Name: Caenorhabditis eleganstan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'tan yüksek verimli protein özü hazırlama ve eş-immün presipitasyon yöntemini. Bu teknik, protein etkileşimlerini çeşitli genetik arka planlarda incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Kansas INBRE, Li ve Zinovyeva'ya P20GM103418 ve Zinovyeva'ya R35GM124828 tarafından desteklendi. Min Han'a anti-AIN-1 antikorlarını cömertçe paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma boyunca kullanılan suşların bir kısmı NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlanmıştır.

1. Solucan numunesi toplama
<ol><li>Ngm katı plakalarında gerekli sıcaklıkta tohum karışık aşaması veya senkronizeedilmiş 13 solucan ve solucanların istenen aşamaya kadar büyümesini sağlar. Temel C. elegans büyüme ve bakım için, stiernagle ve ark. ve Porta-de-la-Riva ve ark.14,13bakınız.</li>
	<li>Solucan plakalarını M9 tamponu ile yıkayarak solucanları 15 mL konik santrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Solucanları oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme yaparak peletlayın ve süpernatantı atın. NOT: Ekstrakt hazırlama için solucan pelet boyutu 100 μL ile 500 μL arasındadır. Aşağı akış immün önkupitasyon deneyleri için 300 μL'lik bir solucan peleti önerilir ve tipik olarak toplam proteinin ~4,5 mg'ını, 500 μL'lik bir pelet ise ~7,5 mg toplam protein verir.</li>
	<li>M9 tamponu ile ek 3-5 yıkama gerçekleştirin (bkz. Tablo 1) veya süpernatant artık bulutlu olana kadar.</li>
	<li>DDH2O ile son bir yıkama gerçekleştirin.</li>
	<li>Gevşek solucan peletini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne taşıyın ve 2 dakika boyunca RT'de 400 x g'da aşağı doğru döndürün. Paketlenmiş bir solucan peleli elde etmek için kalan süpernatant atın ve hazırlığı çıkarmaya devam edin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Solucan topakları hemen sıvı nitrojende dondurulabilir ve -80 °C'de veya sıvı nitrojende saklanabilir. Solucan peletlerinin sadece bir kez çözülebileceğini ve yeniden çözüleemeyeceğini lütfen unutmayın.</li>
</ol>2. Solucan peletinin hazırlanması
NOT: Ekstrakt hazırlığı buz üzerinde veya 4 °C'de yapılmalıdır.
<ol><li>Donmuşsa, solucan peletlerini buzda çözün. NOT: Numune toplama sırasında istenen 300 μL'lik paketlenmiş solucan pelet boyutu elde edilemezse, daha fazla ekstraksiyon için yeterli malzeme bulunana kadar birden fazla küçük pelet birleştirilebilir.</li>
	<li>Eşit hacimde buz gibi 2x lizis tamponu ekleyin (60 mM HEPES, pH = 7.4, 100 mM potasyum klorür, %0.1 Triton X, 4 mM magnezyum klorür, %10 gliserol, RNase inhibitörü, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörleri ile 2 mM DTT; bkz. Tüpün altındaki karışımı toplamak için tüpleri aşağı çevirin.</li>
	<li>Karışımı metal boncuk içeren 1,5 mL RNase içermeyen bir tüpe taşıyın (bkz. Malzeme Tablosu)ve numuneyi boncuk değirmeni homojenizatörüne koyun (bkz. Malzeme Tablosu)4 °C'de. Tüp kapaklarının sıkılsın ve numuneler homojenizatör içinde dengelendirilsin.</li>
	<li>Numuneyi 4 dakika boyunca en yüksek hızda (ayar 12) homojenize edin.</li>
	<li>Numuneyi boncuklardan çıkarın ve yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Alternatif olarak, boncukları numuneden çıkarmak için homojenizatör ile birlikte verilen bir mıknatıs kullanılabilir.</li>
	<li>Protein ekstresini netleştirmek için özü 4 °C'de 20 dakika boyunca 19.000 x g'da döndürün.</li>
	<li>Üst kısmı buz üzerinde taze bir 1,5 mL tüpe aktarın, bu arada numunenin üstünde oluşan beyaz, bulutlu çökeltmenin taşınmasından kaçının. Süpernatant artık netleştirilmiş özüdür. NOT: Toplam protein konsantrasyonu belirlemek için netleştirilmiş ekstrakt 10 μL tasarruf edin.</li>
	<li>Aşağıdaki deneyler için özü hemen kullanın veya özü sıvı nitrojende flaşla dondurun ve -80 °C'de saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ekstraktlar ultra düşük sıcaklıkta saklanabilir (-80 °C dondurucu veya sıvı azot ~6 ay). Dondurulmuş özler bir kez çözülebilir ve yeniden dondurulamaz.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre deterjanlarla uyumlu bir protein konsantrasyonu test kiti kullanarak özün toplam protein konsantrasyonunun belirlenmesi (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
</ol>3. İmmün önseçme
NOT: Ekstrakt hazırlama için tüm immün önseçim adımları buz üzerinde veya 4 °C'de yapılmalıdır. Her immün önksepitasyon için 2 mg toplam protein kullanılması önerilir. Bununla birlikte, 0.8-1 mg toplam protein ile başarılı immün prempripitasyonlar gerçeklenmiştir. Her zaman taze veya taze çözülmüş protein özleri kullanın. Aşağıdaki protokol, 2 mg toplam proteinden veya tek bir immün önksepitasyon deneyinden immün önksepitasyon yapmak için özetlenmiştir. Boncuk ve antikor miktarı birden fazla örnek için veya farklı miktarda protein özü kullanılırsa arttırılabilir veya azaltılabilir.
<ol><li>Protein özünü buza yerleştirin veya çözün. Numune buz gibi 1x lizis tamponu ile 10 mg/mL veya 5 mg/mL'ye seyreltilebilir (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Manyetik boncukları ters çevirme ile yeniden diriltin ve %50 boncuk süspansiyonunun 150 μL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Boncukları 1 dakika boyunca veya çözelti netleşene kadar manyetik bir standa karşı buz üzerinde mıknatıslandırın. Üstnatant atın.</li>
	<li>Tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncuk bulamacının 2 hacmini (yani 300 μL) kullanarak boncukları 1x lizis tamponunda yıkayın. Toplam üç yıkama için yıkamayı 2x tekrarlayın.</li>
	<li>Boncukları 150 μL buz gibi lizis tamponunda yeniden depola.</li>
	<li>Boncuk bulamacının 75 μL'sini 2 mg protein özüne aktarın ve nazik ajitasyonla 1 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Kalan boncuk süspansiyonu daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde sakla. NOT: Bu adım, immün önseçme adımı sırasında boncuklara spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için gerçekleştirilir.</li>
	<li>Numuneli tüpü 1 dakika boyunca veya boncuklar tamamen mıknatıslanana ve numune temizlenene kadar buz üzerindeki manyetik standa yerleştirin. Süpernatant yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın; boncukları rahatsız etmeyin. Bu önceden tanımlanmış protein lysate. Batı leke analizi için numunenin %10'unu sakla.</li>
	<li>Önceden tanımlanmış lysate 20 μg benzeşim saflaştırılmış antikor ekleyin ve nazik ajitasyon ile 1 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: İmmün prempripitasyon için kullanılan antikor miktarı antikor ve proteine özgüdür ve hedef proteinin etkili immün önksezisini sağlamak için ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	<li>Önceden yıkanmış boncuk süspansiyonunun kalan 75 μL'lik kısmını (adım 3,5) antikor/lisat karışımına ekleyin ve hafif ajitasyonla 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpü manyetik standa 1 dakika boyunca veya boncuklar tamamen mıknatıslanana ve numune temizlenene kadar buz üzerinde yerleştirin. Batı blot analizi için süpernatantı kaydedin (isteğe bağlı).</li>
	<li>İmmünprecipitate 3x içeren boncukları 450 μL yıkama tamponunda (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM potasyum klorür, %0,1 Triton X, 2 mM magnezyum klorür, %10 gliserol, 1 mM DTT; bkz. Tablo 1)buz üzerinde yıkayın. NOT: Daha sıkı yıkama koşulları tercih edilirse ek yıkamalar yapılabilir.</li>
	<li>Boncuk peletini 20 μL 2x SDS/BME protein jeli yükleme tamponuna (bkz. Malzeme Tablosu)ve denatüreyi bir SDS-PAGE jeline yüklenmeden önce 95 °C'de 5 dakika kaynatarak yeniden kullanın. Alternatif olarak, denatüre numuneler birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. NOT: İstenirse, boncuk immünödeksilatın bir kısmı aşağı akış RNA izolasyonu için kaydedilebilir.</li>
</ol>4. IP örneklerinin Batı lekesi tespiti
<ol><li>IP örneklerini SDS-PAGE jeline yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu). IP tüplerini numunenin aspirasyonundan önce 1 dakika boyunca manyetik standa yerleştirerek boncukları aktarmaktan kaçının.</li>
	<li>Batı şişkinliğini15,16 ve antikor boyama16'yı aşağıdaki değişikliklerle gerçekleştirin: ALG-1 antikorunu% 5 yağsız kuru sütte (NFDM)17 1:500 seyreltin; HRPK-1 antikor 2 1:1.000%5 NFDM'de seyreltin; ve AIN-1 antikor 18 1:10.000%NFDM'de seyreltin. İkincil antikorlar (bkz. Malzeme Tablosu)üreticinin talimatlarına göre kullanılmıştır.</li>
	<li>Hrp bazlı kemimuminesans ile bantları tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
</ol>

<ol><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li>
<li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRPK-1%2C+a+conserved+KH-domain+protein%2C+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067(2019).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li>
<li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li>
<li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li>
<li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li>
<li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer%3A+an+old+tool+for+a+new+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li>
<li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans%3A+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117(2018).</li>
<li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li>
<li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li>
<li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li>
<li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2%E2%80%99-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759(2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286(2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins%2C+miRNAs%2C+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350(2018).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

C. elegans hücre, moleküler ve gelişim biyolojislerindeki temel soruları incelemek için mükemmel bir modeldir19. Genetik bir model sistemi olarak gücüne ek olarak, C. elegans protein immüno-immün önseçim ve eş-immünoselipitasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere biyokimyasal yaklaşımlara açıktır. İmmün prempripitasyon deneyleri yaparken olası bir engel, ilgi proteinlerine özgü antikorların eksikliğidir. Antikor yoksa özel poliklonal veya monoklonal antikorlar üretilebilir. Bununla birlikte, genom düzenleme teknolojisindeki son yenilikler, araştırmacıların mutasyonları hızla tanıtmasına veya endojen C. elegans genlerini etiketlemesine izinvermiştir 20,21, genler ve kodlanmış proteinler arasındaki genetik, fonksiyonel ve fiziksel etkileşimleri çözen çalışmaları kolaylaştırmaktadır. Özellikle, CRISPR/Cas9 aracılı sonojen loci'deki C. elegans genlerinin etiketlenmesi, immün önseçim deneylerinin antikor kullanılabilirliği üzerindeki bağımlılığını azaltarak, eş-immün özürlülüğü deneylerini çok daha uygulanabilir hale getirdi. C. elegans genleri, GFP veya mCherry gibi floresan etiketlerden FLAG ve HA gibi küçük etiketlere kadar çeşitli etiketlerle etiketlenebilir. Bu etiketleri tanıyan antikorlar ticari olarak kolayca kullanılabilir ve immün önkupseleme yaklaşımları yoluyla protein-protein etkileşimlerinin çalışmalarını kolaylaştırır.
Şekil 1'deözetlenen sunulan protokol, az sayıda numune için gerçekleştirilebilir veya ölçeklendirilebilir ve aynı anda 24 numune hazırlığına izin verir. İmmün önseçme yoluyla protein-protein etkileşimlerinin ilk nitelemeleri tipik olarak normal büyüme koşulları altında vahşi tip arka planlarda yapılırken, takip çalışmaları genellikle protein-protein etkileşimlerinin çeşitli genetik arka planlarda veya farklı büyüme koşullarında test edilmesini gerektirir. Aynı anda birden fazla ekstrakt hazırlama yeteneği zaman kazandırır ve daha da önemlisi, farklı numuneler arasında ekstrakt hazırlama tutarlılığı sağlar. Negatif bir kontrol her zaman gereklidir, ideal kontrol, immün önkoşüle edilmiş ilgi proteini için gen kodlamasında boş bir mutasyondur (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4 örnek olarak).
Bu ekstrakt protokolü, C. elegans örneklerinden hızlı protein özü hazırlanmasına izin verir ve zirkonyum boncuk bazlı homojenizasyon8ile karşılaştırılabilir. Genel olarak boncuk homojenizasyonu, çeşitli boncuk değirmeni homojenizatörleri veya benzeri ekipmanlar kullanılarak birden fazla eşzamanlı numune preparatlarına kadar ölçeklendirilebilir. Bununla birlikte, bazı daha ekonomik boncuk değirmeni homojenizatörleri aynı anda işlenebilen numune sayısını azaltabilir. Alternatif olarak, sunulan ekstrakt protokolü, ekonomik bir alternatifi temsil eden dounce bazlı ekstrakt hazırlığı ile uyumludur. Farklı boncuk değirmeni homojenizatörleri test edilmede de, C. elegans örneklerinin tamamen bozulması sağlandığınız sürece, çoğu bu protein özü protokolü ile uyumlu olabilir.
Sunulduğu gibi, bu ekstrakt hazırlama protokolü, protein immünoselipitasyon2 ve microRNA aşağı çekme12 dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış deneyi ile uyumludur ve hem protein hem de RNA bileşenlerinin aşağı akış toplanmasına izin verir. Ayrıca hem nükleer hem de sitoplazmik proteinleri verimli bir şekilde çıkarır (Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4). Benzer şekilde, sunulan immünoprecipitasyon protokolü protein ilişkili immünödepitaitlerden RNA izolasyonuna izin eder. İmmün önkekseleme protokolü başlangıçta ALG-1 protein etkileşimcilerini tanımlamak için geliştirilmiş olsa da, yöntem ilgi çekici proteinler arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir. Aslında, kullanılan immün prempripipitasyon koşulları ALG-1 (Şekil 3) ve HRPK-1 (Şekil 4)immünoprecipitasyon için eşit derecede iyi çalıştı. Bu protokol, RNA bağlayıcı proteinlerin immünpurifikasyonu için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Bununla birlikte, diğer ilgi proteinleri için tampon bileşiminde bazı değişikliklerin gerekli olabileceği belirtilmelidir. Değişiklikler, ilgi çekici proteinin fiziksel ve biyokimyasal özelliklerine bağlı olabilir ve duruma göre uygulanmalıdır.
Hedef protein (burada, ALG-1 veya HRPK-1) immün premünipit hale geldikten sonra, Batı şişkinliği belirli protein etkileşimcileri için ko-immünoprecipitate'i test etmek için kullanılabilir.
Alternatif olarak, kopurified immünprecipitate tüm putatif etkileşim proteinlerini tanımlamak için kütle spektrometresi analizine tabi tutulabilir. Doğrulanmış eş-immün özürlü etkileşimler daha sonra belirli etkileşimin potansiyel düzenlemesini belirlemek için çeşitli genetik geçmişlerde veya koşullarda incelenebilir. Örneğin, HRPK-1'in ALG-1/AIN-1 miRISC derlemesinde rol oynayıp oynamadığını belirlemek için, ALG-1-AIN-1 coprecipitation hem vahşi tip arka planda hem de HRPK-1 yokluğunda değerlendirildi (Şekil 3). hrpk-1'in ALG-1/AIN-1etkileşimi 2 (Şekil 3)için dağıtılabilir olduğu bulunmuştur. Ek olarak, CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi, ilgi çekici proteinlerde tek nokta veya alan adı silme mutasyonları oluşturmak için kullanılabilir. Üretilen mutantların protein etkileşimcileriyle işbirliği yapma yeteneğini yeniden test etmek, hangi etki alanlarının veya kalıntıların fiziksel etkileşime aracılık ettiğini ortaya açabilir. Bu tür gelecekteki çalışmalar, protein fonksiyonu ve regülasyon mekanizması hakkında paha biçilmez bilgiler verebilir. Bu yaklaşımlar, C. elegans genetiğinin gücü ile birlikte, hayvan gelişimini ve hücresel işlevi yöneten temel moleküler süreçler hakkında önemli içgörüler sağlayabilir.

İlgi çekici bir proteinin makromoleküler etkileşimlerini tanımlamak, işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmenin anahtarı olabilir. İmmün prempripitasyon ve eş-immünovipitasyon deneyleri, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar1 yoluyla bir proteinin tüm etkileşimini tanımlamak veya bir proteinin hipotezlenmiş bir interactor ile işbirliği yapma yeteneğini özellikle test etmek için kullanılabilir. C. elegans'da, gen ekspresyonunu düzenlemek için mikroRNA'larla yakından çalışan proteinler de dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin aktivitesi hakkında daha fazla bilgi edinmek için her iki yöntem de başarıyla 2,3,4. Ortak immün premünipitasyon deneyleri, protein-protein etkileşimlerini kendi doğal hücresel ortamlarında test etme avantajına sahiptir, ancak ekstrakt hazırlama zor ve zaman alıcı olabilir. Numunenin verimli lizisi gereklidir, ancak protein-protein etkileşimlerinin bozulmasını en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. C. elegans toplam protein özlerini başarıyla hazırlamak için5,sonication6, Balch homojenizasyon7ve zirkonya boncukları-homojenizasyon8,9 gibi yöntemler kullanılmıştır. Bu yöntemler, zirkonya boncuk homojenizasyonu dışında, aynı anda işlenebilen numune sayısı açısından sınırlamalara sahiptir. Sunulan, C. elegans örneklerinden yüksek verimli, hızlı protein özü hazırlanmasına izin vermek için kolayca ölçeklendirilebilen alternatif biryöntemdir. Özellikle, yöntem aynı anda 24 numune hazırlayabilir ve ekstrakt hazırlığı için gereken süreyi büyük ölçüde azaltabilir. Bunun aksine, örneğin, douncing genellikle aynı anda yalnızca bir örnek hazırlamaya izin verir. Bu ekstrakt yöntemi, C. elegans'ınherhangi bir gelişim aşamasından özler hazırlamak için kullanılabilir.
Açıklanan, başarılı protein çekme ve ortak immün önseçimli proteinin tespitini doğrulamak için hayvan örneği toplama, ekstrakt hazırlama, immün önseçimleme ve Batı şişkinlik verilerinin sunumu için adım adım bir prosedürdür. Protokolün etkinliğini göstermek için, 1) microRNA Argonaute ALG-1 ve GW182 homolog olan AIN-1 arasında iki ortak immün önseçim deneyi yapıldı; ve 2) ALG-1 ve HRPK-1, yeni tanımlanmış bir ALG-1 interactor2. ALG-1 ve AIN-1, mikroRNA kaynaklı susturma kompleksini (miRISC) oluşturan temel proteinlerdir ve bu iki protein arasındaki etkileşim iyi belirlenmiştir10,11. Ekstrakt hazırlama protokolü ALG-1-AIN-1 eş-immünoselipitasyon deneyinde etkili oldu. Bu protokol ayrıca ALG-1 ve yeni tanımlanan etkileşimcisi HRPK-12arasındaki etkileşimi başarıyla doğruladı.
Özetle, makale, proteinler arasındaki yeni veya hipotez etkileşimleri tanımlamak veya doğrulamak için kullanılabilecek bir eş-immün özürlülük protokolü ile birlikte 24 örneği aynı anda işlemek için ölçeklendirilebilen bir C. elegans özü hazırlama protokolünü tanımlamaktadır. Ekstrakt hazırlama protokolü, protein immün önkeksasyonu2 ve mikroRNA çekmeleri12dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış deneyi ile uyumludur. Ayrıca, immün önksezi protokolü, çeşitli genetik geçmişlerde iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı ifade edilmiş C. elegans proteinleri arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>15 mL tüp</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>ADIM 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Numune Tamponu</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>ADIM 3.11</td></tr><tr><td>4&ndash; %20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoklonal antikor</td><td>özel olarak oluşturulmuş</td><td>n/a</td><td>ADIM 4.2, bkz. ref. Zhang ve ark. 2007</td></tr><tr>PRF & tarafından özel olarak üretilen<td>anti-ALG-1 monoklonal antikor</td><td>; L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoklonal antikor</td>, <td>PRF & tarafından özel olarak üretilmiştir. L</td><td>n/a</td><td>ADIM 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homojenizatör</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>ADIM 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>İmmünopresipitasyon için Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>ADIM 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıslı</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>ADIM 3.2</td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>GFP antikoru (FL)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-8334</td><td>Şekil 2</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan İkincil Antikoru, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>ADIM 4.2</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan IgG (H+L) İkincil Antikoru, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>ADIM 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Kemilüminesan Yüzey, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>ADIM 4.3</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat Susuz</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>ADIM 1.6</td></tr><tr><td>N2 vahşi tip</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donanma RINO RNA Lizis Kiti 50 paket (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>ADIM 2.3</td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitör kokteyli 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitör kokteyli 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Test Kiti I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>ADIM 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik Susuz</td><td>Termo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td> <td>istek</td><td></td><td></td>üzerine temin edilebilir</tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td> <td>istek</td><td></td><td></td>üzerine temin edilebilir</tr><tr><td>VT3841 alg-1 (tm492)</td> <td>istek</td><td></td><td></td> üzerine temin edilebilir</tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans'tan protein Özü hazırlama ve eş-immün premobpriktiasyon

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Protein-protein etkileşimlerini incelemek için sıklıkla ko-immünoselipitasyon yöntemleri kullanılmaktadır. Hipotezlenmiş protein-protein etkileşimlerinin onaylanması veya yenilerinin tanımlanması, ilgi çekici bir proteinin işlevi hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Ekstrakt hazırlama için geleneksel yöntemlerden bazıları sıklıkla emek yoğun ve zaman alıcı teknikler gerektirir. Burada, boncuk değirmeni homojenizatörü ve metal boncuklar kullanılarak değiştirilmiş bir ekstrakt hazırlama protokolü, geleneksel protein hazırlama yöntemlerine hızlı bir alternatif olarak tanımlanmaktadır. Bu ekstrakt hazırlama yöntemi aşağı akış eş-immüno-immün önksepitasyon çalışmaları ile uyumludur. Örnek olarak, yöntem C. elegans mikroRNA Argonaute ALG-1 ve bilinen iki ALG-1 interactor'u başarıyla eş-immünprecipitate etmek için kullanıldı: AIN-1 ve HRPK-1. Bu protokol, hayvan örneği toplama, ekstrakt hazırlama, ekstrakt açıklama ve protein immün önseçiminin açıklamalarını içerir. Açıklanan protokol, çeşitli genetik geçmişlerde iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı ifade edilmiş C. elegans proteinleri arasındaki etkileşimleri test etmek için uyarlanabilir.

Bu protokol (Şekil 1'deşematize edilmiş) birkaç proteinin aşağı akış immün önkupitasyonu için C. elegans toplam protein özlerini (Şekil 2) elde etmek için başarıyla kullanılmıştır2 (Şekil 3 ve Şekil 4). Sunulan boncuk değirmeni homojenizatör protokolü, toplam protein ekstraksiyonunda dounce bazlı yöntemlerle (Şekil 2) ve verimli bir şekilde çıkarılan nükleer (COL-19::GFP(NLS) (Şekil 2) ve sitoplazmik proteinlerle karşılaştırılabilirdi (Şekil 3 ve Şekil 4). Çeşitli boyutlarda birden fazla örnek aynı anda çıkarılmıştır(Şekil 2). Argonaute proteinleri GW182 protein ailesinin üyeleriyle etkileşime girerek hedef haberci RNA'lara bağlanan ve ifadelerini bastıran miRISC'leri oluşturur10. Şekil 3, öncekiraporlar11,17ile tutarlı olarak çekirdek miRISC bileşenleri ALG-1 ve AIN-1'in başarılı bir şekilde eş-immün önseçimini göstermektedir. Daha yakın zamanda, mikroRNA biyogenez ve aktivitenin yardımcı faktörler tarafından nasıl düzenlenebileceği hakkında daha fazla bilgi edinmek için ArgonauteALG-1 3'ün ek protein etkileşimcilerini belirlemeye yönelik çalışmalar yapılmıştır. RNA bağlayıcı protein HRPK-1, ALG-1 immünoprecipitates3'tetanımlanmıştır. Bu etkileşim yakın zamanda karşılıklı bir HRPK-1 immün önksepitasyon deneyi2'de doğrulandı. Sunulan ekstrakt ve immün premünipitasyon protokolleri HRPK-1'e özgü ko-immünoselipitaitlerde ALG-1'i başarıyla geri kazanmıştır (Şekil 4). Buna ek olarak, ALG-1-AIN-1 etkileşimi çeşitli genetik arka planlarda test edildi ve HRPK-1'in ALG-1/AIN-1 miRISCderlemesi 2 (Şekil 3)için gereksiz olduğu gösterildi. Ek rakamlar, tam membran problanmış olarak göstermek için sağlanmıştır(Ek Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Şekil 1: C. elegans özü hazırlama ve immün önkupseleme için iş akışı şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Şekil 2: Nükleer lokalize GFP, COL-19::GFP (NLS), 250 μL ve 100 μL solucan peletlerinden dounce hazırlanmış ve homojenize numunelerdeki seviyelerin Batı blot karşılaştırması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Şekil 3: GW182 homolog AIN-1 ALG-1 ile birlikte immünoselipitatlar. ALG-1 immünöteritlerinde ALG-1 ve AIN-1 proteinleri için batı şişkinliği. ALG-1/AIN-1 ko-immünopipitasyonu hrpk-1'in yokluğundan etkilenmedi. Giriş = IP'nin 'unu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Şekil 4: ALG-1 HRPK-1 ile eş-immünoprecipitates. HRPK-1'de HRPK-1 ve ALG-1 için Batı blottingi gösterilmiştir. Giriş = IP'nin 'unu. * antikor ağır zincirini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 arabelleği (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>1 L'ye kadar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lizis tamponu (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td> TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 gliserol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>5 mL'ye kadar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taze ekleyin:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörü</td>
			<td>1 tablet</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfataz inhibitörü kokteyl 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfataz inhibitörü kokteyl 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Lizis arabelleği</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lizis tamponu eşit hacimde ddH20 ile seyreltin.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Yıkama tamponu 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td> TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 gliserol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>10 mL'ye kadar</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (taze ekleyin)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tarifler
Ek Şekil 1. Şekil 2-4 oluşturmak için kullanılan tam problu Batı leke zarları gösterilmiştir. (A) Şekil 2 için problanmış membran. Membran, GFP ve Tubulin için eşzamanlı problama için kesildiğini ve genel leke boyutunu azalttığını unutmayın. (B) Şekil 3 için problanmış membran. (C) Şekil 3 için problanmış membran. *antikor ağır zincirini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

Bu protokol, başarılı bir protein çekilmesinin doğrulanması ve ilgilenilen birlikte immünopresipite edilmiş proteinlerin tespiti için numune toplama, ekstrakt hazırlama ve immünopresipitasyon için adım adım bir prosedür sağlar. Protein ekstraktı hazırlığı 24 numuneye kadar gerçekleştirilebilir ve immünopresipitasyon ve RNA aşağı çekme deneyleri dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış uygulamasıyla uyumludur. Bu yöntem, çeşitli genetik arka planlarda iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı eksprese edilmiş C.elegans proteinleri arasındaki etkileşimlerin test edilmesini kolaylaştırmak için uyarlanabilir.Bu protokolün görsel gösterimi, araştırmacıları protein özü hazırlama ve immünopresipitasyon konusunda rahat ettirmeyi ve umarım tekniklere yeni olanları araştırmalarında kullanmaya teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Bir solucan örneği toplamak için, önce tohum karışık aşaması veya senkronize solucanları gerekli sıcaklıkta katı nematod büyüme ortamı plakaları üzerine koyun ve solucanların istenen aşamaya kadar büyümesine izin verin. Kuluçka işleminin sonunda, solucanları 15 mililitrelik konik bir tüpe yıkamak için M9 tamponu kullanın ve solucanları santrifüjleme ile peletleyin.Santrifüjlemenin sonunda, süpernatanı çıkarın ve solucanları yıkama başına taze M9 tamponunda üç ila beş kez daha yıkayın. Süpernatan artık bulanık olmadığında, çift damıtılmış suyla son bir yıkama yapın ve gevşek solucan peletini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Solucanları ek bir santrifüjleme ile peletleyin ve paketlenmiş bir solucan peleti elde etmek için kalan süpernatanı atın.Toplanan solucan peletinden ekstrakt hazırlamak için, önerilen 300 mikrolitre hacimli pelete eşit hacimde buz gibi soğuk 2X lizis tamponu ekleyin ve elde edilen süspansiyonu kuvvetlice karıştırın. Tüpün dibindeki karışımı toplamak için numuneyi döndürün ve tüp içeriğini metal boncuklar içeren 1,5 mililitrelik RNAse içermeyen bir tüpe aktarın. Tüpü sıkıca kapattıktan sonra, numunenin homojenizatör içinde dengelendiğine dikkat ederek numuneyi dört santigrat derecede bir boncuk değirmeni homojenizatörüne yerleştirin.Numuneyi boncuksuz yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce numuneyi dört dakika boyunca en yüksek hızda homojenize edin. Protein ekstraktını berraklaştırmak için numuneyi aşağı doğru döndürün ve süpernatanı, numunenin üst kısmındaki beyaz bulanık çökeltiyi aktarmadan buz üzerinde 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Standart protokollere göre toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için 10 mikrolitre arıtılmış ekstraktı bir kenara koyun ve numuneyi hemen buz üzerinde mililitre buz soğuk 1X lizis tamponu başına beş veya 10 miligram proteine seyreltin.İlgilenilen proteinin immünopresipitasyonu için, önce manyetik boncukları ters çevirerek yeniden süspanse edin ve 50X boncuk süspansiyonunun 150 mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Buz üzerindeki boncukları manyetik bir standa karşı yaklaşık bir dakika boyunca manyetize edin. Çözelti berrak olduğunda, süpernatanı atın.Tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncukları üç adet 300 mikrolitre hacimli 1X lizis tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncukları 150 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve 75 mikrolitre boncuk bulamacını iki miligram protein özü örneğine aktarın. Hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bir saatlik inkübasyondan sonra, numune tüpünü yaklaşık bir dakika boyunca buz üzerindeki mıknatısa yerleştirin.Boncuklar tamamen manyetize olduğunda ve numune berrak olduğunda, boncukları rahatsız etmeden süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Western blot analizi için numunenin% 10'unu bir kenara koyun ve hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bir saatlik bir inkübasyon için önceden temizlenmiş lizata 20 mikrogram afinite saflaştırılmış antikor ekleyin. İnkübasyonun sonunda, kalan 75 mikrolitre önceden yıkanmış boncuk süspansiyonunu, hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bir saatlik ek bir inkübasyon için antikor lizat karışımına ekleyin.İnkübasyonun sonunda, numuneyi yaklaşık bir dakika boyunca mıknatısın üzerine geri yerleştirin. Boncuklar tamamen manyetize olduğunda ve numune berraklaştığında, immünopresipitasyon içeren boncukları buz üzerinde 450 mikrolitre yıkama tamponunda üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncuk peletini 20 mikrolitre 2X SDS beta-merkaptoetanol protein jel yükleme tamponunda tekrar süspanse edin ve numuneyi 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın.İmmünopresipite proteinlerin Western blot analizi ile tespiti için, denatüre protein örneğini boncukları aktarmadan bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve ilgilenilen proteinler için uygun antikorları kullanarak standart protokollere göre Western blot analizi yapın, ardından yaban turpu peroksidaz bazlı kemilüminesans kullanarak bantları tespit edin. Gösterilen boncuk değirmeni homojenizatör protokolü, toplam protein ekstraksiyonunda, nükleer ve sitoplazmik proteinlerin verimli bir şekilde ekstraksiyonu için dounce bazlı yöntemlerle karşılaştırılabilir. Bu analizde, Argonaute proteinlerinin, hedef haberci RNA'lara bağlanan ve ekspresyonlarını baskılayan mikroRNA kaynaklı susturma komplekslerini oluşturan GW182 protein ailesinin üyeleriyle etkileşime girdiği belirlendi.Gösterilen ekstrakt ve immünopresipitasyon protokolleri, ALG-1 ve HRPK-1'e özgü ko-immünopresipitatları başarılı bir şekilde geri kazanmak için de kullanılabilir. Ek olarak, ALG-1: AIN-1 etkileşiminin çeşitli genetik arka planlarda test edilmesi, HRPK-1'in ALG-1: AIN-1 mikroRNA ile indüklenen susturma kompleksi düzeneği için gereksiz olduğunu ortaya çıkardı. Numunelerin stabilitesini korumak için protein ekstraksiyonunun ve immünopresipitasyonun dört santigrat derecede veya buz üzerinde yapıldığından emin olmak önemlidir.Bu toplam protein özü hazırlığı, bir mikroRNA tamamlayıcı oligonükleotid kullanılarak protein immünopresipitasyonu ve mikroRNA aşağı çekme deneyleri ile uyumludur ve hem protein hem de RNA bileşenlerinin aşağı akış toplanmasını kolaylaştırır.

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu yazıda, prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz için optimize edilmiş bir prosedür...

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Proteinlerin in vivo hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IV-FPOP) kendi doğal ortamında protein yapısının haritalanması için izin veren bir hidroksil radikal protein ayak izi tekniğidir. Bu protokol, IV-FPOP mikroakışkan akış sisteminin montajını ve kurulumünü açıklar.

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Bu protokol, C. elegans'ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Bu protokol, Escherichia coli'den elastin benzeri polipeptit (ELP) arındırılması için hızlı, tekrarlanabilir organik çözücü bazlı ekstraksiyon ve çökeltme yöntemini tanımlar; bu yöntem, geleneksel ELP arıtma yöntemlerine potansiyel olarak ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'tan yüksek verimli protein özü hazırlama ve eş-immün presipitasyon yöntemini. Bu teknik, protein etkileşimlerini çeşitli genetik arka planlarda incelemek için kullanılır.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Daha fazla video keşfet