Hayvansal Gıdalarda Salmonella Taramak ve Salmonella'yı Kültür İzolasyonundan Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon
20 Mayıs 2020
Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojen tespit alanında geniş ilgi gören bir izotermal nükleik asit amplifikasyon testidir (iNAAT). Burada, Salmonella'yı hayvansal gıdalarda taramak ve tahmin edilen Salmonella'yı kültür izolasyonundan doğrulamak için hızlı, güvenilir ve sağlam bir yöntem olarak çok laboratuvar onaylı bir Salmonella LAMP protokolü sunuyoruz.
Bu Salmonella LAMP yöntemi, hem hayvansal gıdalarda bir tarama yöntemi hem de herhangi bir olası Salmonella izolatı için bir doğrulama yöntemi olarak FDA'nın Bakteriyolojik Analitik El Kitabına dahil edilmiştir. Yöntem hızlı, güvenilir ve sağlamdır. PCR ile karşılaştırıldığında, ana avantajları arasında hızlı test, basit enstrümantasyon, düşük yanlış negatif oranı ve esnek iş akışı yer alır.
Salmonella gibi patojenlerin hızlı bir şekilde taranması, potansiyel olarak kontamine olmuş bir ürünün hızlı bir şekilde tespit edilmesinde önemli bir rol oynar ve insanlarda ve hayvanlarda hastalıkları veya salgınları önleyebilir. LAMP testi için DNA şablonları hazırlayarak başlayın. DNA şablonları yapmak için kullanılan iki tür örnek vardır.
Hayvansal gıda numunelerinden şablonlar hazırlamak için, 25 gram gıda numunesini steril bir filtre torbasına aseptik olarak tartın. Torbaya 225 mililitre steril tamponlu Pepton suyu ekleyin ve 24 saat boyunca 35 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, torbanın filtrelenmiş tarafından bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Tüpü bir dakika boyunca 900 kez G'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi iki dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atmak için, peleti 100 mikrolitre numune hazırlama reaktifi içinde yeniden süspanse edin ve kuru bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca 100 santigrat derecede ısıtın. Ardından numuneyi oda sıcaklığına soğutun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu LAMP testi için ikinci tip numune, doğrudan varsayımsal salmonella kültürlerinden gelir.
DNA şablonlarını hazırlamak için, gece boyunca 500 mikrolitre salmonella kültürünü bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 100 santigrat derece ısı bloğunda 10 dakika ısıtın. Ardından numuneyi oda sıcaklığına soğutun ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için, LAMP Master Mix'i hazırlamak ve DNA şablonlarını eklemek için kullanılan alanları fiziksel olarak ayırın.
Çalışma yüzeylerini izopropanol ve bir DNA ve DNA'nın parçalayıcı solüsyonu ile temizleyin. Ardından pipetleri ve tüp şeridi tutucularını temizleyin. İzotermal Master Mix, 10X Primer Mix, moleküler dereceli su, pozitif kontrol DNA'sı ve DNA şablonlarını oda sıcaklığında çözün.
LAMP cihazını açın ve ilgili s'yi girin.ample bilgi. LAMP Master Mix'i el yazması talimatlara göre hazırlayın, kısaca vorteksleyin ve santrifüjleyin ve 23 mikrolitre Master Mix'i bir tüp şeridinin her bir oyuğuna dağıtın. Tüm DNA şablonlarını girdaplayın ve kısaca santrifüjleyin.
Ardından, uygun kuyucuğa iki mikrolitre DNA şablonu ekleyin ve kuyuyu sıkıca kapatın. Tüp şeridini tutucudan çıkarın ve tüm reaktiflerin tüpün dibinde biriktiğinden emin olmak için hafifçe vurun. Tüp şeridini LAMP cihazına yükleyin ve LAMP çalışmasını başlatın.
LAMP reaksiyonu devam ederken, LAMP çalışması sırasında çeşitli parametrelerin dinamik değişikliklerini görmek için Sıcaklık, Amplifikasyon ve Tavlama sekmelerine dokunun. LAMP sonuçları, LAMP gösterge panelinde gerçek zamanlı olarak veya LAMP yazılımı kullanılarak görüntülenebilir. Gösterge tablosundaki sonuçları yorumlamak için, İLGİLİ LAMP'yi açın.
Her çalıştırmayla ilişkili beş sekmeyi gözlemleyin. Profil ve Sıcaklık sekmeleri, LAMP reaksiyonu ilerledikçe numune kuyucuklarındaki programlanmış ve gerçek sıcaklıkları gösterir. Amplifikasyon ve Tavlama sekmeleri, sırasıyla Amplifikasyon ve Tavlama aşamaları sırasında floresan okumalarını ve floresanstaki değişiklikleri gösterir.
Sonuçlar sekmesi, el yazmalarının talimatlarına göre yorumlanabilen LAMP sonuçlarının tablo görünümünü gösterir. LAMP sonuçlarını görüntülemenin ikinci yolu LAMP yazılımını kullanmaktır. Sonuçları yazılımla yorumlamak için, sol paneldeki Bilgisayar simgesine tıklayın ve ilgilenilen LAMP'yi yüklemek için dosya konumuna gidin.
Her çalıştırmayla ilişkili yedi sekmeyi gözlemleyin. Profil ve Sıcaklık sekmeleri, LAMP reaksiyonu ilerledikçe numune kuyucuklarındaki programlanmış ve gerçek sıcaklıkları gösterir. Amplifikasyon ve Amplifikasyon Hızı sekmeleri, Amplifikasyon aşaması sırasında floresan okumalarını ve floresanstaki değişiklikleri gösterir.
Tavlama ve Tavlama Türevi sekmeleri, Tavlama aşaması sırasında floresan okumalarını ve floresanstaki değişiklikleri gösterir. Sonuçlar sekmesi, LAMP sonuçlarının tablo şeklinde bir görünümünü gösterir. Grafik Adı, Kuyu Numarası, Kuyu Adı ve Tepe Değeri başlıklı dört sütun vardır.
Sekiz örneğin tümünün Amp Süresi ve Tavlama Türevleri gösterilir. Sonuçlar, el yazmalarının talimatlarına göre yorumlanabilir. LAMP gösterge paneli ve LAMP yazılımı, testin sonuçlarını görüntülemek için kullanılabilir.
Bu LAMP çalışmasında, S1'den S6'ya kadar olan numuneler, reaksiyon başına 1.1 milyon ila 11 koloni oluşturan birim arasında değişen on kat seri Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741 seri dilüsyonlarıdır. Pozitif kontrol veya PC, reaksiyon başına 17.000 koloni oluşturan birimde Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2'dir ve şablon kontrolü veya NTC, moleküler dereceli sudur. NTC kuyusu, LAMP gösterge panelinde boş bir Tmax ve yaklaşık 81 santigrat derece Aneal sıcaklığa ve LAMP yazılımında boş bir Tmax ve boş bir Tavlama sıcaklığına sahiptir.
Pozitif kontrol kuyusu, her iki platformda da yedi dakika 45 saniyelik bir Tmax ve yaklaşık 90 santigrat derece Tavlama sıcaklığına sahiptir. S1 ila S6 arasındaki numuneler, altı dakika ile 30 saniye ve 12 dakika ile 15 saniye arasında Tmax'a ve yaklaşık 90 santigrat derece Tavlama sıcaklığına sahiptir ve bunların tümü pozitif bir algılamayı gösterir. LAMP çok etkilidir ve büyük miktarda DNA üretir.
Bu nedenle, çapraz kontaminasyonu önlemek için en iyi laboratuvar uygulamalarının kullanılması çok önemlidir. DNA şablonlarınızı oluştururken benzer uygulamaları kullanın, çünkü kontamine hayvan gıdalarından elde edilen zenginleştirmeler yüksek düzeyde salmonella içerebilir. LAMP ile pozitif çıkan hayvan yemi numunesi taraması, FDA'nın Bakteriyolojik Analitik El Kitabındaki prosedürleri takiben kültür izolasyonu ile doğrulanmalıdır.
Negatif numuneler bu şekilde rapor edilebilir. Bu LAMP yönteminin FDA'nın Bakteriyolojik Analitik El Kitabına dahil edilmesi, bu hızlı, sağlam ve kullanıcı dostu teknolojinin gıda güvenliği testlerinde daha geniş bir şekilde uygulanmasının önünü açmaktadır.
Genel Bakış
Bu çalışma, hayvansal gıdalardaki Salmonella'nın hızlı tespiti için doğrulanmış bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) protokolü sunmaktadır. Yöntem, geleneksel PCR'ye göre daha hızlı sonuçlar ve daha düşük yanlış negatif oranları sunarak potansiyel kontaminasyonu belirlemek için güvenilir bir araç haline gelmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Patojen tespiti
- Nükleik asit amplifikasyonu
- Gıda güvenliği
Arka Plan
- Gıda ürünlerinde hızlı patojen tespitinin önemi
- Salmonella için güvenilir tarama yöntemlerine duyulan ihtiyaç
- Geleneksel PCR yöntemlerinin sınırlamaları
Kullanılan Yöntemler
- Döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP)
- Salmonella spp.
- Özel DNA hazırlama protokollerinin kullanımı
Ana Sonuçlar
- LAMP'in Salmonella tespiti için etkinliğini göstermiştir
- Yöntemin düşük yanlış negatif oranını vurgulamıştır
- Çoklu laboratuvar karşılaştırması yoluyla doğrulanmıştır
Sonuçlar
- Çalışma, LAMP'i gıda ürünlerinde Salmonella'yı taramakta ve onaylamakta kullanılabilir bir yöntem olarak belirlemektedir.
- Gıda güvenliğini artırmak ve sağlık risklerini önlemek için hızlı testlerin önemini vurgulamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
