Name: Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Öğrenin, polinükleotid kinazların küçük DNA ve RNA substratlarındaki aktivitesini radyoaktif olmayan yöntemle ölçün. Bu hassas teknik, beş uç fosforilasyonundaki küçük değişiklikleri tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Andrew Sikkema ve Andrea Kaminski'ye bu el yazmasının eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247' den R.E.S) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR; 146626 to M.C.P).

1. Hazırlık
<ol><li>Arabellek ve reaktifleri hazırlayın.<ol>
<li>Toplam 1 m Tris (pH = 8,0), 40 μL 5 M sodyum klorür, 2,5 μL 2 M magnezyum klorür, 100 μL %50 (v/v) gliserol ve 1 mL'lik rNase içermeyen suyu birleştirerek 1x Reaksiyon Tamponu yapın.</li>
		<li>4,8 g üre, 200 μL 1 M Tris (pH = 8,0), 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL %1 (w/v) bromofenol mavisi ve RNase içermeyen suyu birleştirerek üre yükleme boyası yapın.</li>
		<li>108 g Tris baz, 55 g borik asit, 40 mL 0,5 M EDTA (pH = 8,0) ve Toplam 1 L'lik rNase içermeyen suyu birleştirerek 10x TBE tamponu yapın.</li>
		<li>%10 (w/v) amonyum persülfat (APS) yapın. 0,5 g APS ağırlığında ve katı eritmek için 3 mL RNase içermeyen su ekleyin. Toplam 5 mL hacme ulaşmak için RNase içermeyen su ekleyin. Tüpü folyoya sarın ve çözeltiyi 4 °C'de saklayın. NOT: Çözünmüş APS zamanla çürür. Her 2 haftada bir %10 APS hissesini değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Polinükleotid kinaz enzimini elde edin.<ol>
<li>Reaksiyon Tamponu'nda depolanan saf Las1-Grc3 PNKenzim2'yi (bkz. adım 1.1.1) 20 μM'lik bir stok konsantrasyonunda edinin. Depolama arabelleği belirli PNK bağlı olarak değişir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nükleik asit substratı hazırlayın. NOT: Bu protokol, Saccharomyces cerevisiae pre-ribozomal iç transkripsiyonlu spacer 2 (SC-ITS2; bakınız Tablo 1)2,25,26içinde yer alan Las1-Grc3 işleme sitesi (C2 sitesi) barındıran 27 nt RNA substrat5'-fosforilasyon izler.<ol>
<li>Kimyasal olarak 5'-hidroksil ucu içeren bir RNA oligonükleotid substratı ve 3'-floresan etiket sentez. Florofor RNA görselleştirme için kullanılacaktır. Florofor fosforilasyon için hedeflenmemiş RNA ucunda konumlandırılmış olduğundan emin olun. Ticari kaynaklara alternatif olarak, RNA substratlarının iç ve terminal floresan etiketlemesi, uygun maliyetli protokoller kullanılarak şirket içinde yapılabilir27.</li>
		<li>HPLC-arıtma28ile RNA etiketleme reaksiyonundan fazla florofor kaldırın.</li>
		<li>500 nM RNa içermeyen su kullanarak lyophilized RNA resuspend.</li>
		<li>RNA aliquots'u uzun süreli depolama için -80 °C'de veya kısa süreli depolama için -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATP konsantrasyon serisini hazırlayın.<ol>
<li>Reaksiyon Arabelleği kullanarak 20 mM'lik bir ATP çalışma stoğu yapın (bkz. adım 1.1.1). 20 mM-0,02 mM arasında değişen dört seri seyreltme oluşturmak için bu çalışma stoğunu kullanın.</li>
		<li>Konsantrasyon serisinin ilk seyreltilmesini yapmak için, 20 mM ATP çalışma stokunun 1 μL'sini 9 μL Reaksiyon Tamponu ile karıştırın. Bu 2 mM son konsantrasyonu ile ATP 10 kat seyreltme neden olacaktır.</li>
		<li>1.4.2 adımda oluşturulan 2 mM ATP stoğunu kullanarak konsantrasyon serisindeki bir sonraki seyreltme yi kullanın. 2 mM ATP stokunun 1 μL'sini 9 μL Reaksiyon Tamponu ile karıştırın. Bu 0.2 mM yeni bir ATP stok konsantrasyonu yapacaktır.</li>
		<li>Konsantrasyon serisinde sonraki ATP stoğunu yapmak için önceki ATP stokunun 1 μL'sini 9 μL Reaksiyon Tamponu ile seyreltmeye devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. In vitro RNA kinaz reaksiyonu
NOT: Bu çalışma, zaman, nükleotit seviyeleri veya enzim konsantrasyonu gibi çeşitli değişkenleri ölçmek için kullanılabilir. Bu deneyin amacı, sabit Las1-Grc3 kompleksi ve değişen ATP düzeyleri nin varlığında fosforile RNA miktarını değerlendirmektir.
<ol><li>Her RNA-enzim kinaz reaksiyonu için 1 μL 500 nM RNA substrat, 8,3 μL 130 nM Las1-Grc3 ve 0,2 μL 5 mM EDTA'yı birleştirin. NOT: Birkaç reaksiyon gerçekleştiriyorsanız, rna-enzim karışımının ana stoğunu hazırlayın ve her reaksiyon tüpüne bu ana karışımın 9,5 μL'lik aliquot'unu hazırlayın.</li>
	<li>Tazyiki başlatın.<ol>
<li>Isı bloğunu 37 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>10 s aralıklarla, adım 1.4'te hazırlanan ATP konsantrasyon serisinden bir ATP alt stokunun 0,5 μL'sini bir RNA-enzim karışımıyla karıştırın ve reaksiyonu 37 °C ısı bloğuna yerleştirin. NOT: PNK negatif kontrolü için bir RNA-enzim karışımına ATP yerine 0,5 l Reaksiyon Tamponu ekleyin. Başka bir gerekli kontrol de kullanın (yani, PNK enzimyokluğunda RNA substrat).</li>
		<li>Reaksiyonları 37 °C'de 60 dk kuluçkaya yatırın. NOT: Floresan etiketli RNA ışığa duyarlıdır; bu nedenle, folyo ile reaksiyonları kapsayacak.</li>
		<li>Adım 2.2.2'deki aynı sırayı kullanarak, her 10 s'lik her reaksiyonu 10 μL üre yükleme boyası ile şişirerek söndürün (bkz. adım 1.1.2). NOT: 4 M üre ek olarak, proteinaz K enzim iksiyon etmek için bu adımda eklenebilir. Gerekli proteaz miktarını ve reaksiyon koşullarını belirlemek için tedarikçi tarafından verilen talimatları uygulayın.</li>
		<li>Daha sonraki bir tarihte analiz edilmesi için instream analizi için hemen söndürülen in vitro RNA kinaz reaksiyonlarını kullanın (bkz. bölüm 3) veya -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Jel elektroforez
<ol><li>%15 akrilamid/8 M üre jel çözeltisi hazırlayın. DİkKAT: Akrilamid bir nörotoksin olduğu için, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük takın.<ol>
<li>150 mL cam kabında, 22,5 mL premix %40 akrilamid/bis-akrilamid 29:1 çözeltisi, 6 mL 10x TBE (bkz. adım 1.1.3), 28.8 g üre ve RNase içermeyen suyu toplam 59 mL hacminde birleştirir. Çözeltiyi yavaşça karıştırın. NOT: RNA substrat uzunluğuna bağlı olarak poliakrilamid yüzdesinin değiştirilmesi fosforilasyonsuz ve fosforlu RNA arasındaki çözünürlüğü artırabilir.</li>
		<li>Üre yi eritmek için çözeltiyi mikrodalgafırında 20 s ısıtın, sıvıyı karıştırın ve hemen çözeltiyi 20 s'lik bir fırına geri yerleştirin. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Cam kabı soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirerek çözeltiyi yavaşça soğutun. Cam kabı çevreleyen soğuk su seviyesinin cam kabın içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olun. Bu verimli ısı transferi teşvik edecektir. 5 dk bekleyin. NOT: Cam kabı sıcak hissediyorsa bu protokolile devam etmeyin; su 25 °C'nin altında olmalıdır. Hala 5 dakika sonra sıcak hissediyorsa, o zaman taze soğuk su ile su banyosunda su değiştirin ve başka bir 5 dakika bekleyin.</li>
		<li>Partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını temizlemek için 0,22 μm tek kullanımlık filtrasyon ünitesi kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve gazdan arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Denatüre jeli dökün.<ol>
<li>31,0 cm x 38,5 cm boyutlarında jeller için tasarlanmış kısa ve uzun cam plakayı temizlemek için sabun ve ılık su kullanın. Sprey her cam plaka% 95 etanol ile ve herhangi bir nem kaldırmak için cam silin. NOT: Cam plakalı sandviçi ayırırken jelin zarar görmesini önlemek için iki plakadan biri silikonhaline getirilebilir. Ancak, bu protokol cam plakaları ayırmadan RNA'yı görselleştirmek için tasarlandığından, bu adım gerekli değildir.</li>
		<li>Uzun cam plakayı bir kutunun üzerine yatay olarak yerleştirin, böylece tezgahın üstünden yükselir. DİkKAT: Akrilamid toksiktir, bu nedenle jel döküm istasyonu dökülen sıvıyı emebilecek tezgah kağıdıyla kaplanmalı ve işlem tamamlandıktan sonra derhal bir atık torbasına konulmalıdır.</li>
		<li>Uzun cam plakanın uzun kenarları boyunca temiz bir 0,4 mm boşluk yerleştirin.</li>
		<li>Kısa cam plakayı uzun plakanın üzerine yerleştirin ve kısa plakanın, uzun plakanın ve boşluklayıcıların kenarlarının hizalandığından emin olun. Üç eşit aralıklı metal kelepçe kullanarak her iki tarafı kelepçe.</li>
		<li>Adım 3.1'de hazırlanan %15 akrilamid/8 M üre çözeltisine 24°L TEMED ekleyin ve çözeltiyi karıştırın.</li>
		<li>Adım 3.2.5'te çözeltiye %10 (w/v) APS'nin 600 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.1.4) ve çözeltiyi yavaşça karıştırın.</li>
		<li>Hemen cam plakalar arasında çözelti dökün. NOT: Kabarcıkları önlemek için, çözelti dökülür gibi cam dokunun.</li>
		<li>Dikkatle cam plaka sandviç üstüne temiz, 0,4 mm, 32 iyi tarak ekleyin.</li>
		<li>Akrilamid polimerize için en az 30 dakika bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Denatüre jeli çalıştırın.<ol>
<li>Isı bloğunu 75 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>Cam plakalı sandviçi bir arada tutan metal kelepçeleri çıkarın ve cam plakalı sandviçi iyice yıkayıp kurutun.</li>
		<li>Cam tabak sandviçini jel aparatına yerleştirin ve kısa plaka içe bakacak şekilde.</li>
		<li>100 mL 10x TBE'yi 1,9 L RNase içermeyen su ile birleştirerek 0,5 x TBE çalışan tampon hazırlayın. Jel aparatının alt ve üst odalarına çalışan tamponun 600 mL'sini ekleyin.</li>
		<li>Tarakları yavaşça çıkarın ve bir şırınga kullanarak kuyuları iyice durulayın. NOT: Bu adım, üreyi kuyulardan çıkarmak için çok önemlidir.</li>
		<li>50 W. Voltaj'da 30 dk için jelin önceden çalıştırılyaklaşık 2.000 V.'dir. DİkKAT: Bu jel aparatı yüksek watt'ta çalışır ve kullanıcılar önlem almalıdır.</li>
		<li>Bir şırınga kullanarak kuyuları iyice durulayın. NOT: Bu adım, numunenin kuyulara eşit olarak yüklenmesi için çok önemlidir.</li>
		<li>Nabız adım 2.2.5'ten gelen söndürülen reaksiyonları döndürür. Daha sonra tüpleri 75 °C'de 3 dk kuluçkaya yatırın. Nabız dönüşünü tekrarlayın.</li>
		<li>Hemen kuyu başına 10 μL numune yükleyin ve jeli 50 W'da 3 saat çalıştırın. NOT: Floresan etiketli RNA ışığa duyarlıdır; bu nedenle jel aparatını folyo ile kaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Denaturing jelgörüntü.<ol>
<li>Güç kaynağını kapatın ve jel aparatının üst haznesini boşaltın.</li>
		<li>Cam plakalı sandviçin dış tarafını sabun ve su kullanarak yıkayın ve kurutun. Jel taşırken folyo ile cam plaka sandviç kapağı.</li>
		<li>Cam plakalı sandviçi, kantitatif ve hassas floresan algılama yeteneğine sahip bir lazer tarayıcının sahnesine monte edin. NOT: Bu jel maksimum çözünürlük için son derece incedir. Bu nedenle bu protokol, cam plakalı RNA'yı doğrudan cam plakalar üzerinden görselleştirerek jeli cam plakalı sandviçten çıkarmanın zorluklarını önlemek için tasarlanmıştır. Ticari olarak mevcut düşük floresan cam plakaların kullanımı sinyal-gürültü oranını artırarak yakalanan sinyali artıracaktır.</li>
		<li>İstenilen florofor için lazer tarayıcının uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın. NOT: Optimal uyarma ve emisyon dalga boyları belirli florofororlar için farklılık gösterebilir. FAM florofor için uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 495 nm ve 535 nm'dir.</li>
		<li>Lazer tarayıcı aşamasında görüntülenecek alanı tanımlayın ve jeli üreticinin talimatlarına göre görüntüleyin(Şekil 1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Görüntü analizi ve sinyal nicelemesi
<ol><li>Adım 3.4.5'te edinilen dijital jel görüntüyü görüntü dürbünleme yazılımına yükleyin (bkz.</li>
	<li>Farenin sol düğmesini kullanarak, her RNA bandını ölçmek için kullanılacak dijital jel görüntüsündeki sınırları işaretlemek için bir şablon kutusu tanımlamak için bir dikdörtgeni tıklatın ve sürükleyin. PNK enziminin yokluğunda belirlenen reaksiyon karışımında görülen RNA bandı genellikle bu şablonu oluşturmak için iyi bir banttır. NOT: Arka plan sinyalinin neden olduğu önyargıyı önlemek için, ölçülen her RNA bandını çevreleyen alanın aynı olması önemlidir. Bu nedenle, her RNA bandını ayırmak için aynı şablon kutusunu kullanmak en iyisidir.</li>
	<li>"Araçlar" altında YG Yöneticisi'ni açın ve " Ekle " seçeneğini tıklayarak şablon kutusunun konumunuişaretleyin. NOT: Quantitation programları da otomatik olarak yazılım kullanım kılavuzu aşağıdaki kutuları çizebilirsiniz.</li>
	<li>Farenin sol düğmesini kullanarak şablon kutusunu bir sonraki RNA bandına sürükleyip 4.3 adımını yineleyin. Her reaksiyonda fosforlu ve fosforlu RNA bantlarının konumu işaretlenene kadar bu işlemi devam edin.</li>
	<li>YG Yöneticisi'ndeki "Ölçü "seçeneğini tıklayarak her kutudaki tümleşik yoğunluğu ölçün.</li>
	<li>Bir reaksiyonda fosforile RNA'nın göreceli miktarını hesaplamak için, fosforilasyonsuz ve fosforlu RNA bantlarının entegre yoğunluklarının toplamı ile fosforilasyonlu RNA bandının entegre yoğunluğunu aynı reaksiyondan ayırın. Bu yaklaşım, fosforilatsız RNA'nın göreli miktarını hesaplamak için de uygulanabilir.</li>
	<li>Fosforlu RNA ürünbirikimini ve ATP konsantrasyonu serisi boyunca fosforlu RNA substratının tükenmesini görselleştirmek için, 4.6 adımda hesaplanan göreli RNA miktarını ATP konsantrasyonuna göre çizin.</li>
</ol>

<ol><li>Pillon, M. C., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+integrated+kinase+super+assemblies+%28NiKs%29+and+their+role+in+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing.</a> Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).</li>
<li>Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Ribosomal+ITS2+RNA+Processing+by+the+Las1+Complex+Integrating+Endonuclease%2C+Polynucleotide+Kinase%2C+and+Exonuclease+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities.</a> Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).</li>
<li>Dikfidan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+specificity+and+regulation+of+catalysis+in+the+eukaryotic+polynucleotide+kinase+Clp1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1.</a> Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).</li>
<li>Bernstein, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+architecture+of+the+mammalian+DNA+repair+enzyme%2C+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase.</a> Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-end+labeling+of+RNA+with+%5Bgamma-32P%5DATP+and+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).</li>
<li>Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+labeling%2C+conjugation+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA labeling, conjugation and ligation.</a> Methods. 54 (2), 251-259 (2011).</li>
<li>Hilario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+labeling+procedures%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">End labeling procedures: an overview.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).</li>
<li>Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+DNA+substrates+by+T4+bacteriophage+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase.</a> Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).</li>
<li>Lillehaug, J. R., Kleppe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).</li>
<li>Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+nucleic+acid+by+an+enzyme+from+T4+bacteriophage-infected+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).</li>
<li>Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+tRNA+repair+enzyme+and+molecular+biology+workhorse%3A+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase.</a> Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Molecular+Evolutionary+Analysis+Uncovers+a+Variety+of+Polynucleotide+Kinase+Clp1+Family+Proteins+in+the+Three+Domains+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+Evolution%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life.</a> Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).</li>
<li>Jain, R., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+thermostable+archaeal+polynucleotide+kinase+homologous+to+human+Clp1%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1.</a> RNA. 15 (5), 923-931 (2009).</li>
<li>Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLP1+as+a+novel+player+in+linking+tRNA+splicing+to+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).</li>
<li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase%3A+an+RNA+repair+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microchip+electrophoresis+laser+induced+fluorescence+detection+method+for+the+assay+of+T4+polynucleotide+kinase+activity+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors.</a> Talanta. 202, 317-322 (2019).</li>
<li>Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+electrochemical+biosensor+for+polynucleotide+kinase+assay+based+on+gold+nanoparticle-mediated+lambda+exonuclease+cleavage-induced+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).</li>
<li>Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Detection+of+Polynucleotide+Kinase+Based+on+Phosphorylation-Directed+Recovery+of+Fluorescence+Quenched+by+Au+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).</li>
<li>Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase%2Fphosphatase+activity+and+its+inhibitors+based+on+G-quadruplex%2Fhemin+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme.</a> Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).</li>
<li>Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free+bioluminescent+sensor+for+real-time+monitoring+polynucleotide+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).</li>
<li>Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+T4+polynucleotide+kinase+activity+based+on+the+horseradish+peroxidase-mimicking+DNAzyme+combined+with+lambda+exonuclease+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage.</a> Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).</li>
<li>Castle, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Las1+interacts+with+Grc3+polynucleotide+kinase+and+is+required+for+ribosome+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li>
<li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5%27--%3E3%27+exonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li>
<li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li>
<li>Giusti, W. G., Adriano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+5%27-fluorescent-dye-labeled+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Application%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides.</a> PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).</li>
<li>Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+by+analytical+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tanımlanan floresan etiketli nükleotit substratlar üzerinde Grc3 PNK kinaz aktivitesini ölçmek için bir töz. Bu protokol Reaksiyon Tamponu ve oligonükleotid substratuyarlayarak diğer PNK enzimlerini karakterize etmek için uygulanabilir. Örneğin, protokol EDTA bir izleme miktarı için çağırır. EDTA eklenmesi iki nedenden dolayı yararlıdır: Birincisi, bu yaklaşım karışımı kirlenmiş metallerin eser miktarda enzim bağlanmasını engelleyerek magnezyum bağlı Grc3 lehine. İkinci olarak, az miktarda EDTA, ilişkili Las1 metal-bağım...

Polinükleotid kinazlar (PNK) DNA onarımı ve,ribozom montaj1,2,3,4,5gibi birçok DNA ve RNA işleme yollarında kritik rol oynamaktadır., Bu temel enzimler terminal (gama) monofosfatının nükleozit trifosfattan (NTP, en sık ATP) nükleotit substratının 5' hidroksil ucuna transferini katalizler. En iyi karakterize PNKs biri bakteriyofaj T4 PNK, geniş substrat özgüllüğü vardır ve ağır bir DNA veya RNA substrat5terminus üzerine radyoaktif izotop etiketleri dahil etmek için moleküler biyoloji laboratuvarları tarafından kullanılan 6,7,8,9,10,11,12. Bir PNK enziminin başka bir örneği CLP1, Eukarya bulunan, Eubacteria, ve Arke, ve çeşitli RNA işleme yollarıkarıştığı 4,13,14,15.
Tarihsel olarak, polinükleotid kizaz aktivitesiölçmek en tahliller radyoaktif izotop etiketleme ve sonraki otoradyografi5,bağlıdır ,16. Son yıllarda ek tahliller bir dizi pnk aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir, tek molekül yaklaşımları da dahil olmak üzere, mikroçip elektroforez, moleküler işaretleri, yanı sıra kolorimetrik ve parlaklık tabanlı tahliller17,18,19,20,21,22. Bu yeni yaklaşımların çoğu gelişmiş algılama limitleri sağlarken ve radyoaktivite kullanımını önlemek, her maliyet gibi dezavantajları vardır, immobilize reçine güven, ve substrat seçiminde sınırlamalar.
Grc3 pre-ribozomal RNA2,,,3,23işlenmesinde önemli bir rol oynayan bir polinükleotid kinaz olduğunu. Grc3 endoribonuclease Las1 ile zorunlu bir kompleks oluşturur, hangi iç Transkripsiyonu Spacer cleaves 2 (ITS2) pre-ribozomal RNA3. Las1 tarafından ITS2 dekolte daha sonra Grc3 kinizaz3tarafından fosforile bir 5 'hidroksil barındıran bir ürün üretir. Grc3'ün nükleotit ve substrat özgüllüğünü araştırmak için, farklı oligonükleotid substratlarının test edilmesine izin veren ucuz bir test gerekiyordu. Bu nedenle floresan etiketli substratlar kullanılarak PNK fosforilasyon titreti geliştirilmiştir. Bu tsur, Grc3'ün fosforil transfer aktivitesi için herhangi bir NTP kullanabileceğini belirlemek için başarıyla kullanıldı, ancak ATP24'ünlehine. Bu protokol, grc3'ün pnk aktivitesini, ribozomal RNA substratının bir RNA mimiküzerinde ölçmek için orijinal testini uyarlar (SC-ITS2, Tablo 1). Bu floresan tabanlı yaklaşımın zorlu bir yönü fosforlu ve fosforile olmayan yüzeyleri etkili bir şekilde çözmek için büyük poliakrilamid jeller güven. Protokol, bu büyük jellerin nasıl döküleceklerine ve bunu yaparken ortak tuzaklardan nasıl kaçınılacaklarına dair özel ayrıntılar sağlar.
RNA ile çalışmak, bozulmaya karşı güçlü bir şekilde duyarlı olduğu için özel bir bakım gerektirir. Ribonükleaz kontaminasyonunu sınırlamak için atabileceğiniz basit önleyici adımlar vardır. RNase inhibitörü içeren bir temizlik maddesi ile kolayca tedavi edilebilen ayrı bir RNA iş istasyonu genellikle yararlıdır. Numuneleri işlerken her zaman eldiven takmak ve RNase içermeyen sertifikalı sarf malzemelerinin kullanılması gereklidir. Su başka bir yaygın kontaminasyon kaynağı olduğundan, taze arıtılmış su kullanmak ve 0,22 μm filtre kullanarak tüm çözümleri sterilize etmek en iyisidir.

<table><tbody><tr><td>0,4 mm 34 kuyucuklu</td><td>tarak BioRad</td><td>1653848</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm ara parça</td><td>BioRad</td><td>1653812</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>KD Medikal</td><td>RGF-3130</td><td></td></tr><tr><td>1M Magnezyum Klorür</td><td>KD Medikal</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH 8.0</td><td>KD Medikal</td><td>RGF-3360</td><td></td></tr><tr><td>%40 Akrilamid/Bis Solüsyonu 29:1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610146</tr><tr><td>5M Sodyum Klorür</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3720</td><td></td></tr><tr><td>amonyum persülfat (APS)</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-1G</td><td></td></tr><tr><td>borik asit</td><td>Sigma</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol mavi sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabaklar</td><td>Thomas Scientific</td><td>1188K51</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer SQ3 Sıralayıcı</td><td>Hoefer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü J Yazılım</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr> <tr><td>Etiketli RNA oligonükleotidleri</td><td>IDT</td><td>Özel Sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Pharmacia EPS 3500 Güç Kaynağı</td><td>Pharmacia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 0.22 um</td><td>Filtre Kırlangıç</td><td>5FCP00525</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>tris tabanı</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 jel görüntüleyici</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf DEPC Su Canlandırıcı</td><td></td><td></td> 750023 <td></td></tr><tr><td>Ultra Saf Gliserol</td><td>İnvitrojen</td><td>19E1056865</td><td></td></tr><tr><td>üre</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>U15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

küçük nükleotit substratlarının polinükleotid fosforilasyonunun Ölçülmesini radyoaktif olmayan tsay

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polinükleotid kinazlar (PNKs) DNA ve RNA oligonükleotidlerinin 5' hidroksil ucunun fosforilasyonını katalize eden enzimlerdir. PNK'ların etkinliği doğrudan veya dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ölçülebilir. Burada sunulan bir floresan etiketli oligonükleotid substrat ve poliakrilamid jel elektroforez dayanan PNK aktivitesini ölçmek için doğrudan, in vitro bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, fosforlu ürünlerin çözünürlüğünü sağlarken, radyoetiketli yüzeylerin kullanımından kaçınılır. Protokol, fosforilasyon reaksiyonu nasıl ayarlanacağını, büyük poliakrilamid jellerinin nasıl hazırlanacağını ve çalıştırılabildiğini ve reaksiyon ürünlerinin nasıl ölçülmesini ayrıntılarıyla anlatır. Bu sataşma en teknik olarak zorlu kısmı dökülen ve büyük poliakrilamid jelleri çalışan; böylece, ortak zorlukların üstesinden gelmek için önemli ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu protokol Grc3 için optimize edildi, bağlayıcı ortağı ile zorunlu bir pre-ribozomal RNA işleme kompleksi içine monte bir PNK, Las1 nükleaz. Ancak, bu protokol diğer PNK enzimlerinin aktivitesini ölçmek için uyarlanabilir. Ayrıca, bu tetkik de reaksiyonun farklı bileşenlerinin etkilerini belirlemek için değiştirilebilir, nükleozit trifosfat gibi, metal iyonları, ve oligonükleotidler.

Sabit miktarda Las1-Grc3 kompleksi bulunan ATP titrasyonunun jelini inkar eden başarılı bir temsilci Şekil 1'degösterilmiştir. Enzimin eklenmesi, SC-ITS2 RNA substratının Las1 aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına (5-OH C2 RNA) yol açtı. ATP'nin eklenmesi yle C2 RNA parçası Grc3 PNK (5-P C2 RNA) tarafından fosforlandı. Denaturing jellerde fosforilasyonlu RNA fosforlu olmayan muadili daha hızlı göç eder. Şeki...

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Bu yöntem, DNA veya RNA moleküllerinin beş asal ucunun fosforilasyonuna ilişkin anahtar soruları polinükleotid kinaz olarak bilinen özel bir enzim sınıfı ile yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, DNA ve RNA yüzeylerinde çok küçük değişiklikleri tespit etme çözünürlüğüne sahip olmasıdır. RNA enzimkinaz reaksiyonlarını hazırlayarak başlayın.Her reaksiyon için, 500 nanomolar RNA substrat bir mikrolitre birleştirin. 8.3 mikrolitre 130 nanomolar son bir, GRC üç ve beş milimolar EDTA 0.2 mikrolitre. Isı bloğunu 37 dereceye ayarlayın.Daha sonra konsantrasyon serisinden bir ATP alt stokunun 0,5 mikrolitresini bir RNA enzim karışımıyla karıştırın ve reaksiyonu ısı bloğuna yerleştirin. Reaksiyonları karıştırmaya ve on saniye aralıklarla ısı bloğuna yerleştirmeye devam edin. Isı bloğunda 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her reaksiyonu 10 mikrolitre üre yükleme boyası ile şişirerek söndürün.Hemen aşağı analizi gerçekleştirmek veya negatif 20 santigrat derece daha sonraki bir tarihte analiz edilecek reaksiyonlar saklayın. %15 denaturing akrilamid jel çözeltisi hazırlamak için, 22,5 mililitre önceden karıştırılmış 40%29 ile bir akrilamid/bis akrilamid çözeltisini birleştirin. On x TBE altı mililitre.28.8 gram üre. Ve toplam 59 mililitre lik bir hacimde serbest su layın. Sonra yavaşça çözüm karıştırın.Çözeltiyi mikrodalgafırında 20 saniye ısıtın. Karıştırın ve hemen başka bir 20 saniye için mikrodalga geri dönün. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi hafifçe karıştırın.Cam kabı, cam kabıçevreleyen soğuk su seviyesinin cam kabın içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olmak için beş dakika boyunca soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirin. Çözelti soğuduğunda, partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını temizlemek için 0,2 mikrometrelik tek kullanımlık filtrasyon ünitesi ile filtreleyin ve gazdan arındırın. Kısa ve uzun cam bir tabağı sabun ve suyla yıkayın ve her tabayı %95 etanol ile püskürtün ve nemi gidermek için camı silin.Uzun plakayı bir kutunun üzerine koyarak yedek tezgahın üstünden yükseltin. Daha sonra plakanın uzun kenarları boyunca 0,4 milimetrelik boşlukkonumlandırın. Kısa plakayı uzun plakanın üzerine yerleştirin, kısa plakanın kenarlarının, uzun plakanın ve boşluklayıcıların hizalandığından emin olun.Daha sonra her iki tarafı üç eşit aralıklı metal kelepçeyle kelepçele. Akrilamid çözeltisine 24 mikrolitre TEMED ekleyin ve karıştırın. Sonra% 10 APS 600 mikrolitre ekleyin ve hemen cam plakalar arasında çözüm dökün.Cam plakalı sandviç arasına akrilamid çözeltisi dökmek gerçekten zor olabilir. Hava kabarcıkları önlemek için, çözüm dökerken cam plakalı sandviç dokunun. Dikkatle cam tabak sandviç üstüne temiz bir 32-well tarak ekleyin.Ve akrilamidin 30 dakika polimerleşmesine izin verin. Jelçalıştırmak için, 75 santigrat derece ısı bloğu ayarlayın. Metal kelepçeleri çıkarın.Ve iyice yıkayın ve cam tabak sandviç kuru. Plakalı sandviçi ve jel aparatı ile kısa plakayı öne bakacak şekilde yerleştirin ve 10 X TBE'nin 100 mililitresini 1,9 litre RNase serbest su ile birleştirerek 0,5 X TBE çalışan tampon hazırlayın. Cihazın üst ve alt odalarına çalışan tampon 600 mililitre ekleyin.Taraktan yavaşça çıkarve kuyuları bir şırınga ile iyice durulayın. Jeli 30 dakika boyunca 50 Watt'ta önceden çalıştırın. Sonra kuyuları tekrar durulayın.Post söndürme reaksiyonları spin ve üç dakika boyunca 75 santigrat derece onları kuluçka. Darbe dönüşünü tekrarlayın ve her numunenin 10 mikrolitresini hemen jelüzerine yükleyin. Sonra 50 Watt'ta jeli üç saat çalıştırın.Çalışma bittiğinde, güç kaynağını kapatın ve cihazın üst haznesini boşaltın. Cam plakalı sandviçin dış tarafını yıkayın ve kurutun. Sonra folyo ile kaplayın ve görüntüleme için bir lazer tarayıcı aktarın.Cam plakalı sandviçi lazer tarayıcının sahnesine monte edin. İstenilen zemin için uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın ve jeli görüntüleyin. Burada gösterilen son bir GRC üç karmaşık sabit bir miktar ile ATP bir titrasyon temsilcisi başarılı denaturing jel.Enzimin eklenmesi, Saccharomyces cerevisiae ITS iki RNA substratının son bir aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına yol açtı. ATP'nin eklenmesiyle C2 RNA parçası GrC3 PNK tarafından fosforlandı. C2 RNA parçasının fosforilasyonunu görselleştirmek için, göreceli miktarda fosforilasyonsuz ve fosforlu C2 RNA ATP konsantrasyonuna karşı çizilmiştir.Temsilcimiz başarısız denaturing jel burada gösterilmiştir. 21 nükleotit RNA substratı, fosforilasyonlu ürünle örtüşen ve fosforilasyonun doğru bir şekilde ölçülmesini imkansız hale getiren bozunma ürünleri içeriyordu. Buna karşılık, jelin bu alanı fosforlu muadili doğru nicelliği engelleyen herhangi bir ek RNA türü içermediğinden, en kısa RNA bozunma ürünü başarıyla analiz edilebilir.Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, numunenizin eşit şekilde yüklendiğinden emin olmak için jel kuyularını durulamaktır. Bu yordamı takiben bir RNA ciro deneyi yapılabilir. RNA bozulma oranlarını ölçmek için, fosforilasyon genellikle RNA bozulmasının başlatılmasını işaretler.Bu teknik, polinükleotid kinazların aktivite özgüllüğü ve kinetikleri hakkında ayrıntılı soruların cevaplanmasının önünü açmektedir.

nonradioactive-assay-to-measure-polynucleotide-phosphorylation-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, fosforile RNA türlerinin fosforile olmayan muadillerinden ayrılması için denatüre edici bir poliakrilamid jel elektroforezi gösteriyoruz. RNA türleri, jel üzerinde lazer tespiti için floresan olarak etiketlenmiştir.

RNA Analizi için Üre Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Denatüre Edilmesi: Floresan Etiketli Fosforile RNA Oligonükleotidlerini Fosforile Olmayan Eşdeğerlerinden Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu video, tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak protein fosforilasyonunun hassas bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Polietilen glikol-biyotinin işlevselleştirilmesi ve etiketli antikorların kullanılması, fosforile tirozinin özgüllük ile saptanmasını arttırır.

Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Burada açıklanan protokol, farklı koşullar altında kültürlenen kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinde pürin metabolizmasını ölçmek için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanan kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder.

HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör

Saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir nitroselüloz bağlanma testini rapor ediyor ve gösteriyoruz. Yöntemimiz, geleneksel SDS-PAGE tabanlı tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir ve bu önemli proteinleri karakterize etmek için değerli bir alternatif sunar.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

İnorganik polifosfat, gram pozitif, gram-negatif ve Mikobakteriyel türler de dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde hızlı miktar için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Öğrenin, polinükleotid kinazların küçük DNA ve RNA substratlarındaki aktivitesini radyoaktif olmayan yöntemle ölçün. Bu hassas teknik, beş uç fosforilasyonundaki küçük değişiklikleri tespit eder.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Daha fazla video keşfet