Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Bu protokol, başarılı bir protein çekilmesinin doğrulanması ve ilgilenilen birlikte immünopresipite edilmiş proteinlerin tespiti için numune toplama, ekstrakt hazırlama ve immünopresipitasyon için adım adım bir prosedür sağlar. Protein ekstraktı hazırlığı 24 numuneye kadar gerçekleştirilebilir ve immünopresipitasyon ve RNA aşağı çekme deneyleri dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış uygulamasıyla uyumludur. Bu yöntem, çeşitli genetik arka planlarda iki veya daha fazla endojen, endojen olarak etiketlenmiş veya aşırı eksprese edilmiş C.elegans proteinleri arasındaki etkileşimlerin test edilmesini kolaylaştırmak için uyarlanabilir.

Bu protokolün görsel gösterimi, araştırmacıları protein özü hazırlama ve immünopresipitasyon konusunda rahat ettirmeyi ve umarım tekniklere yeni olanları araştırmalarında kullanmaya teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Bir solucan örneği toplamak için, önce tohum karışık aşaması veya senkronize solucanları gerekli sıcaklıkta katı nematod büyüme ortamı plakaları üzerine koyun ve solucanların istenen aşamaya kadar büyümesine izin verin. Kuluçka işleminin sonunda, solucanları 15 mililitrelik konik bir tüpe yıkamak için M9 tamponu kullanın ve solucanları santrifüjleme ile peletleyin.

Santrifüjlemenin sonunda, süpernatanı çıkarın ve solucanları yıkama başına taze M9 tamponunda üç ila beş kez daha yıkayın. Süpernatan artık bulanık olmadığında, çift damıtılmış suyla son bir yıkama yapın ve gevşek solucan peletini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Solucanları ek bir santrifüjleme ile peletleyin ve paketlenmiş bir solucan peleti elde etmek için kalan süpernatanı atın.

Toplanan solucan peletinden ekstrakt hazırlamak için, önerilen 300 mikrolitre hacimli pelete eşit hacimde buz gibi soğuk 2X lizis tamponu ekleyin ve elde edilen süspansiyonu kuvvetlice karıştırın. Tüpün dibindeki karışımı toplamak için numuneyi döndürün ve tüp içeriğini metal boncuklar içeren 1,5 mililitrelik RNAse içermeyen bir tüpe aktarın. Tüpü sıkıca kapattıktan sonra, numunenin homojenizatör içinde dengelendiğine dikkat ederek numuneyi dört santigrat derecede bir boncuk değirmeni homojenizatörüne yerleştirin.

Numuneyi boncuksuz yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce numuneyi dört dakika boyunca en yüksek hızda homojenize edin. Protein ekstraktını berraklaştırmak için numuneyi aşağı doğru döndürün ve süpernatanı, numunenin üst kısmındaki beyaz bulanık çökeltiyi aktarmadan buz üzerinde 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Standart protokollere göre toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için 10 mikrolitre arıtılmış ekstraktı bir kenara koyun ve numuneyi hemen buz üzerinde mililitre buz soğuk 1X lizis tamponu başına beş veya 10 miligram proteine seyreltin.

İlgilenilen proteinin immünopresipitasyonu için, önce manyetik boncukları ters çevirerek yeniden süspanse edin ve 50X boncuk süspansiyonunun 150 mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Buz üzerindeki boncukları manyetik bir standa karşı yaklaşık bir dakika boyunca manyetize edin. Çözelti berrak olduğunda, süpernatanı atın.

Tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncukları üç adet 300 mikrolitre hacimli 1X lizis tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncukları 150 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve 75 mikrolitre boncuk bulamacını iki miligram protein özü örneğine aktarın. Hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bir saatlik inkübasyondan sonra, numune tüpünü yaklaşık bir dakika boyunca buz üzerindeki mıknatısa yerleştirin.

Boncuklar tamamen manyetize olduğunda ve numune berrak olduğunda, boncukları rahatsız etmeden süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Western blot analizi için numunenin% 10'unu bir kenara koyun ve hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bir saatlik bir inkübasyon için önceden temizlenmiş lizata 20 mikrogram afinite saflaştırılmış antikor ekleyin. İnkübasyonun sonunda, kalan 75 mikrolitre önceden yıkanmış boncuk süspansiyonunu, hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bir saatlik ek bir inkübasyon için antikor lizat karışımına ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, numuneyi yaklaşık bir dakika boyunca mıknatısın üzerine geri yerleştirin. Boncuklar tamamen manyetize olduğunda ve numune berraklaştığında, immünopresipitasyon içeren boncukları buz üzerinde 450 mikrolitre yıkama tamponunda üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncuk peletini 20 mikrolitre 2X SDS beta-merkaptoetanol protein jel yükleme tamponunda tekrar süspanse edin ve numuneyi 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın.

İmmünopresipite proteinlerin Western blot analizi ile tespiti için, denatüre protein örneğini boncukları aktarmadan bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve ilgilenilen proteinler için uygun antikorları kullanarak standart protokollere göre Western blot analizi yapın, ardından yaban turpu peroksidaz bazlı kemilüminesans kullanarak bantları tespit edin. Gösterilen boncuk değirmeni homojenizatör protokolü, toplam protein ekstraksiyonunda, nükleer ve sitoplazmik proteinlerin verimli bir şekilde ekstraksiyonu için dounce bazlı yöntemlerle karşılaştırılabilir. Bu analizde, Argonaute proteinlerinin, hedef haberci RNA'lara bağlanan ve ekspresyonlarını baskılayan mikroRNA kaynaklı susturma komplekslerini oluşturan GW182 protein ailesinin üyeleriyle etkileşime girdiği belirlendi.

Gösterilen ekstrakt ve immünopresipitasyon protokolleri, ALG-1 ve HRPK-1'e özgü ko-immünopresipitatları başarılı bir şekilde geri kazanmak için de kullanılabilir. Ek olarak, ALG-1: AIN-1 etkileşiminin çeşitli genetik arka planlarda test edilmesi, HRPK-1'in ALG-1: AIN-1 mikroRNA ile indüklenen susturma kompleksi düzeneği için gereksiz olduğunu ortaya çıkardı. Numunelerin stabilitesini korumak için protein ekstraksiyonunun ve immünopresipitasyonun dört santigrat derecede veya buz üzerinde yapıldığından emin olmak önemlidir.

Bu toplam protein özü hazırlığı, bir mikroRNA tamamlayıcı oligonükleotid kullanılarak protein immünopresipitasyonu ve mikroRNA aşağı çekme deneyleri ile uyumludur ve hem protein hem de RNA bileşenlerinin aşağı akış toplanmasını kolaylaştırır.