Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Bu protokol, hem temel hem de klinik araştırmalar için karaciğer biyolojisini incelemek için tekrarlanabilir bir araç sunan kök hücre kaynaklı bir hepatik farklılaşma sistemi sağlar. Standartlaştırılmış ve takip etmesi kolay bir protokolü kullanıma hazır kültür reaktifleri ile birleştirerek, bu sistem hepatik progenitörlerin ve hepatosit benzeri hücrelerin büyük ölçekte üretilmesine izin verir. İnsan pluripotent hücrelerini laminin-531 üzerinde 10 santimetrelik bir tabakta 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun ve onları günlük olarak tabak başına 10 mililitre kök hücre bakım ortamı ile besleyin.

Laminin 521 plakalarını hazırlamak için, çözülmüş laminin 521'i buz gibi DPBS'de kalsiyum ve magnezyum ile mililitre başına sekiz mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 250 mikrolitre laminin çözeltisi veya 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre ekleyin. Kuyucukları eşit şekilde kaplamak için plakayı bir yandan diğer yana hafifçe sallayın, ardından plakaları yarı saydam esnek bir filmle kapatın ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Hücre tohumlama gününde, önceden kaplanmış plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe 30 ila 60 dakika ısıtın. Laminin 521 solüsyonunu aspire edin ve her bir oyuğa 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş kök hücre bakım ortamı ekleyin, ardından plakayı inkübatöre geri koyun. Hücre sayısı akıcılığı %70 ila 80'e ulaştığında, harcanan ortamı kültür kabından aspire edin ve her kültür kabını oda sıcaklığında kalsiyum veya magnezyum içermeyen beş mililitre DPBS ile yıkayın.

DPBS yıkamasını kültür kabından aspire edin, daha sonra tabağa beş mililitre enzim içermeyen ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreler tabaktan gözle görülür şekilde ayrılana kadar plakayı 37 santigrat derecede sekiz ila 10 dakika inkübe edin. Hücreleri bir hücre sıyırıcı ile kültür kabından nazikçe ayırın, ardından tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için her bir oyuğun içeriğini beş mililitrelik bir serolojik pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin. Her hücre hattı için, tüm bakım kuyularından gelen hücreleri steril 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Her boşaltılmış kültür kabını bu kök hücre bakım ortamından beş mililitre ile yıkayın ve yıkamaları, havuzlanmış hücrelerle birlikte ilgili tüpe ekleyin. Havuza alınan her örnekte üç canlı hücre sayımı gerçekleştirin. Havuzlanan numuneleri beş dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri, 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y27632 ile desteklenmiş kök hücre bakım ortamı olarak bir ila üç mililitre oda sıcaklığında yeniden süspanse edin. İstenilen tohumlama yoğunluğunu elde etmek için gereken hücre sayısını hesapladıktan sonra, hücreleri uygun konsantrasyona yeniden süspanse edin ve bunları önceden kaplanmış plakalara dağıtın. Oyuk başına toplam hacim, 24 oyuklu bir plaka için bir mililitre ve 96 oyuklu plaka için 0,1 mililitre olmalıdır.

Eşit bir hücre dağılımı sağlamak için plakaları bir yandan diğer yana ve ileri geri hafifçe sallayın ve tohumlanmış plakaları inkübatöre yerleştirin, ileri geri ve bir yandan diğer yana sallayın. Kesin endoderm indüksiyonu ve metin el yazmasında açıklandığı gibi müteakip hepatik progenitör hücre spesifikasyonu farklılaşması için ortamı hazırlayın. Farklılaşmanın birinci gününde, harcanan ortamı kuyulardan çıkarın ve birinci aşama orta olanla değiştirin.

İki, üçüncü ve dördüncü günlerde, harcanan ortamı çıkarın ve her birini birinci aşama orta iki ile iyice besleyin. Beşinci günde, kesin endoderm farklılaşma analizi için amaçlanan kuyuları sabitleyin. Kalan kuyucuklar için, harcanan ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu kök diferansiyel hepatik progenitör ortamı ile besleyin.

10. günde, hepatik progenitör farklılaşma analizi için hücreleri toplayın veya daha fazla hepatosit benzeri hücre farklılaşması ile devam edin. Hepatik progenitör farklılaşma kültürlerini karakterize etmek için, beşinci günde kesin endoderm spesifik belirteçlerin ve 10. günde hepatik progenitör spesifik belirteçlerin ekspresyonunu tespit etmek ve HNF4 alfa pozitif hücrelerin yüzdesini ölçmek için immün boyama kullanın. 10. günde, ELISA yoluyla alfa fetoprotein ve albümin sekresyonunu da ölçün.

Bu protokol, hepatik progenitör hücreleri hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden ayırt etmek için kullanıldı. Farklılaşma protokolünün beşinci gününde, kesin endoderm spesifikasyonu Sox 17 ekspresyonu ile değerlendirildi. Her iki hücre hattında da Sox 17, H9 ve P106 için Sox 17 pozitif hücrelerin sırasıyla %80 ve %87.8'i ile yüksek oranda eksprese edildi.

10. günde, hepatik atalar parke taşı benzeri bir morfoloji sergiledi. Ek olarak, HNF4 alfa, AFP, albümin ve sitokeratin 19 ekspresyonu için hepatik progenitör spesifikasyonu değerlendirildi. Her iki hepatik progenitör kültür, HNF4 alfa, AFP ve CK 19 gibi fetal hepatik belirteçleri eksprese etti.

iki hücre hattında 10. günde alfa fetoprotein sekresyonu tespit edilirken, ELISA ile albümin sekresyonu tespit edilmedi. Hücre sayısı değişkenliği ve hepatik progenitör farklılaşma etkinliği, HNF4 alfa ekspresyonunun nicelleştirilmesiyle değerlendirildi. 10. günde, hepatik progenitörler, H9 ve P106 için oyuk başına sırasıyla %95 ve %97'den fazla HNF4 alfa pozitif hücre içeren sıralar arasında önemli bir değişkenlik göstermedi.

Farklılaşmanın başlamasından önce eşit bir hücre dağılımı, homojen bir hepatik progenitör hücre popülasyonu sağlamanın anahtarıdır. Bunu başarmak için, eşit hücre dağılımını sağlamak için plakaları hafifçe yan yana ve ileri geri sallayın. Bu protokol tarafından üretilen hepatik progenitör hücreler, diğer tahliller için hepatosit benzeri hücrelere daha da farklılaştırılabilir ve hastalık modellemesi veya ilaç taraması için tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış bir araç sunar.