Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Bu protokol yara kaynaklı poliploidizasyonu incelemek için kullanılabilir. Hücrelerin yetişkin meyve sineği bölmek yerine büyümek hangi bir tasarruf doku onarım süreci. Basit bir delinme yarası sadece iki gün içinde sinek epitel poliploidini tetiklemek için yapılabilir.

Epitel hücre büyüklüğü, ploidi ve organizasyon, daha sonra kolayca değerlendirilebilir. Ilgi gerginlik 10 ila 15 yeni kapalı kadın meyve sinekleri içeren iki şişe, toplayarak başlayın. Ve sinekleri taze gıda şişelerinde yaşlanıyor, şişe başına yaklaşık beş erkek sineği 25 derecede, 3-5 günlük olana kadar.

Karın yarası için, kuluçka sonunda, her pin in sharp sonunda dışarı pacing ile, birkaç pin tutucuları monte etmek için tek bir 0.1 milimetre paslanmaz çelik pin kullanın. Yaşlı dişi meyve bir stereo mikroskop altında bir karbondioksit sinek ped üzerinde sinek anestezi. Ve bir satır içine sinek düzenlemek için bir boya fırçası kullanın.

Bir elinde iğne tutucu, diğerelinde forseps olan güvenlik gözlüğü takmak, sinekleri ventral karınları yukarı bakacak şekilde konumlandırmak için forsepsleri kullanın. Daha sonra, ventral orta hattın her iki tarafında ki a4 hedefin epitel mavi sağ bölgesinde yetişkin dişi sinekleri delin ve yaralı sinekleri istenilen deneysel zaman işareti yaralanma noktasına kadar gıda şişesine geri döndürün. Deneysel bitiş noktasında, stereo mikroskop altında her anestezi sinek yara ve yara varlığını kontrol edin ve Grace'in çözümü ile dokuz kuyucam diseksiyon çanak bir kuyu doldurun.

Forseps bir çift kullanarak, toraks dorsal tarafında yaralı bir kadın sinek kavramak ve çözüm kuyusunda sinek batırmak. Diğer taraftan, meyve sineğinin arkasında, Hedef A6'nın altındaki dorsal mitikülleri delmek ve çıkarmak için ikinci bir çift forseps kullanın. İç organlar ayıklanmaz ise, kalan organları sıkmak için karın dorsal tarafına basınç uygulayın.

Hedef A2'nin üzerindeki toraks kavşağında karının tamamını koparmak ve karını Grace'in çözeltisinin yaklaşık 100 mikrolitresini içeren bir kuyuya aktarmak için forsepsleri kullanın. Tüm karınlar toplandığında, Grace'in toplamadaki çözeltisinin hacmini 30 mikrolitreye düşürün. Bir elinizde karın dorsal tarafını aşağı tutmak için forseps kullanın ve diğer elinizi kullanarak Venedik yay makasının alt bıçağını her karın boşluğuna yerleştirin ve karın lar tamamen açılına kadar dorsal orta çizgi boyunca kesin.

Karın montaj alanı başına 4,1 milimetre lik iğnelerle kuru bir kesme plakasının her montaj alanına Grace'in çözeltisinin 30 mikrolitresini ekleyin ve radyedilmiş karnı çözeltinin damlatıcısına yerleştirin. Tüm karınlar filetoed ve yerleştirildiğinde, dört sırt köşelerinde çanak için karın pin. Dokuların karın dokusunu yırtmadan veya aşırı germeden düz yatarken dikkatli olmak.

Daha sonra Grace'in çözeltisini montaj alanı başına 30 mikrolitre fiksatif çözümle değiştirin. Ve her kontrol ve deney grubunu işaretlemek için her yemeğin altına bir bant etiketi yerleştirin. Sinek dokusu örneklerini monte etmek için.

Boyama sonra, stereo mikroskop altında kesme plakasından karınları çıkarmak için forceps kullanın. Ve her numuneyi dorsal kanadı ile tek tek cam kapak fişleri üzerine yaklaşık 30 mikrolitre montaj ortamına aktarmak için terlikler kullanın. Stereo mikroskop altında karın dokusunu yönlendirin, böylece iç kapak kayma doğru bakıyor ve her ortam damlacık kenarına odaklı karın çekmek için forceps kullanın.

Her bir takılı kapak fişini etiketli bir cam kaydırak üzerine yerleştirin. Ve herhangi bir aşırı montaj ortamı kaldırmak için bir laboratuvar dokusu kullanın. Daha sonra kapağın kenarlarını açık oje ile kapatın ve slaytları görüntülemeye kadar dört derece santigrat derecede saklayın.

Hücre hücre kavşaklarını etiketleyen septatbağlantı proteini hızlı üç, hazırlık sırasında herhangi bir işlem tedirginliği oluşup oluşmadığının bir göstergesidir. Yara bölgesini tedirgin eden lekesiz bölgenin büyük çizikleri olan karınlar atılmalı ve analize dahil edilmemelidir. Merkezi büyük çok çekirdekli hücre yara yara yarasını kapladığında yara onarımı tamamlanır.

Epitel tabakasında 10 mikrometreden büyük boşluklar yara kapanması ve yeniden epitelizasyonda kusur olarak kabul edilir. İnhibe edilmiş mitotik hücre aktivasyonu ile sinekler kullanılarak yapılan bu temsili analizde, yaraların %52'si yara kabuğu üzerinde sürekli epitel tabakası oluşturamamıştır. Bu membran yara iyileşmesi kompozisyon yeniden epitelizasyon defektleri ya tamamen açık, kısmen kapalı veya tamamen kapalı olarak gruplandırılmasıiçin izin yara onarım defekti ölçüde daha fazla bilgi sağlar.

Örneğin, bu deneyde endo replikasyonu ve hücre füzyonunun eşzamanlı olarak engellenmesi ile yaranın inhibisyonu epitel yaralarının %92'sinin tamamen açık kalmasına neden olmaktadır. Mitotik hücre döngüsünün aktivasyonu epitel yarası kapatma defekti ile sonuçlanırken. Ayrıca timidin analog EDU'nun eklenmesiyle hücre döngüsü aktivitesi saptanmış ve epitel ploidi doğrudan nükleer DNA içeriği nin ölçülmesi ile saptanmıştır.

Karın epitelini parçalarken, örneği çizeceği için diksiyon aletlerinin herhangi biriyle dokuya dokunmamaya özen. Diseksiyon sonrası, hücre çoğalması, hücre ölümü, hücre kaybı kesi boyutu veya nükleer DNA içeriği değerlendirmeleri daha iyi yara kaynaklı poliploidizasyon anlamak için yapılabilir. veya epitel içindeki diğer işlemler.