Name: İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin ileri genetik ekran yöntemiyle Arabidopsis'te kalsiyum sinyal yolaklarında yer alan yeni genleri belirlemeyi. EMS mutagenezisi ve aequorin raportörü kullanılarak bitki savunma mekanizmaları araştırılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Bitki Genom Araştırma Enstitüsü - Bitki büyümesi için Fitotron Tesisi, video çekimi için Bombay Locale ve e-kaynaklara erişim sağlayan Biyoteknoloji- eLibrary Konsorsiyumu Bölümü'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Ulusal Bitki Genom Araştırma Çekirdek Hibe Enstitüsü, Max Planck Gesellschaft-Hindistan Ortak Grup programı ile desteklenmiştir; ve CSIR-Junior Araştırma Bursu (D.M ve S.M.'ye) ve Biyoteknoloji-Junior Araştırma Bursu Bölümü (R.P.'ye).

1. EMS mutagenez ve tek soy bazlı tohum toplama (1-3 ay)
<ol><li>EMS mutagenez (M0 tohum) için aequorin 150 mg tohum (~7500) tartın. Bir kontrol olarak kullanılmak üzere tohum başka bir 150 mg tartın.</li>
	<li>Tohumları 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 25 mL %0,2 EMS (v/v) (DİkKAT) veya 25 mL otoklavlı su (kontrol için) ekleyin. NOT: Etil-metan sülfonat, bitki materyalini mutasyona uğratan kimyasal bir maddedir.</li>
	<li>Tüpü parafilm ile kapatın ve alüminyum folyoya sarın. Tüpü oda sıcaklığında 18 saat boyunca uçuçta döndürün.</li>
	<li>Tohumların yerleşmesine izin ver. EMS çözeltisini dikkatlice çıkarın ve eşit hacimlerde 1 M NaOH içeren bir atık kabına atın (NaOH, EMS'nin atılması güvenli hale getirilmesini sağlayan EMS'yi nötralize etmeye/inaktive etmeye yardımcı olur). Kullanılan plastik leri 1 M NaOH çözeltisinde atın. NOT: 24 saat sonra, tehlikeli madde laboratuvar uygulamalarına göre atar atın.</li>
	<li>Mutajenize edilmiş tohumları en az 8 kez 40 mL otoklavlı su ile iyice yıkayın. Yukarıda belirtildiği gibi bir NaOH atık kabına su içeren EMS atın.</li>
	<li>Son yıkama için 40 mL 100 mM sodyum tiyosülfat ekleyin ve EMS izlerini gidermek için 3 kez durulayın.</li>
	<li>Tohumları 40 mL otoklavlı suda ıslatın ~ 1 saat tohumlardan EMS dağıtmak için ve sonra tamamen kuruyana kadar filtre kağıdına yerleştirin.</li>
	<li>Tohumları mikrosentrifüj tüpüne aktarın ve tohumları 4 °C'de 40 mL otoklavlı suda 2-4 gün boyunca katmanlayın. Bu tohum atıllığı kırma yardımcı olur ve homojen büyüme sağlar.</li>
	<li>Hem mutajenize tohumları (M0)hem de kontrol tohumlarını toprağa (toprak bileşimi: agropet: soilrite, 1:1) aktarın ve 16 saat ışık/8 h karanlık fotoperi, 150 μmol−m−2−s−s −1 ve ~%70 bağıl nem ile büyüme odalarına aktarın.</li>
	<li>Mutagenezin başarılı olup olmadığını belirlemek için çimlenme hızının ve fide büyümesinin azalmasını ve klorofil leziz18'i arayın (Şekil 1A).18 Bu fizyolojik ve gelişimsel farklılıkları belirlemek için kontrol tesisleri ile mutajenize edilmiş bitkileri karşılaştırın. NOT: M1 bitkilerinden tohum hasat için farklı yöntemler kullanılabilir. Bu protokolde tek soy bazlı tohum toplama yöntemini kullandık. Her M1 tesisine A1'den A3500'e kadar benzersiz bir numara verilir.</li>
	<li>Ayrı ayrı numaralanmış bitkileri ayrı ayrı bitki hatları olarak koruyun(Şekil 1B).</li>
	<li>Olgunlaşma üzerine, bu bireysel mutant bitkilerden tohum hasat ve bireysel M1 hatları olarak saklamak(Şekil 2). Tek soy bazlı tohum koleksiyonundan, 3500 M 1 hattının 3500 M1 hattının tarandığı yaklaşık 5000 M1 hattı elde ettik.</li>
</ol>2. Mutantları seçmek için yüksek iş tarama (8 ay)
<ol><li>Seçilen bir uyarıcıya Ca2+ yanıtına dayanan yeni mutantları tanımlayın. Burada, bir örnek olarak H2O2 kullanılır.</li>
	<li>Mutantları tanımlamak için M2 neslini tarar. Resesif mutantlar EMS mutagenezi14üzerine M2 kuşağında 1/8 frekansta ayrıştırık olduğundan, 8-12 M2-ayırıcı bitkilerin taranması bir M1 hattını kaplar ve homozigot bir resesif mutantı tanımlar (12 fide kullanarak mutant bulma olasılığını artırır). Her bağımsız M1 serisinden, Ca2+ yanıtı için 12 M2 fidesini H2O2 (M1 satırıbaşına 12 M2 fide) test edin.</li>
	<li>Yüksek iş biçen tohum sterilizasyonu ve hidroponik bitki büyüme protokolükullanın 19. 24 kuyulu doku kültür plakasının tek tek kuyularında M1 serisi başına yaklaşık 12-15 M2 tohum yerleştirin ve klor gazı (40 mL %12 sodyum hipoklorit ve hidroklorik asit, 3:1, v/v) bir dezikkatöre bir duman kaputunda 4 saat sterilize edin. İşlemden sonra, kurutucuyu açın ve klor gazının buharlaşması için bir gecede bırakın.</li>
	<li>Sterilizasyondan sonra, plakaları dışarı getirin ve tek tek kuyulara sıvı 1/2 MS ortam (agarsız yarı mukavemetli MS) ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve tohumları 4 °C'de 2-4 gün boyunca yapıştırın ve tohumları %70 bağıl nem oranıyla 20-22 °C'de 10 saat Açık/ 14 saat karanlık fotoperiyotla bir büyüme odasına taşıyın.</li>
	<li>Fideler 8-12 günlük olduktan sonra, her çizgiden ayrı ayrı 12 M2 fideyi 96 kuyulu bir luminometre plakası koyun. Ca2+ yanıtını H2O2'yeölçmek için bir luminometre plaka okuyucu kullanın.</li>
	<li>Fide transferinden sonra, 150 μL 5-10 μM coelentrazine çözeltisi (metanoldeki 5 mM'lik bir stoktan otoklavlı suda seyreltilmiş) (DİkKAT) koyu/düşük ışıklı bir alanda ayrı kuyularda ve 21 °C'de karanlıkta 8 saat saklayın. NOT: Coelentrazine apo-aequorin bağlanır ve fonksiyonel aequorin için yeniden bir protez grubudur. Coelentrazine ışığa duyarlıdır ve bu nedenle ışıktan korunan koyu renkli şişelerde saklanır.</li>
	<li>Ertesi gün, bir uyarıcı olarak 10 mM H2O2 kullanarak mutant ekran gerçekleştirmek ve sonraki Ca2 + tepki ölçmek.</li>
	<li>24 kuyunun eşzamanlı ölçümü için, arka planı 1 dakika ölçen, ardından uyaran ilavesi (40 μL) ve 10 dk ölçümü, ardından toplam aequorin deşarjı (150°L 20 etanolde2 MCaCl) ile 1-2 dakika boyunca ölçülür otomatik bir kinetik program oluşturun. NOT: Ölçülen Ca2+ miktarını ölçmek için toplam aequorin için bir son deşarj ve fonksiyonel aequorin için ek kontrol gereklidir. Son deşarj 1-2 dk kısa bir çalışma ve önemli bitki ölümüne neden olmaz. Alternatif olarak, bitkiler deşarj adımından sonra ölürse, belirli M1 hattını yeniden taranır ve deşarj olmadan kurtarın. Bu tür mutantlar deşarj adımı kullanılarak M3 ve M4 nesillerinde teyit edilebilir.</li>
	<li>Her satırı 7 s aralığında ölçen ve ölçüm noktası başına 300 ms entegrasyon süresi ölçen 24 iyi formatlı bir tarama yöntemi kullanın. Karşılaştırma ve mutant değerlendirilmesi için her satırda kontrol olarak bir vahşi tip fide kullanın. NOT: M2 fidesi içeren tek bir 96 kuyu plakası 8 ayrı M1 çizgisini (8 M1 *12=96 M2)kapsayacak ve 2,5 saat taranabilir ve her gün 32 M1 hat, ayda 640 M1 bitki taranacaktır. Bitkiler hazır olduktan sonra tüm tarama işlemi yaklaşık 8 ay sürer.</li>
	<li>H2O2ile ca2+ yanıtı kaybına veya azaltılmış yanıta göre mutantları tanımlayın. Seçilen mutantları antibiyotik bazlı bir yıkama işlemi yle kurtarın. Fideyi 25 mg/L sefotaksim çözeltisi ile iki kez yıkayın ve 1/2 MS agar'da 25 mg/L sefotaksim içeren kurtarma ortamına aktarın.</li>
	<li>Bir mutant bitki elde etmek için 10 saat ışık / 14 saat karanlık fotoperiod plakaları büyütün. Sefotaksim yıkama fide üzerinde herhangi bir zararlı mikroorganizmaların kaldırmak için yardımcı olur. Yeniden yapılanma sonrası fideler mühürsüz tutulduğundan, steril duruma geri aktarılırken kontaminasyonu en aza indirin.</li>
	<li>Homozigot M3 popülasyonunu elde etmek için mutant bitkiyi toprağa aktarın.</li>
</ol>3. Veri analizi ve mutant tanımlama (1-3 ay)
NOT: Yukarıdaki yöntemden elde edilen ölçümler göreli ışık birimlerinde (RLU) bulunmaktadır.
<ol><li>[Ca2+]cyt konsantrasyonu hesaplamak için aşağıdaki konsantrasyondenklemini kullanın 20. pCa = 0.332588(−log (L/Lmax)) + 5.5593 Luminesans sayıları () ve toplam kalan sayımlar(max).</li>
	<li>Elde edilen pCa değerlerini 106ile çarparak [Ca2+]cyt değerlerine dönüştürün. Daha sonra grafiksel ca2 + yanıt putatif H2O2 mutantlar tanımlamak için bir aequorin (transgenik Col-0 aequorin) kontrol karşı arsa.</li>
	<li>Kurtarma fidelerinde kayıp veya azalan yanıt gösteren H2O2 uygulaması kurtarıldı.</li>
	<li>Olgunlaşma üzerine, kurtarılan mutant tohumları hasat ve M3 fideh2O2 yanıt için yeniden ekran. Tüm 12 M3 fideler anne bitki benzer bir Ca2 + yanıt gösteriyorsa, homozigot M3 mutant popülasyon olarak nüfus düşünün. Tüm 12 fide böyle bir yanıt görünmüyorsa, o zaman M4 nesil götürün ve homozigot nüfus elde etmek için yeniden ekran.</li>
	<li>Homozigot bir bitki hattı elde edildikten sonra, yeni nesil sıralama kullanarak değiştirilmiş fenotip giden geni tanımlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+The+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: The lead currency of plant information processing.</a> The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Wasternack, C., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonates%3A+biosynthesis%2C+perception%2C+signal+transduction+and+action+in+plant+stress+response%2C+growth+and+development.+An+update+to+the+2007+review+in+Annals+of+Botany%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany.</a> Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).</li>
<li>Kiep, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cytosolic+Ca2%2B+elevation+is+activated+upon+wounding+and+herbivory+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+Luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>White, P. J., Broadley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Calcium in plants.</a> Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).</li>
<li>Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+impaired+in+intracellular+calcium+elevation+is+sensitive+to+biotic+and+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).</li>
<li>Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The language of calcium signaling.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).</li>
<li>Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+calcium+signalling+and+early+signalling+elements+during+defence+responses+to+microbe-+or+damage-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns.</a> The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).</li>
<li>Downie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals+in+plant+immunity%3A+a+spiky+issue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium signals in plant immunity: a spiky issue.</a> New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).</li>
<li>Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+interplay+of+Ca2%2B+and+ROS+signaling+in+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response.</a> Plant Science. 283, 343-354 (2019).</li>
<li>McAnish, M. R., Pittman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+calcium+signature%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Shaping the calcium signature.</a> New Phytologist. 181, 275-294 (2009).</li>
<li>Colbert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-throughput+screening+for+induced+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">High -throughput screening for induced point mutations.</a> Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).</li>
<li>Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoornneef%2C+M+%22Molecular+Plant+Biology%22">Molecular Plant Biology</a>. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).</li>
<li>Page, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+K+%22G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+in+Plants.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).</li>
<li>Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+aequorin+monitors+cytosolic+calcium+transients+in+soybean+cells+challenged+with+beta-glucan+or+chitin+elicitors%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors.</a> Planta. 207 (4), 566-574 (1999).</li>
<li>Arisha, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methane+sulfonate+induced+mutations+in+M2+generation+and+physiological+variations+in+M1+generation+of+peppers+%28Capsicum+annuum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.).</a> Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Rentel, M. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+calcium+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).</li>
<li>Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagenesis+of+seed+and+vegetatively+propagated+plants+using+EMS%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).</li>
<li>Espina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Phenotypic+Screening+of+an+Ethyl+Methane+Sulfonate+Mutant+Population+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetics+in+Arabidopsis%3A+Finding+Mutations+that+Cause+Particular+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).</li>
<li>Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaple%2C+J+%22Circadian+Rhythms.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology</a>. Rosato, E. , 362(2007).</li>
<li>Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQu%2C+LJ+%22Arabidopsis+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).</li>
<li>Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeyser%2C+HMO+%22Arabidopsis%3A+the+Complete+Guide+%28Electronic+v.+1.4%29%22">Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4)</a>. Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).</li>
<li>Pauly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+together+with+the+cytosol+generates+patterns+of+specific+cellular+calcium+signatures+in+tobacco+suspension+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells.</a> Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).</li>
<li>Mithöfer, A., Mazars, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+measurements+of+intracellular+Ca2%2B-signatures+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells.</a> Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).</li>
<li>Mehlmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signatures+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation.</a> The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).</li>
<li>Sello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Ca2%2B+fluxes+into+and+across+thylakoids+revealed+by+thylakoid-targeted+aequorin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes.</a> Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-localized+BICAT+proteins+shape+stromal+calcium+signals+and+are+required+for+efficient+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis.</a> New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+receptor+for+extracellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant receptor for extracellular ATP.</a> Science. 343 (6168), 290-294 (2014).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCA1+mediates+osmotic-stress-evoked+Ca2%2B+increases+vital+for+osmosensing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis.</a> Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin beyan etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

EMS mutagenez popülasyonda mutasyonlar oluşturmak için güçlü bir araçtır. EMS kullanan klasik ileri genetik ekranlar iki önemli nedenden dolayı yeni genleri tanımlamak için etkili bir araç olmuştur: birincisi, gen kimliği üzerinde önceden varsayımlar gerektirmez ve ikinci olarak, herhangi bir önyargı tanıtmak yok. EMS, T-DNA eklemeleri, radyasyon vb. gibi tarama popülasyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler vardır. Tüm yöntemler arasında EMS tabanlı mutagenezinin diğer yöntemlere göre çok az avantajı vardır. İlk olara...

Biyotik veya abiyotik uyarıcı algısı üzerine sitosolik kalsiyum (Ca2 +) konsantrasyonunda bir değişiklik birçok sinyal yolları 1 aktive bir iyi çalışılmış erken sinyalolaydır 1,2,3,4. Bazal istirahat durumunda bir hücre sitosol daha düşük Bir Ca2 + konsantrasyonu korur ve çeşitli hücre içi organeller de Ca2 + fazla sekanslar ve sarp Ca 2+ gradyan5,yol açan hücre dışı apoplast ,6. Sinyal algısı üzerine, Ca2 + düzeyleri ekstrasellüler ve / veya hücre içi kaynaklardan Ca2 + bir akını nedeniyle sitosol artış ve bir uyarıcı özel kalsiyum imza oluşturmak7,8,9. Sitosol Ca2 + yükseklikleri birçok uyarantarafından aktive edilir, ancak özgüllük ca2 serbestfarklı mağazalar tarafından korunur + , benzersiz bir Ca 2+ imza ve uygun sensör proteinleri10,11.
Mutagenez için alkilleyici ajan, etil metan sülfonat (EMS) kullanımı, bir süreçte yer alan birden fazla bağımsız geni tanımlamak için klasik ileri genetik ekranlarda güçlü bir araçtır. EMS, c'den T'ye ve G'yi genomun her 125 kb'sinde rastgele a geçişlerine neden olan ve 1 bp'lik bir değişim üreten kimyasal bir mutajentir. EMS mutagenezi12genom başına ekleme/silme (InDel) veya tek nükleotit polimorfizm (SNP) olmak üzere 1000 tek baz çifti değişikliğine neden olur. EMS'ye bağlı mutasyonlar, lokus başına 1/300 ile 1/30000 arasında değişen mutasyon frekansı ile birden fazla nokta mutasyonudır. Bu, belirli bir gende mutasyon bulmak için gereken M1 bitkilerinin sayısını azaltır. 2000-3000 Bir M1 tohum popülasyon aralığı genellikle Arabidopsis thaliana13ilgi mutasyonları elde etmek için kullanılır,14.
Aequorin transgenics Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ekotip bitkiler p35S-apoaequorin (pMAQ2) sitosol15ifade vardır. Aequorin apoprotein ve luciferin molekülü, coelenterazin oluşan bir protez grubu oluşan bir Ca2 + bağlayıcı proteindir. Ca2+ aequorin bağlanması, hangi üç Ca2 + bağlayıcı EF-hands siteleri vardır, coelenterazine okside ve dioksettanon ara vermek için siklize sonuçları, karbondioksit ve tek-heyecanlı coelenteramideserbest eşlik eden protein konformasyonel bir değişiklik izledi16. Coelenteramid böylece üretilen bir mavi ışık yakar (λmax, 470 nm) luminometer tarafından tespit edilebilir17. Son derece hızlı Ca2 + yükseklikleri böylece gerçek zamanlı olarak ölçülebilir, ve hızlı ileri genetik ekranlar için istismar. Bu protokol, Ca2+ imzasıyla ilgili yeni kilit oyuncuları tanımlamak için kalsiyum tepkisinin özgüllüğünü kullanmayı amaçlamaktadır. Bu görevi başarmak için transgenik aequorin'de EMS mutagenezkullanır ız ve değiştirilmiş Ca2+ sinyalizasyonuile ilişkili SNP'leri tanımlarız. Protokol, uyaran ların eklenmesi üzerine Ca2+ yükseklikleri göstermeyen veya küçülten mutantları tanımlar. Bu mutantlar daha sonra Ca2 + yanıtı sorumlu genleri tanımlamak için eşlenebilir. Bu yöntem, bitkilerde Ca2+ yüksekliğiile sonuçlanan her türlü sıvı uyaran için geçerlidir. Ca2+ yüksekliği bitki savunma sinyal yolundaki ilk tepkilerden biri olduğundan, yukarı akım tepki bileşenlerinin belirlenmesi dirençli bitkiler geliştirmek için genetik mühendislik adayları sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>Fide yetiştirmek için</td> <td>24 kuyulu doku kültürü plakası</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td></tr><tr><td>Luminometre ölçümleri için</td><td>96 kuyulu beyaz kliniplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem Hindistan</td><td></td> bitki <td>büyümesi için</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>deşarj için çözelti</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>aequorin için protez grubu</td></tr><tr><td>Tohum</td><td>mutajenezi için</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Deşarj çözeltisi için</td><td>analitik reaktif</td><td>1170</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>1.93001.0521</td><td>sterilizasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Kalsiyum yükselmesi için uyarıcı olarak</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15465</td></tr><tr><td>Luminoskan yükselişi</td><td>Thermo Scientific</td><td>5300172</td><td>aequorin lüminesans ölçümü</td></tr><tr><td>MES tamponu</td><td>Himedia</td><td>RM1128-100G</td><td>bitki büyümesi</td></tr><tr><td>Murashige ve skoog media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>bitki büyümesi</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>EMS'yi nötralize etmek için</td></tr><tr><td>Sodyum hipoklorit</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>1.93607.5021</td><td>sterilizasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum tiyosülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>adım 1.6'da tohum yıkama için</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem Hindistan</td><td></td><td>bitki büyümesi için</td></tr><tr><td>Kare saksılar</td><td>Lab Chem Hindistan</td><td></td><td>Bitki büyümesi için</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Fide kurtarma için S0389</td><td>bitki büyümesi</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td></td></tr></tbody></table>

İleri genetik ekran kullanarak transgenik kalsiyum reporter aequorin kalsiyum sinyalyeni hedefleri belirlemek için

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

İleri genetik ekranlar çeşitli biyolojik yollarda yer genetik bileşenlerin tarafsız belirlenmesinde önemli araçlar olmuştur. Ekranın temeli ilgi bir fenotip ile taranabilir bir mutant popülasyon oluşturmaktır. EMS (etil metan sülfonat) herhangi bir süreçte yer alan birden fazla gentanımlamak için klasik ileri genetik ekranda rastgele mutasyon indükleyen yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Sitosolik kalsiyum (Ca2+) yükseklik stres algısı üzerine aktive olan önemli bir erken sinyal yoludur. Ancak Ca2+ reseptörlerinin, kanallarının, pompalarının ve ışınlayıcılarının kimliği birçok çalışma sisteminde hala zordur. Aequorin, Aequorea victoria'dan izole edilmiş ve Arabidopsis ile ifade edilen hücresel kalsiyum muhabiri proteindir. Bunu sömürerek, aequorin transgenik eMS-mutajenize bir ileri genetik ekran tasarladık. Mutant bitkilerden elde edilen tohumlar toplandı (M1) ve ilgi fenotip için tarama ayrıştırma (M2)popülasyonunda yapıldı. 96-iyi yüksek-throughput Ca2 + ölçüm protokolü kullanılarak, çeşitli yeni mutantlar farklı bir kalsiyum yanıtı var ve gerçek zamanlı olarak ölçülür tespit edilebilir. İlgi fenotipleri olan mutantlar kurtarılır ve homozigot mutant bitki popülasyonu elde edilene kadar yayılır. Bu protokol, Ca2+ muhabir arka planında ileri genetik ekranlar için bir yöntem sağlar ve yeni Ca2+ düzenlenmiş hedefleri tanımlar.

EMS popülasyonu H2O2 indüklenen Ca2+ yüksekliği için tarandı. Daha önce de belirtildiği gibi, her M1 serisinden 12 ayrı M2 fidesi tarandı. Şekil 3'te,12 ayrı M2 fidesini gösteren her panelile böyle bir M1 çizgisi çizilir. Bir vahşi tip aequorin karşılaştırma ve mutant yanıtı değerlendirmek için kontrol olarak kullanılır. 1:7 (mutant: mutant olmayan) oranında bir resesif mutant ayrılır. M1 hattı başına 12 ...

Ca2+ yüksekliğine dayalı ileri genetik ekran, bitkilerde kalsiyuma bağımlı sinyal yollarında yer alan genetik bileşenlerin tanımlanmasına yol açar.

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Bu protokolün amacı, kalsiyum sinyalizasyonunda rol oynayan yeni genlerin belirlenmesinde kullanılabilecek bir yöntem belirlemektir. Bunu yapmak için, klasik ileri genetik ekranı kullanırız. Kalsiyum sinyalizasyonu çeşitli bitki sistemlerinde önemli bir savunma tepki yoludur.Bu yolda yer alan genleri tanımlamak için klasik ileri genetik ekranı kullandık. Bu yöntemde, EMS bitki sistemlerinde rastgele mutasyonlar tanıtmak için bir alkilleyici ajan olarak kullanılacaktır. Gelişmiş mutant nesil daha sonra ilgi bir fenotip için tarama için kullanılabilir.İlginin fenotipi belirlendikten sonra nedensel gen eşlenebilir. Bu çalışmada, spektrumda kalsiyum muhabiri aequorin olan model bitki Arabidopsis'i kullanıyoruz. EMS mutagenez için aequorin 150 mg tohum ve kontrol olarak kullanılmak üzere başka bir 150 mg tohum ağırlığında.Tohumları 50 ml'lik falcon tüpüne aktarın ve %2 EMS veya otoklavlı su ekleyin. EMS kullanırken, kanserojen olduğu için dikkatli olun. EMS kullanırken koruyucu dişliler giyilmeli ve her türlü dökülme önlenmelidir.Falcon tüplerini parafinle kapatın ve alüminyum folyo ile sarın. Oda sıcaklığında 18 saat boyunca boru ucunu ucunda döndürün. Tohumların yerleşmesine ve EMS çö

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve...

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Mevcut protokol, yüksek verimli ilaç taraması ve toksisite testi için iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerde (iPSC-CM'ler) tetiklenen hücresel aktivitenin tüm optik kontrolünü ve gözlemini açıklamaktadır. Zaman ve uzaydaki fenotipik kalıpların multi-parametrik nicelleştirilmesi gösterilmiştir. İlaçların saatler boyunca uzun vadeli etkileri veya günler boyunca sıralı ölçümler gösterilmiştir.

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Keşfedin ileri genetik ekran yöntemiyle Arabidopsis'te kalsiyum sinyal yolaklarında yer alan yeni genleri belirlemeyi. EMS mutagenezisi ve aequorin raportörü kullanılarak bitki savunma mekanizmaları araştırılır.

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

Daha fazla video keşfet