekirdek hazırlama tamponuyla durulayın ve atın. Bu adımdan itibaren, buz üzerinde bir örnek tutmak ve hızlı bir şekilde çalışmak.Tüpü karıştırmak için tüpü ters çevirerek iki dakikaya kadar buzun üzerinde bekletin. Sonra, 1000 xg ve 4 santigrat derece 10 dakika santrifüj. Supernatant çıkarın ve çekirdekleri hazırlık tampon 1 mL pelet resuspend.Eski tüpün duvarlarına dokunmamak için numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. L RNase inhibitörü başına 0,6 birim ekleyin ve karıştırın. Sonra, başka bir 10 dakika için örnek santrifüj.Supernatant çıkarın ve bir pelet ve çekirdekyıkama tampon 1 mL askıya. Istiflenebilir 30 m filtreler kullanarak numuneyi temiz bir tüpe çift filtreleyin. Daha sonra filtreleri yaklaşık 300 L çekirdekyıkama tamponu ile yıkayın.Sağlıklı çekirdeklerin başarılı bir şekilde izole edilmesionaylamak için, trypan ile numunenin küçük bir aliquot leke ve ortalama ölü boyutu ve ölü hücrelerin yüzde değerlendirmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. DAPI ile numunenin küçük bir aliquot leke ve 20X hedefi veya daha yüksek bir mikroskop altında inceleyin. Çekirdekler yuvarlak olmalı ve sağlam bir nükleer membrana sahip olmalıdır.Beyaz oklar bozulmamış bir membran olmadan çekirdekleri gösterir. FACS ile çekirdekleri temizledikten sonra, 4 santigrat derecede beş dakika 500 xg santrifüj ederek bu örnek konsantre. Daha sonra, çekirdekyıkama tampon uygun bir hacimde yeniden.L konsantrasyonu başına 50 ila 1500 çekirdek elde etmek ve tek hücreli çekirdekleri RNA seq ile devam etmek. Hücresel enkaz ve doublets kaldırmak için, adiposit çekirdekleri boyutu ve parçalılık nükleer agregalar ve multiplets dışlamak için sıralanır. Ve son olarak DAPI olumlu olaylar için.Bu derecelendirme stratejisi, en az agrega ve enkaz ile yüksek oranda saflaştırılmış tek çekirdekli neden. Mikroskopi ile incelendiğinde, sıralanmış çekirdekleri yuvarlak olmalı ve bozulmamış bir membrana sahip olmalıdır. Çekirdeklerin başarılı arınması, kahverengi adipositler için bir belirteç geni olan yeni doğan Ucp1 mRNA için astarlar kullanılarak gerçek zamanlı qRT-PCR ile de yapılabilir.Krom platformu, murine interscapular kahverengi yağ dokusundan 7500 nükleustransomu belirledi. T-SNE boyutsallık azaltma ve k-ortalama kümeleme ile yedi farklı hücre tipi ortaya çıktı. Tüm kümeler Fabp4, bir pan adiposit geni ve bir alt kümesi ucp1 mRNA yüksek düzeyde ifade ifade ifade etti.Çekirdekler izole edilmiş ve daha sonra bu protokol 10x Genomik Krom dahil olmak üzere hemen hemen herhangi bir tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu platformuna tabi olabilir rağmen doğruladı.

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.

Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi

Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, tek çekirdekli RNA-seq, ATAC-seq ve eklem multiomikleri (RNA-seq ve ATAC-seq) için flaş dondurulmuş, arşivlenmiş karaciğer dokularından çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.

Floresan Aktif Çekirdek Ayıklama Kullanarak Yağ Dokuları ile Adiposit-Spesifik ATAC-Seq

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

İntermüsküler yağ dokusunun (IMAT) biyolojisi, insan dokusunun sınırlı erişilebilirliği nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Burada, bu benzersiz yağ deposunun hücresel bileşimini tanımlamak için tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'ının çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi

Öğrenin yağ hücrelerinden tek çekirdek izolasyonu yöntemini, yüksek kaliteli tek hücreli transkriptom profilleme için. Bu protokol, çekirdek agregalarını ve hücresel kalıntıları en aza indirerek sağlam bir analiz sağlar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Daha fazla video keşfet