Arabidopsis'te m⁵C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

MeRIP olarak da adlandırılan metillenmiş RNA immünopresipitasyonu, tüm transkriptomlardaki metillenmiş grupları tanımlamak için tasarlanmış bir yöntemdir. Birçok model organizmanın RNA ekstraktlarına uyarlanabilir. Yöntem basittir, herhangi bir sert kimyasal işlem gerektirmez ve belirli bir değişken olduğu sürece herhangi bir RNA modifikasyonunu haritalamak için kullanılabilir.

RNA örneğini çıkarmak için, önce ilgilenilen bitki dokusu örneğinin 200 miligramını sıvı nitrojen içinde toz haline getirin ve dokunun işlem boyunca donmuş kalmasına dikkat edin. Daha sonra, öğütülmüş bitki dokusuna guanidin tiyosiyanat ve asit fenol içeren bir mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve tüm dokunun ıslak olduğundan emin olarak ters çevirerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Süpernatana 200 mikrolitre 1-bromo-3-kloropropan ekleyin ve numuneyi kuvvetlice girdaplayın. Fazları santrifüjleme ile ayırın ve yaklaşık 500 mikrolitre üst sulu fazı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Numuneye 500 mikrolitre izopropanol ve 50 mikrolitre üç molar sodyum asetat ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın.

RNA'yı santrifüjleme ile çökeltmeden önce numuneyi eksi 20 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti iki kez 500 mikrolitre% 80 etanol ile ve bir kez 500 mikrolitre% 99 etanol ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, 30 mikrolitre RNaz içermeyen suda çözmeden önce peleti beş ila 10 dakika kurutun.

RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometrede ölçün ve RNA örneğinin 20 mikrogramını bir DNaz su ve tampon çözeltisinde sindirin. 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, enzimi çıkarmak için uygun hacimde DNaz inaktivasyon reaktifi kullanın ve standart protokollere göre kılcal elektroforez ile izole edilen RNA'nın kalitesini ve saflığını kontrol edin. DNaz sindirilen numunenin RNA bütünlük sayısı yediden yüksekse, her RNA numunesinden en az 12 mikrogramını yeni bir tüpe ekleyin.

Üç mikrogram RNA numunesi başına bir metillenmiş ve bir metillenmemiş olmak üzere önceden hazırlanmış in vitro transkriptin her birinin 0.1 nanogramını dökün ve her tüpteki son hacmi RNaz içermeyen su ile 80 mikrolitreye getirin. Daha sonra, her RNA örneğinin tüm hacmini ayrı sonikasyon tüplerinde sonikasyon edin ve sonikasyonun verimliliğini ve RNA örneklerinin konsantrasyonunu kılcal elektroforez ile onaylayın. Parçalanmış RNA'nın ortalama boyutu 100 nükleotid civarında olmalıdır.

Metillenmiş RNA immünopresipitasyonu için, her sonikasyonlu RNA örneğinden dokuz mikrogram ve 60 mikrolitreye kadar RNaz içermeyen suyu yeni ayrı düşük bağlayıcı tüplere ekleyin ve RNA'yı 10 dakika boyunca bir su banyosunda 70 santigrat dereceye ısıtın. İnkübasyonun sonunda, numuneleri bir buzlu su banyosunda 10 dakika soğutun ve her numunenin 20 mikrolitresini giriş olarak eksi 80 santigrat derece saklama için yeni bir düşük bağlayıcı tüpe aktarın. Her numunenin kalan 40 mikrolitresine 860 mikrolitrelik bir nihai hacme RNaz içermeyen su ekleyin ve her numuneyi immünopresipitasyon için bir düşük bağlayıcı tüpe ve sahte bir numune olarak bir düşük bağlayıcı tüpe bölün.

Her numuneye 50 mikrolitre 10X MeRIP tamponu ve 10 mikrolitre RNase inhibitörü ekleyin. Daha sonra, immünopresipitasyon tüplerine 10 mikrolitre anti-M5C antikoru ve sahte tüplere 10 mikrolitre su ekleyin. Tüpleri parafilm ile kapatın ve numuneleri baş üstü rotasyonla dört santigrat derecede 12 ila 14 saat inkübe edin.

Ertesi sabah, numune başına 15 mililitrelik bir tüpe 40 mikrolitre boncuk ekleyin. Boncukları, yıkama başına numune başına 800 mikrolitre MeRIP tamponu ve baş üstü dönüş ile beş dakikalık üç yıkama ile yıkayın ve tamponun atılmasını sağlamak için her yıkamadan sonra boncukları bir mıknatıs üzerinde toplayın. Üçüncü yıkamadan sonra, boncukları numune başına 40 mikrolitre taze MeRIP tamponunda yeniden süspanse edin ve baş üstü rotasyonla dört santigrat derecede iki saatlik bir inkübasyon için immünopresipitasyon ve sahte numune tüplerine 40 mikrolitre yeniden süspanse boncuk ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice atmadan önce tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukları, %0,01 Tween-20 ile desteklenmiş 700 mikrolitre MeRIP tamponunda, oda sıcaklığında baş üstü dönüşle yıkama başına 10 dakika boyunca beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncukları 200 mikrolitre proteinaz K sindirim tamponu ve 3.5 mikrolitre proteinaz K içinde 50 santigrat derecede üç saatlik bir inkübasyon için dakikada 800 devirde çalkalanarak tekrar süspanse edin.

İnkübasyonun sonunda, RNA'yı gösterildiği gibi 800 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi ve asit guanidinyum tiyosiyanat fenol kloroform ekstraksiyon protokolü ile ekstrakte edin. Ekstraksiyondan sonra, ekstrakte edilen RNA peletini tam olarak 20 mikrolitre RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Bu şekilde, iyi bir RNA örneğinin temsili bir çalışması gösterilmektedir.

Sonikasyondan sonra aynı örnekte, yaklaşık 100 nükleotid boyutunda sola kaydırılan tek tip bir tepenin varlığı gözlenebilir. Daha düşük konsantrasyon, hem parçalanma sırasında RNA kaybından hem de numunenin artan hacminden kaynaklanır. İmmünopresipitasyon ve sahte örneklerin kalitesi kantitatif ters transkriptaz PCR ile değerlendirilebilir.

Bu temsili analizde, metillenmiş in vitro transkriptin yaklaşık% 80'i immünopresipitasyon numunesinde geri kazanılırken, sahte numunede sadece yaklaşık% 2'si geri kazanıldı. Metillenmemiş kontrol için, hem immünopresipitasyon hem de sahte numunelerde geri kazanım% 1'in altındaydı. Derin dizileme ve okumaları genoma hizaladıktan sonra, girdiye kıyasla immünopresipitasyon örneklerinde zenginleştirilmiş istatistiksel olarak anlamlı pencereleri tanımlamak için tepe çağırma algoritmaları uygulanabilir.

Dizileme verilerini kullanarak, RNA metilasyonunun en sık meydana geldiği nedeni belirleyebiliriz ve bu neden, spesifik bağlayıcı proteinleri aşağı çekmek için yem görevi görebilir.