Name: Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin, insan pankreas adacıklarının ön göz odacığına nakledilmesi ve iki foton görüntüleme ile uzun süreli canlı izleme yöntemini. Bu teknik, adacık greftleme dinamiklerini ve beta hücre replasman tedavilerinin değerlendirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, Stratejik Araştırma Alanı Exodiab, Dnr 2009-1039, İsveç Stratejik Araştırma Vakfı Dnr IRC15-0067 tarafından LUDC-IRC, Lund, Diabetesförbundet ve Barnförbundet'teki Kraliyet Fizyografik Derneği tarafından desteklenmiştir.

İsveç'in Lund kentinde bulunan Bölgesel Etik Komitesi, Çalışmayı, İnsanlarla İlgili Araştırmaların Etik İncelemesini Içeren Yasa'ya göre onayladı. Hayvan deneyleri İsveç hayvan deneyleri etiğine uygun olarak yapıldı ve Malmö ve Lund etik komiteleri tarafından onaylandı. 6 ila 8 haftalık immünoeksik NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-domates. Rag2-/-) alıcı fareler insan adacıklarının naklinde alıcı olarak kullanılmıştır10.
1. Transplantasyon için adacık hazırlığı
<ol><li>CMRL 1066'da 10 mM HEPES ile desteklenen kültür insan adacıkları, 2 mM L-glutamin, 50 μg/mL gentamisin, 0.25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nikotinamid (NIC) ve %10 ısı yalıtımlı insan serumu 37 °C'de %5 CO2 ve transplantasyona kadar nemlendirilmiş hava, daha önce açıklandığı üzere12. NOT: Adacıklar ekzonrin dokudan arınmalı ve kültürde birbirine dokunmamalıdır. Ekzonrin dokular yarı saydam görünür.</li>
	<li>Nakil günü, adacıkları içeren kültür ortamını, çekilen cam kılcal damara bağlı bir aspiratör tüp ütyülü kullanarak yeni bir Petri kabına aktarın. NOT: Alternatif olarak, 200 μL'lik bir pipet kullanın. Petri kabının arkasını boyamak, adacıkların stereo mikroskop altında daha kolay ayırt edilebilir hale getirmenize yardımcı olur.</li>
	<li>Stereo mikroskop kullanarak, transplantasyon başına ~20-40 adacıkları seçin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü en üste, kuvözden gelen kültür medyasıyla doldurun.</li>
	<li>Tüpleri parafin filmile kapatın ve nakil yapılana kadar buzüzerinde saklayın. Yapılan nakil sayısıiçin uygun miktarda hazırlayın.</li>
	<li>Alternatif olarak, adacıkları kültürde tutmak ve her nakilden hemen önce almak için ameliyathanede bir CO2 kuluçka makinesi nin bulunduğundan emin olun.</li>
</ol>2. Transplantasyon ekipmanlarının hazırlanması ve cerrahi tablo
NOT: Tüm cerrahi aletler otoklavlı olmalı ve ameliyat masası ve aletler %70 alkol le dezenfekte edilmelidir.
<ol><li>Stereotaksik bir baş tutucuyu burun maskesi ile anesteziye bağlayın ve ısıtma yastığını açın.</li>
	<li>Bir gaz geçirmez Hamilton şırınga polietilen tüp ve künt uç göz kanül bağlayın. NOT: Montajdan önce tüm parçaların PBS ile doldurulması önerilir. Sıkışıp hava kabarcıkları için kontrol edin ve varsa kaldırın.</li>
	<li>Hamilton şırıngayını masaya sıkıca takın(Şekil 1a)veya hareketli bir taban(Şekil 1e)ve tüpü stereo mikroskoba takın, kanül aşağı asılı (yani bekleme pozisyonu). NOT: Cerrahi bant kullanın, çünkü kolayca çıkarVe yeniden takın.</li>
	<li>0,1 mg/kg buprenorfin çözeltisi ile doldurulmuş 30 G iğneye bağlı 1 mL şırınga hazırlayın.</li>
	<li>Steril PBS ile bir şırınga hazırlayın. Alternatif olarak, bir pipet kullanın.</li>
	<li>Isıtma lambası ile temiz bir uyandırma kafesi koyun.</li>
</ol>3. Ameliyat için alıcı farelerin anestezisi ve konumlandırılması
NOT: Lund Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde tüm hayvanlar patojensiz bir ortamda yetiştirildi ve bakımını sürdürdü.
<ol><li>Fareyi %40 O2/60% N2/3 izofluran ile dolu bir odada anesthetize ve sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde baş tutucu platforma anestezili fare transfer(Şekil 1a). Pedal refleksleri eksikliği olup olmadığını kontrol edin. NOT: Isoflurananestezi ameliyat sonrası hızlı iyileşme için tercih edilen anestezi yöntemidir. Mikroskop odası isoflurane kullanmak için düzgün bir şekilde havalandırılmalıdır.</li>
	<li>Farenin balığını %40 O 2/60%2N2/0.9%-1.5% isofluran anestezi makinesine bağlı anestezi maskesine yerleştirin. Başparmağı nızı ve parmağınızı kullanarak başı hafifçe yukarı kaldırın ve yanlarda metalik parçaları kullanarak sabitle. Kulaklıkların başLarı doğrudan kulakların altına sabitlediğinden emin olun. Farenin arkasına deri altında 0.1 mg/kg buprenorfin çözeltisi enjekte edin. NOT: Buprenorfin analjezik olarak kullanılır.
</li>
	<li>Başını, ameliyat edilecek gözün yukarı bakacak şekilde eğin ve araştırmacıya yakın olun.</li>
	<li>Künt forceps kullanılarak nakledilecek gözün göz kapaklarını hafifçe geri çek, gözü dışarı çıkar ve bir çift cımbızla gevşek bir şekilde düzeltin. Cımbızın uçlarının baş tutucu platforma bağlı polietilen bir tüple kaplı olduğundan emin olun(Şekil 1a,insert).</li>
	<li>Her zaman göz üzerine steril PBS bir damlacık uygulayarak her iki göz ıslak tutun.</li>
	<li>İnsan adacıklarını mühürlü 1,5 mL borudan (bölüm 1) steril PBS'li bir Petri kabına aktarın ve aktarılan hücre kültürü ortamı miktarını en aza indirmek için adacıkların birbirine yakın olduğundan emin olun(Şekil 1c).</li>
	<li>Hamilton şırınga polietilen boru ile bağlı göz kanül ~ 20-30 adacıkları pick up. NOT: Adacıklarla mümkün olduğunca az sıvı alın.</li>
	<li>Tüpü baş aşağı asın ve stereo mikroskoba takın (Şekil 1d). Adacıkların tüpün ucuna kadar kanüle doğru batmasını sağlamak için boruları dikkatlice bantlayın.</li>
</ol>4. Transplantasyon prosedürü
NOT: Bu yöntem daha önce fare adacıklarının nakli için tanımlanmıştır6. Burada biraz değiştirilmiş bir yordam sunulmuştur.
<ol><li>Farenin uyuduklarından emin olmak için arka bacaklardaki pedleri çimdikle.</li>
	<li>Kan akışını bozmadan gözü dizginleyen kasları sıkın ve göze steril PBS damlatın.</li>
	<li>Neşter olarak 25 G iğne kullanarak, yukarı doğru eğilin, dikkatle kornea ucunun sadece yarısını nüfuz ve tek bir lateral kesi yapmak. Deliği yukarı doğru açıyla yapın; delik nakilden sonra daha kolay mühürlenir (Şekil 1f).</li>
	<li>Adacıklarla önceden yüklenmiş kanülile korneayı dikkatlice kaldırın ve göze adacıkları yavaşça uygulayın. Irisin zarar görmesini önlemek için kanülön haznesine kanül takılmaktan kaçının, ancak kornea açıklığı ile dikkatlice itin(Şekil 1g).  Yavaşça ACE kanül geri. NOT: 3-8 μL enjeksiyon hacmini hedefleyin. Hacim çok büyükse, gözü gereksiz yere yüksek göz içi basıncına maruz bırakır ve enjekte edilen adacıkların ön hazneden reflüolmasına neden olabilir.</li>
	<li>Göz odasında artan basınç nedeniyle adacıkların takılması ile ilgili zorluklarla karşı karşıya, lateral kesi bölgesitakviye ve adacıklar yeniden uygulayarak kesi bölgesibüyütmek. NOT: Bazen, tanıtılan hava kabarcıkları uzay tutucuolarak kullanılabilir.</li>
	<li>Göze göz jeli uygulayın, göz tutma forsepsgevşetin ve adacıklar ayarlamak için 8-10 dakika boyunca aynı pozisyonda izoflurane fare bırakın.</li>
	<li>Göz kapağını tutan pçineleri çıkarın ve göz kapağını normal konumuna geri koyun.</li>
	<li>Fareyi baş tutucudan çıkarın ve uyandırma kafesine aktarın.</li>
	<li>Fare uyanık ken ve hareket ederken, orijinal kafese geri aktarın ve tarama kadar hayvan muhafaza tutmak (en az 5 gün önerilir).</li>
</ol>5. İmplante edilen insan adacıklarının 2-foton mikroskopi ile görüntülenmesi
NOT: 2-foton görüntülemeden 4-5 gün önce transplantasyondan 4-5 gün önce floresan stereoskopik mikroskobu kullanarak gözün genel görüntülerinin alınması, ilgi çekici adacıkların lokalize edilmesi önerilir.Figure 2ac Transplantasyondan sonra gözü bu kadar sıkı bir şekilde dizginlemekten kaçının. Transplantasyon sonrası 6-7 gün 2 foton görüntüleme kullanın.
<ol><li>Görüntü edinme yazılımını başlatın (bkz. Malzeme Tablosu). "Laser" menüsünde Mai Tai lazerini (Power "ON") ve "Işık Yolu" menüsünde dalga boyu 900 nm'ye ayarlayın ve %5-10 lazer gücüyle başlayan minimum iletim lazer gücü uygulayın (sürgü kullanın). NOT: Tarama sırasında lazer gücünü gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Yeşil, turuncu ve kırmızı kanallar ayarlayın. Dikronik bir ayna (LBF 760) ve emisyon filtresi bilgilerini kullanarak üç adet nondetcanned dedektöre (NDD) aynı anda emisyon ışığı toplayın: Red/Angiosense 680, 690-730 nm; Yeşil/Otofloresans, 500-550 nm; ve Portakal / Domates, 565-610nm (Şekil 2d).</li>
	<li>Baş tutucu sahneyi motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin ve gaz maskesini anestezi makinesinin ve havalandırma sistemine bağlı boruların borularına bağlayın. Isıtma yastığını açın.</li>
	<li>Alıcı fareyi anesthetize edin, baş tutucu platformuna aktarın, görüntüleme için gözü dizginleve yukarıda açıklandığı gibi buprenorfin çözeltisini uygulayın (3.1-3.5. adım).</li>
	<li>Isofluran buharlarını gerektiği gibi ayarlayın. Dakikada ~55-65 nefes hızı (bpm) optimal anesteziyi gösterir. Anestezi çok derin ise, oranı olacak <50 bpm ağır nefes alma veya nefes alma; çok hafif ise, oranı yüzeysel nefes ile >70 bpm olacaktır. Anestezi sırasında fareleri her 15 dakikada bir görsel muayene ile dikkatle izleyin. NOT: Anestezi fareden fareye, fare suşları arasında ve anestezi altında zaman ilerledikçe değişir13.</li>
	<li>Kornea ve lens arasında bir daldırma sıvı olarak göze yeterli göz jeli uygulayın, yavaş yavaş birikmesine izin(Şekil 2f, eklemek). Hava kabarcıkları kaçının. NOT: Odak noktasını ayarlamak ve adacık greftlerini lokalize etmek için esnek metal hortum lambası ile yan aydınlatma önerilir.</li>
	<li>Kan damarlarını görselleştirmek için, tek kullanımlık insülin 30 G şırınga kullanarak kuyruk damarına intravenöz olarak görüntüleme maddesinin (örneğin, Angiosense 680) 100 μL'sini uygulayın.</li>
	<li>"Edinme modunda" çerçeve boyutunu 512 x 512 ve tetkik hızına ayarlayın. NOT: Daha yavaş taramalar (yani, çalışma süresini artırmak) sinyal-gürültü oranını artıracaktır.</li>
	<li>"Kanallar" menüsünde, Canlı tarama modunda ekranda bir görüntü görülene kadar sinyali yükseltmek için Volt'taki her PMT için Master Gain'i ayarlayın. Bu değer ne kadar yüksekse, dedektör sinyal ve gürültüye o kadar duyarlı hale gelir. NOT: Tercihen, değerleri 500-800 V arasında tutun.</li>
	<li>"Z-stack" menüsünde, odak noktasını adacık greftinin üstüne elle taşıyarak z yığınının başlangıcını ve sonunu tanımlayın. "Önce Ayarla" seçeneğini seçerek konumu kaydedin. Adacık greftine odaklanabilen son alt düzleme geçin ve"Son Set"seçeneğini seçerek konumu kaydedin. 2 μm z-adım boyutu kullanın.</li>
	<li>"Deneyi Başlat" sekmesini tıklatarak son resim yığınını toplayın ve 8 bit czi (yani Carl Zeiss formatı) dosyasını kaydedin.</li>
</ol>6. İmplante edilen insan adacıklarının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi
NOT: Nakledilen adacıkların toplam hacmi, morfolojisi ve plastisiteleri, lazer arka saçılmaışığının 10algılanması yla in vivo saçılma sinyalinin ayrı bir taramalarda (yani ayrı parça) izlenmesi yle değerlendirilebilir.
<ol><li>Ana ışın ayırıcısını (yani LBF Filtresi) ve "Işık Yolu" iletişim kutusunda, konfokal görüntüleme için ayrı bir parça ayarlayın. 633 nm dalga boyuna sahip Argon lazerini seçin ve lazer ışığıyla aynı dalga boyunda algılamayı seçin. Z-yığınları, geri saçılma ışık sinyali için 2-3 μm'lik bir adım boyutuile elde edilir.</li>
	<li>Tüm adacık kaydını yaptığınızdan emin olmak için z yığını ayarlarını düzeltin (bkz. adım 5.10).</li>
	<li>Görüntü yığınını edinin ve 8 bit CZI dosyası olarak kaydedin.</li>
</ol>7. Görüntü analizi
NOT: Bu adım için ticari yazılım (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılmıştır.
<ol><li>Adacık otofloresansı çıkarma (Şekil 3b)<ol>
<li>"Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal aritmetik" ve "ch1-ch2" yazın. Bu yeni bir kanal 4 (ch 4) oluşturur; olarak yeniden adlandırın "Vasculature". NOT: Yeşil/Otofloresan kanalı Red/Angiosense kanalından çıkarılır.</li>
		<li>Yeni bir kanal (ch 5) oluşturmak için önceki adımı tekrarlayın ve "ch3-ch2" yazın; olarak yeniden adlandırın "Domates (tüm)". NOT: Yeşil/Otofloresan kanalı Turuncu/Domates kanalından çıkarılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Adacık maskesinin manuel çizimle tanımlanması (Şekil 3c)<ol>
<li>Yeni bir yüzey (mavi sembol) oluşturun ve sihirbazda "El ile Edit" seçeneğini belirleyin. Bölümleri görselleştirmek için işaretçiyi "Seç" modunda ve 3B görünümde "Volume" (Scenealtında) seçeneğini kdurumunda tutun.</li>
		<li>Daha kolay adacık sınır ayrımcılığı için, ch 1-ch 3 dahil olmak üzere tüm kanalları etkinleştirin. NOT: Portakal/Domates kanalı, adacık kenarlıklarını Domates kapsülü sinyali ile tanımlamak için yararlıdır. Alternatif olarak, kılavuz olarak çok kanallı adacık otofloresan ve dedektör arka plan sinyalini kullanmak için kanal yoğunluklarını artırın.</li>
		<li>"Çizim" sekmesinde "Kontur" seçeneğini belirleyin ve dilim konumundan başlayarak adacık kenarlığı çevresinde kontur çizmeye başlamak için "Çiz "tuşuna basın.</li>
		<li>Yeni bir dilim konumuna geçin ve çizim hatlarını tekrarlayın. Adaçayının üstündeki son dilimle bitirin ve "Yüzey oluştur" sekmesine tıklayarak sona erdirin. Genellikle her10 dilim kontur çizmek için yeterlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>"Adacık vaskülature" ve "Adacık domatesi" floresanının adacık maskesi kullanılarak segmentasyonu (Şekil 3d).<ol>
<li>Önceden tanımlanmış "Adacık maskesi" nesnesini seçin, düzenleme sekmesine(kalem simgesi) gidin ve yeni bir pencere açan "Maske tüm" sekmesine tıklayın.</li>
		<li>Kanal seçimi açılır menüsünde daha önce adlandırılmış "Vasculature" (ch 4) kanal ını seçin vemaskeyi uygulamadan önce" Yinelenen kanal ", "Constant iç/dış" seçeneklerini etkinleştirin ve voxel'leri yüzey dışında "0,000" olarak ayarlayın, bu da yeni bir kanal oluşturur; "Adacık vaskülature" (ch 6) olarak yeniden adlandırın.</li>
		<li>7.3.1 ve 7.3.2 adımlarını tekrarlayın ve kanal seçiminde daha önce oluşturulmuş "Tomato (all)" (ch 5) kanal ını seçin ve yeni kanalı oluşturmak için menüden açılır; "Adacık domatesi" (ch 7) olarak yeniden adlandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Adacık vaskülatürünün yüzey işlemesi (Şekil 3e)<ol>
<li>"Scene" menüsünde yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda "Otomatik oluşturma" seçeneğini belirleyin.</li>
		<li>Kaynak kanalı daha önce oluşturulmuş "Islet vasculature" (ch 6) olarak ayarlayın ve arka plan çıkarma nızı seçin. Gerekirse otomatik eşik tahmini ayarlanabilir. Yanıt veren floresan kanalıyla karşılaştırın (örneğin, yeni oluşturulan yüzey sekmesini karıştırarak/çıkararak). Sihirbaza devam edin.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak, filtreler kullanın. Örneğin, "Birim" seçeneğini belirleyin ve penceredeki filtreyi (sarı) ayarlayarak seçili yüzey nesnelerini kaldırabilen leri ayarlayın. Sihirbazı bitirin ve yeni yüzey nesnesine "Adacık vaskülature" adını verin.</li>
	</ol></li>
	<li>"Adacık domates vaskülatür" floresan sinyalinin segmentasyonu (Şekil 3f)<ol>
<li>Daha önce oluşturulan "Adacık vaskülature" yüzey nesnesinde düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açan "Maske tüm" sekmesine tıklayın.</li>
		<li>Kanal seçimimenüsünde daha önce adı geçen "Islet tomato" (ch 7) kanalını seçin ve yeni kanalı oluşturan "10.000" olarak yüzeyin dışındaki voxel'leri ayarlayın; "Adacık domates vaskülature" (ch 8) olarak yeniden adlandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>" Domateskapsülü" floresan sinyalinin segmentasyonu (Şekil 3g)<ol>
<li>"Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal Aritmetik"seçeneğini seçin ve "ch7-ch8" yazın, yeni kanal oluşturma; " Domateskapsülü" (ch 9) olarak yeniden adlandırın. NOT: "Adacık domates vaskülature" floresan sinyali toplam "Adacık domates" floresan sinyali çıkarılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Yüzey işleme "Adacık domates vaskülature" ve "Domates kapsülü" (Şekil 3h)<ol>
<li>Adım 7.4 izleyin ve sihirbaz kaynak kanalları seçin "Adacık domates vaskülature" (ch 8) veya "Domates kapsülü" (ch 9) buna göre yeni yüzey nesneleri oluşturmak için.</li>
	</ol></li>
	<li>Toplam adacık yüzeyinin yüzey işlemesi (Şekil 3i)<ol>
<li>Adacık geri dağılım dosyasını açın ve yeni bir yüzey oluşturun.</li>
		<li>Sihirbazda , "Otomatik oluşturma" seçeneğini belirleyin ve " İlgi Alanı " olaraktanımlayın. NOT: "İlgi bölgesi" birden fazla adacık sinyallerini ayırmak ve analiz edilecek adacık derinliğini tanımlamak için kullanılır (örn. en iyi 75 μm).</li>
		<li>"Mutlak yoğunluk" gerekirse eşiği ayarlayın. Yüzey nesnesi, ilgili kanal yoğunluğuyla çapraz kontrol için tıklanabilir veya kapatılabilir. Sihirbazı kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Niceleme (Şekil 3j)<ol>
<li>"Scene" menüsünde oluşturulan bir yüzey nesnesini seçin ve "İstatistikler" sekmesine gidin.</li>
		<li>Seçili yüzey nesnesinde ayrıntılı hacim verilerini almak için "Ayrıntılı" sekmesini seçin ve açılır menüden "Belirli değerler" ve "Birim" seçeneğini belirleyin. Seçili yüzey nesnesinin toplam birim değerini almak için "Ayrıntılı" sekmesine gidin ve "Ortalama değerleri" seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+The+epidemic+of+the+century%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li>
<li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+response+in+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035(2014).</li>
<li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity%2C+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li>
<li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li>
<li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382(2017).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li>
<li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li>
<li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamics+of+CD11c%28%2B%29+cells+and+Foxp3%28%2B%29+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li>
<li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane%3A+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenninger%2C+RK+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).</li>
<li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).</li>
<li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li>
<li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+development%3A+learning+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li>
<li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1(2015).</li>
<li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li>
<li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica.+Advances+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li>
<li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li>
<li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li>
<li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET%2FMRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li>
<li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging%3A+why+clinical+implementation+has+never+been+closer%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li>
<li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li>
<li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bir yöntem alıcı ve donör doku tutulumu gözlemleyerek insan pankreas adacık hücre greftleme süreci çalışma sunulmaktadır. İnsan adacıklarını immünofif fare gözünün ön odasına yerleştiren minimal invaziv bir ameliyattan sonra fare ameliyattan birkaç dakika sonra hızla iyileşir. İşlem tek göze yapılır. Genellikle, 5-7 gün postimplantasyon itibaren kornea yeterince intravital görüntüleme yapmak için iyileşmiş.
Bu protokolde insan adacık greftlerinin kalitesi çok önemlidir. İnsan adacık kalitesi v...

Diabetes mellitus, kan şekerinin yükselmesi ile karakterize bir grup metabolik hastalığı pankreas adacık beta hücrelerinin kaybı veya disfonksiyonundan kaynaklanan yetersiz insülin üretiminin sonuçları olarak tanımlar, genellikle insülin direnci ile birlikte. Tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) beta hücrelerinin ilerleyici disfonksiyonunun hastalık gelişimine neden olduğu karmaşık hastalıklardır. T1D beta hücrelerine otoimmün bir saldırı ile çökelti, T2D metabolik faktörler tarafından tahrik olarak kabul edilir ken, düşük dereceli sistemik inflamasyon artan kanıtlarla da olsa1. Özellikle T1D hastalarına donör insan adacıklarının nakli fizyolojik glisemik kontrol sağlama potansiyeli sunar. Ancak, doku donörleri ve kötü adacık engraftment bir sıkıntısı bir ana tedavi seçeneği haline adacık nakli engelledi. Fonksiyonel adacık greftinin önemli bir kısmı hipoksik, inflamatuar, immünojenik konakortamı2,3nedeniyle hemen posttransplantasyon sonrası dönemde (24-48 saat) kaybolur. Adacık sağkalımının iyileştirilmesi için müdahale yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek için bu tür transplantasyonların sürekli izlenmesi gerekmektedir.
Transplantasyon sonrası nakledilen insan pankreas adacıklarının kaderini görüntülemek ve izlemek için in vivo teknikleri hala diyabet araştırma4,,5için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir . Bugüne kadar pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason (US) dahil olmak üzere noninvaziv görüntüleme teknikleri, deneysel koşullarda nakledilen adacıkların nicelve fonksiyonel değerlendirilmesi için potansiyel göstermektedir5. Ancak, küçük adacık boyutları göz önüne alındığında, bu yöntemlere göre nicel ölçümler yetersiz çözünürlük muzdarip. Gözlem için bir transplantasyon sitesi olarak gözün ön odası (ACE) uzun süreler boyunca etkili bir şekilde daha yüksek mekansal çözünürlük ve sık izleme sunan umut verici bir noninvaziv görüntüleme çözümüdür6. Bu yöntem başarıyla fare adacık biyolojisi (Yang ve ark.7gözden), otoimmün immün yanıtlar8,yanı sıra insan adacık aşılama9,10çalışma için istismar edilmiştir.
Burada ACE transplantasyon yöntemi, transplantasyondan sonra 10 aya kadar bireysel adacık greftleri üzerinde sürekli ve tekrarlanan kayıtlar la insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamiklerini araştırmak için 2-foton görüntüleme yaklaşımı ile birleştirilir. Daha fazla görüntüleme derinliği ve azaltılmış genel fotobeyaztma ve foto hasarı multifoton görüntüleme özellikleri konfokal mikroskopi11görüntüleme sınırlamaları aşmak . Floresan görüntülemenin nicelleştirilmesi, adacık numune hazırlama, adacık nakli, görüntü edinimi, adacık gürültüsünü veya arka planı kaldırmak için görüntü filtreleme, segmentasyon, sayısallaştırma ve veri analizi dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir. En zorlu adım genellikle bir görüntüyü birden çok parçaya veya bölgeye bölmek veya bölmektir. Bu, sinyali arka plan gürültüsünden ayırmayı veya örneğin adacık vaskülature'u temsil eden bir 3B birimin voksellerini algılamak ve etiketlemek için renk veya şekil benzerliklerine dayalı voxels bölgelerini ayırmayı içerebilir. Bölümlere çıkarıldıktan sonra, nesne hacmi boyutları gibi istatistiklerin ayıklanması genellikle kolaydır. Sağlanan segmentasyon ve veri görselleştirme gibi görüntüleme verilerinin sayısallaştırılması ve ayıklanması için bir yöntemdir. Özellikle dikkat insan adacıkları otofloresan ve adacık vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan arasındaki ayrım kaldırılması için ödenir.

<table><tbody><tr><td>Anestezi makinesi, örneğin Anestezi Ünitesi U-400</td><td>Agnthos</td><td>8323001</td><td>ameliyat sırasında izofluran anestezisi için kullanılır ve</td></tr> <tr><td>görüntüleme-indüksiyon odası 1,4 L</td><td>Agnthos</td><td>8329002</td><td>hortum ile U-400</td></tr> <tr><td>gaz yönlendirme anahtarı</td><td>Agnthos'a</td> bağlanır <td>8433005</td><td>tüp ile U-400</td></tr><tr><td>AngioSense 680 EX'e</td> bağlanır <td>Percin Elmer</td><td>NEV10054EX</td><td>insan adacık greftlerindeki kan damarlarını görüntülemek için kullanılan enjeksiyon için görüntüleme ajanı</td></tr><tr><td>Aspiratör tüpleri tertibatları</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td>, <td>manuel adacık toplama için çekilmiş kılcal pipetlerle bağlanır</td></tr><tr><td>Buprenorfin (Temjezik) 0.3mg/ml</td><td>Schering-Plough Europ&eacute;</td><td>64022</td><td>sıvı, ağrı kesici için</td></tr><tr><td>Kılcal pipetler</td><td>VWR</td><td>321242C</td><td>ile birlikte kullanılan Aspiratör tüpleri tertibatları</td></tr><tr><td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1830</td><td>enjeksiyon için görüntüleme ajanı</td></tr><tr><td>Göz kanülü, künt uçlu, 25 G</td><td>BVI Visitec/BD</td><td>BD585107</td><td>Konik Hidrode astardan [Blumenthal] özel olarak üretilmiştir, boyutlar: 0,5 x 22 mm (25G x 7/8 inç) (45?), uç 30 G'ye kadar konik ( 0,3 mm)</td></tr> <tr><td>Göz jeli</td><td>Novartis</td><td></td><td>Viscotears, Karbomer 2 mg / g</td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 0,5 ml içerir, Model 1750 TPLT</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td>Adacık enjeksiyonu için piston tipi gaz geçirmez şırınga</td></tr> <tr><td><güçlü>Baş tutucu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Baş tutma adaptörü</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td>, <td>metal</td></tr> <tr><td>plaka-gaz maskesi</td> üzerine monte edilmiştir<td>Narishige</td><td>GM-4-S-UST-2</td><td></td></tr> <tr><td>Katı Üniversal Bağlantı</td><td>Narishige</td><td>UST-2</td><td>metal plaka üzerine monte</td></tr> <tr><td>edilmiş-kafa tutucu montajı</td><td></td><td></td><td></td> için özel yapım metal</tr> <tr><td>plaka-Dumont #5, düz</td><td>Agnthos</td><td>0207-5TI-PS veya 0208-5-PS</td><td>UST-2'ye bağlı (özel yapım)</td></tr> <tr><td>Isıtma yastığı, stereotaksik</td><td>platforma özel olarak bantlanmış</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İnsan adacık kültürü ortamı< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-CMRL 1066</td><td>ICN İnsan</td><td>adacıkları için biyomedikal</td><td></td> hücre kültürü</tr> <tr><td>ortamı-HEPES</td><td>GIBCO</td> BRL-L-glutamin <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>GIBCO BRL-Gentamisin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GIBCO BRL-Fungizone</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GIBCO BRL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Siproksfloksasin</td><td>Bayer sağlık AG-Nikotinamid</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaris 9</td></tr><tr><td>Image Aquisition yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2010</td></tr><tr><td>Uyandırma kafesinde hayvanları sıcak tutmak için kullanılan</td><td>VWR</td><td>1010364937</td> kızılötesi<td>lamba</td></tr><tr><td>Isofluran Isoflo</td><td>Abott İskandinavya/Apotek</td><td></td><td>sıvısı, anestezi için</td></tr><tr><td>İğne 25 G (0,5 x 16mm), turuncu</td><td>BD</td><td>10442204</td><td>neşter olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Petri kapları, 90mm</td><td>VWR</td><td>391-0440</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>2-Foton/konfokal mikroskop</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-LSM7 MP dik mikroskop</td><td>Zeiss-Ti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Safir lazer Tsunami</td><td>Spectra-Physics, Mai Tai-uzun</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mesafe su daldırma lensi 20x/NA1.0</td><td></td> Zeiss-ET710<td></td><td></td></tr><tr><td>/40m (Angiosense 680)</td><td>Chroma</td><td></td> 288003-ET645<td></td></tr><tr><td>/65m-2p (TR)</td><td>Chroma</td><td></td> NC528423-ET525<td></td></tr><tr><td>/50 (GFP)</td><td></td>Chroma-ET610<td></td><td></td></tr><tr><td>/75 (domates)</td><td>Chroma-ana</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ışın ayırıcı T680lpxxr</td><td>Chroma</td><td>T680lpxxr 690</td><td>nm ve üzeri iletmek ve 440 ila 650 nm yansıtmak için dikroik ayna boyut 25,5 x 36 x 1 mm</td></tr><tr><td>Polietilen boru (0,38 mm ID, 1,09 mm OD)</td><td>Smiths Medical Danmark</td><td>800/100/120</td><td>Hamilton şırınga ve göz kanülü ile bağlantı kurmak için</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Model SMZ645, adacık toplama için</td></tr><tr><td><güçlü>Stereomikroskop (Floresans)</güçlü></td><td></td><td></td> <td>adacık grefti görüntüleme</td></tr> <tr><td>için-AZ100 Multizoom</td><td>Nikon</td><td></td><td>geniş alan ve uzun</td></tr> <tr><td>mesafe-AZ Plan Apo 1x</td><td>Nikon-AZ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plan Apo 4x</td><td>Nikon-AZ-FL</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C-LHGFI HG lambalı Epifloresans</td><td>Nikon-HG</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Manuel Yeni Intensilight</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Epi-FL Filtre Bloğu TEXAS RED</td><td>Nikon</td><td></td><td>, EX540-580, DM595 ve BA600-660-Epi-FL</td></tr> <tr><td>Filtre Bloğu G-2A</td><td>Nikon</td><td></td> <td>(EX510-560, DM575 ve BA590)</td></tr> <tr><td>içerir-Epi-FL Filtre Bloğu B-2A</td><td>Nikon</td><td></td> <td>(EX450-490, DM505 ve BA520)</td></tr> <tr><td>-DS-Fi1 Renkli Dijital Fotoğraf Makinesi (5MP)</td><td></td><td></td><td></td></tr> Nikon <tr><td>Şırınga 1-ml, Omnitix</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>Buprenorfin enjeksiyonu için, 27 G iğne ile kullanılır</td></tr><tr><td>Cerrahi bant</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anterior göz odasında İnsan pankreas adacık greftleme ve katkıda bulunan konak hücrelerinin vivo görüntüleme ve nicelleştirmesinde boylamsal

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Beta hücrelerinin görüntülenmesi adacık transplantasyonuna yönelik önemli bir adımdır. Beta hücre biyolojisinin kaydı için farklı görüntüleme platformları geliştirilmiş ve in vivokullanılmıştır, tek hücre çözünürlüğü ve sürekli uzunlamasına kayıtlara izin verme açısından sınırlıdır. Korneanın saydamlığı nedeniyle, farelerde gözün ön odası (ACE) iyi insan ve fare pankreas adacık hücre biyolojisi çalışmak için uygundur. Burada bu yaklaşımın aşılama ve bireysel insan adacık greftlerinin revaskülarizasyon sürekli uzunlamasına kayıtları gerçekleştirmek için nasıl kullanılabileceğinibir açıklamasıdır. İnsan adacık greftleri ACE içine yerleştirilir, NOD kullanılarak. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-alıcı olarak fareler. Bu, alıcıya karşı donör hücrelerin genişlemesinin araştırılmasına ve alıcı hücrelerin greftin kapsüllenmesi ve vaskülarizasyonunu teşvik etmedeki katkısına olanak sağlar. Ayrıca, görüntü analizi ve adacık hacmi veya parçalı vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan nicelik için adım adım bir yaklaşım özetlenmiştir.

Etiketsiz insan adacıkları 8 haftalık dişi NOD ACE'ye nakledildi. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-domates. Rag2−/−) alıcı fareler. İnsan dokusunun reddini önlemek için, immün eksik Rag2 nakavt fareler alıcı olarak seçildi. Bu transgenik farelerde, tüm hücre ve dokular alıcı ve donör doku net bir kimlik sağlayan bir membran hedefli domates floresan protein (mT) ifade. Adacık greftlerinin yüksek çözünürlüklü 2-foton mikroskobu ile tekrart...

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE en uygun görüntüleme manzaralarıdır. Bir aşılama durumunda işlevlerini ve canlılığını incelemek için adacık hücrelerinin in vivo görüntülemesinde uzun süreli olarak tekrarlamayı destekler. Aynı zamanda gerçek zamanlı olarak fizyolojik ve patolojik koşullar altında diğer yönlerini incelemek için uzatılabilir.ACE tekniğinin avantajı aynı bireysel insan pankreas adacıkları uzun bir süre için alt hücresel çözünürlük ile noninvaziv takip edilebilir aslında yatıyor. Beta hücre replasman tedavisinin başarı oranları artmaya devam etmektedir. Ancak, adacık greftleme ve in vivo hayatta kalma verimliliğini değerlendirmek, hala zor olmaya devam etmektedir.Bu yöntem adacık transplantasyonlarının sonuçlarının değerlendirilmesine ve optimize edilebilebilir. Bu yaklaşım sadece pankreas adacıkları ile sınırlı değildir. Ayrıca etkilenen dokuları incelemek için de uygundur.Örneğin, diyabetik komplikasyonlar, böbrek glomeruli veya karaciğer parçaları gibi, sadece birkaç isim. Başlamak için fareyi sıcak bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve burun maskesini takın. Başparmağı ve işaret parmağını kullanarak başı hafifçe kaldırın.Yanlarında metalik parçalar ile sabitle. Kulak parçalarının başın doğrudan kulakların altından düzeltdiğinden emin olmak. Subkutan farenin arkasına buprenorfin çözeltisi enjekte edin.Künt forceps kullanılarak nakledilecek gözün göz kapaklarını hafifçe geri çekin. Göz dışarı pop ve gevşek bir polietilen tüp ile kaplı cımbız bir çift ile düzeltmek. Göz kapaklarını PBS içeren bir Petri kabına aktardıktan sonra, göz kannularında yaklaşık 20-30 adacık toplayın.Yukarı doğru 25 gauge iğne seviyesi kullanarak, dikkatle kornea içine ucu takın ve tek bir yanal kesi yapmak. Adacıklarla önceden yüklenmiş kanülle korneayı dikkatlice kaldırın ve adacıkları yavaşça göze bırakın. Yavaş yavaş kanül geri çekmek ve göze göz jeli uygulayın.10 dakika sonra, göz kapağını tutarak ve gözü normal konumuna geri koyarak, forcep'leri çıkarın. İki foton mikroskoplu implante edilmiş insan adacıklarının görüntülenmesi için, baş tutucu platformu mikroskop altına yerleştirin ve kornea ile lens arasında bir daldırma sıvısı olarak göz jelini göze uygulayın. Gözü hedefin altına yerleştirin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi implante edilmiş insan adacıklarını görüntüleyin.Otomatik floresan'ı kaldırmak için görüntü işleme sekmesine gidin, kanal aritmetiklerini seçin ve kanal 1 eksi kanal iki yazın. Bu yeni bir kanal dört oluşturur. Adını vaskülatür olarak yeniden adlandır.Bu işlemi tekrarlayın ve yeni bir kanal beş oluşturmak ve tüm domates yeniden adlandırmak için kanal üç eksi kanal iki yazın. Adacık'ı tanımlamak için el ile yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda el ile edin'i seçin. İşaretçiyi seçme modunda ve 3B görünümde tutun.Bölümleri görselleştirmek için ses seviyesini tıklatın. Çizim sekmesinde kontur seçin ve dilim konumu bir başlayarak, adacık kenarlığı etrafında konturları çizmeye başlamak için çiz'i tıklatın. Ardından yeni bir dilim konumuna geçin ve çizim hatlarını tekrarlayın.Adacık üstündeki son dilimle bitirin ve yüzey oluştur sekmesini tıklatarak sona erdirin. Sonraki segment, adacık vaskülatür ve adacık domates floresan kullanarak adacık maskesi. Önceden tanımlanmış adacık maskesi nesnesini seçin, düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açan tüm maske sekmesini tıklatın.Kanal seçimi açılır menüsündeki vaskülature kanalını seçin ve maskeyi uygulamadan önce seçenekleri yinelenen kanalı etkinleştirin. Sabit içinde, dışında ve yeni bir kanal altı oluşturur 0.000 dış voxels ayarlayın. Bu kanal adacık vasculature yeniden adlandırın.Önceki adımları tekrarlayın ve yeni kanal oluşturmak için, yeni kanal oluşturmak için, yeniden adlandırmak, adacık domates, kanal seçimi açılır menüsünde tüm domates seçin. Ardından sahne menüsünde yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda otomatik oluşturmayı seçin. Kaynak kanalı önceden oluşturulmuş adacık vaskülatürüne ayarlayın ve arka plan çıkarma nızı seçin.İsteğe bağlı olarak filtreler kullanın. Örneğin, ses düzeyini seçin ve seçili hizmet nesnelerini kaldırabilen penceredeki filtreyi ayarlayın. Sihirbazı bitirin ve yeni yüzey nesnesi, adacık vaskülature adını.Adacık vaskülature hizmet nesnesi düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açar maske tüm sekmesini tıklatın. Kanal seçimi açılır menüsündeki adacık domates kanalını seçin ve yeni bir kanal oluşturan 10.000'e kadar dıştaki voxel'leri ayarlayın. Bu kanal adacık domates vasculature yeniden adlandırın.Domates kapsülü floresan sinyalini segmente etmek için görüntü işleme sekmesinde kanal aritmetiklerini seçin ve kanal yedi eksi kanal sekiz yeni kanalı oluşturarak yazın. Domates kapsülü olarak adlandır. Daha önce açıklandığı gibi yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbaz kaynak kanalları, adacık domates vaskülatür veya domates kapsül seçin.Sonra arka plan çıkarma gerçekleştirin. Adacık geri dağılım dosyasını açın ve yeni bir yüzey oluşturun. Sihirbazda, otomatik oluşturmayı seçin ve ilgi çekici bölge tanımlayın.Gerekirse, mutlak yoğunlukta eşiği ayarlayın. Yüzey nesnesi, ilgili kanal yoğunluğuyla çapraz kontrol yapmak için tıklanabilir veya kapatılabilir. Bittiğinde sihirbazı kapatın.Son olarak, nicelik lendirme gerçekleştirin, sahne menüsünde oluşturulmuş bir yüzey nesnesi seçin ve istatistik sekmesine gidin. Ayrıntılı birim verilerini almak için ayrıntılı sekmeyi seçin ve açılır menüden belirli değerleri ve birimi seçin. Toplam birim değerini almak için ayrıntılı sekmeye gidin ve ortalama değerleri seçin.Bu protokol, sekiz haftalık dişi kırmızı floresan alıcı farelerin göz iç odasına etiketli olmayan insan adacıkları nakli için kullanılmıştır. İnteraktif görüntüleme yazılımı daha sonra görüntülerden nicel verileri ayıklamak için kullanılmıştır. Vivo floresan görüntülemede, insan adacık greftleri, fare adacık greftlerinde gözlenmeyen doku otofloresanının önemli bir müdahalesi ile tehlikeye atıldı.Sinyalin gürültü oranını artırmak için, otofloresans kanalı çıkarıldı. Daha sonra adacık maskesi adı verilen adacık sınırı ve ilgili kanallar el ile tanımlandı. Son olarak, domates sinyalinin göz kapağı vaskülatürü ve göz kapağı kapsülüne segmentasyonu ve son yüzey işleme sayısal verileri ayıklamak için kullanılmıştır.Burada iki hafta, iki ay, beş ay ve sekiz ay sonrası transplantasyon da aynı insan adacık greft temsili uzunlamasına görüntüleme oturumu olarak. Başlangıçta kaydedilen ham verilerin MIP görüntüleri, adacık otofloresan kaldırma ve segmentli adacık nesneleri sonra işlenmiş görüntüler gösterilir. Göz kapağı enjeksiyonunu yaparken, adacıkları ACE'ye başarılı bir şekilde enjekte etmek için göz haznesini vurgulamak için adacıkları küçük hacimli olarak önceden yüklediğinizden ve stereo mikroskobunuzda esnek ikiz ışık kollarını kullandığınızdan emin olun.İn vivo görüntülemeden sonra gözler antikor boyama ve konvansiyonel histoloji açısından düzeltilebilir ve daha fazla araştırılabilir. Bu teknik, özellikle vaskülarizasyon, canlılık ve metabolik çalışmalar bağlamında, gerçek zamanlı ve fizyolojik koşullar altında bireysel insan adacıklarının fonksiyonel çalışmaları için çok yararlıdır.

longitudinal-vivo-imaging-quantification-human-pancreatic-islet

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Sanal kesit görüntüleme için aşağıdaki protokol pankreas diseksiyonu sürecini özetliyor ve sonraki tüm pankreas tüm GFP etiketli beta-hücrelerinin kantifikasyon.

Farelerde, pankreatik beta-hücre Kütle yerinde Niceleme

Bu videoda, insan adacık greftlerinin in vivo olarak revaskülarizasyonunu izlemek için insan pankreas adacıklarının farenin gözünün ön odasına aşılanması protokolü açıklanmaktadır. Ayrıca, greftin kapsüllenmesini ve vaskülarizasyonunu teşvik etmede alıcı ve donör hücrelerin katkısının anlaşılmasına yardımcı olur.

Pankreas Adacıklarının Aşılanması: İn Vivo Görüntüleme için Pankreas Adacıklarını Fare Gözünün Ön Odasına İmplante Etme Yöntemi

Intraoküler nakli ve konfokal mikroskopi birleştirerek yeni bir yaklaşım aşılı dokuların içinde tek hücreli çözünürlüğe sahip uzunlamasına, non-invaziv, gerçek zamanlı görüntüleme...

Boyuna, Non-invaziv için Eye Ön Kamara içine Nakli<em&gt; In vivo</emGerçek zamanlı Tek hücreli Çözünürlük&gt; Görüntüleme

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.

Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

Burada, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesine izin veren bir platformu tarif ediyoruz. İş akışı, birincil karaciğer hücrelerinden sferoidlerin üretilmesinden fare gözüne transplantasyona ve konfokal mikroskopi ile hücresel çözünürlükte in vivo görüntülemeye kadar uzanır.

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin, insan pankreas adacıklarının ön göz odacığına nakledilmesi ve iki foton görüntüleme ile uzun süreli canlı izleme yöntemini. Bu teknik, adacık greftleme dinamiklerini ve beta hücre replasman tedavilerinin değerlendirilmesini sağlar.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal (Video) | JoVE Journal

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Daha fazla video keşfet