Name: Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Öğrenin beyin tümörlerinden metabolit ekstraksiyonu için katı faz mikroekstraksiyon (SPME) yöntemini. Bu teknik, gliom ve meningiom örneklerinde hızlı intraoperatif tanı ve biyobelirteç keşfi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Ulusal Bilim Merkezi'nden Grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar MilliporeSigma, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya, bu çalışmada kullanılan SPME cihazları sağlamak için bir iş kabul etmek istiyorum. Merck'in yaşam bilimi işi ABD ve Kanada'da MilliporeSigma olarak faaliyet göstermektedir. Ayrıca, yazarlar Q-Exactive Focus orbitrap kütle spektrometresi erişim için Thermo Fisher Bilimsel teşekkür etmek istiyorum.
Yazarların katkıları: JB: numune hazırlama ve LC-MS parametrelerinin optimizasyonu, SPME-LC-MS deneylerinin performansı, veri analizi, istatistiksel analiz ve veri yorumu ve lipidomik kısmıyla ilgili el yazması hazırlama; PZG: hastanedeki numunelerin çoğunun koordinasyonu ve performansı, numune alma ve numune hazırlama parametrelerinin optimizasyonu, SPME-LC-MS deneylerinin performansı, veri analizi, istatistiksel analiz ve veri yorumu, metabolomik kısmıyla ilgili el yazması hazırlama; MG – numune hazırlama, LC-MS yöntemi ve lipidomik kısmı ile ilgili veri analizi optimizasyonu nda yardım; KG: SPME örneklemelerinin birlikte ifası ve örnekleme ve numune hazırlama optimizasyonu, metabolomik kısmıile ilgili SPME-LC-MS analizi; KC: hastanede çeşitli SPME örneklemelerinin gerçekleştirilmesi, örneklemenin optimizasyonunda yardım, metabolomik kısmıyla ilgili numune hazırlama ve veri analizi; KJ: hastanede çeşitli SPME örneklerinin performansı, lipidomik analizinde yardım; DP: cerrahi prosedürlerin gerçekliği, hastaların işe alınması; JF: cerrahi prosedürlerin performansı, hastaların işe alınması; MH: cerrahi prosedürlerin gerçekliği, araştırmanın klinik kısmının koordinasyonu; BB: konsept, projenin koordinasyon denetimi ve el yazması hazırlama, çeşitli örneklerin performansı

Burada sunulan çalışma, Toruń'daki Nicolaus Copernicus Üniversitesi Bydgoszcz'deki Collegium Medicum Biyoetik Komitesi tarafından onaylanmıştır (KB 628/2015). Her zaman bir laboratuvar önlüğü ve güvenlik eldivenleri ve gözlükler gibi (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) diğer gerekli kişisel güvenlik ekipmanlarını giymeyi unutmayın. Katı faz mikroekstraksiyon (SPME) problarının ekstraksiyon aşamasına dokunmayın.
1. SPME cihazlarının hazırlanması
<ol><li>Metabolomik ve lipidomikler için sırasıyla karışık modlu problar (lifler) kullanın. Biri metabolomik, diğeri lipidomik olmak üzere iki örnek seti toplayın.</li>
	<li>SPME probu kırparak probun kaplamasını optimum uzunluğa ayarlayın. Mevcut çalışmada, seçilen kaplama uzunluğu 7 mm idi. Çalışma altındaki tümörün büyüklüğüne göre lif in uzunluğunu seçin, tüm sorbent tümördülür olabilir sağlanması(Şekil 1).</li>
	<li>Probların kaplamalarını metanolle ıslatarak koşullandırma: ekstraksiyon işleminden önce en az 1 saat su 50:50 v/v karışımı. Lifleri klima çözeltisi içeren bir şişede numune alma bölgesine (örn. hastane) taşıyın.</li>
</ol>2. Örnek toplama prosedürü
<ol><li>SPME ekstraksiyonundan önce tümörü hiçbir şekilde yıkamayın veya geri çekmayın.</li>
	<li>Tümör alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede örnekleme ye başlayın (sunulan çalışmada 2 dk). NOT: Belirli bir tesisin yerinde kurulumuna bağlı olarak zamanı ayarlayın (araştırmacının çalışma alanının çalışma masasından uzaklığı) ve tüm çalışma boyunca sabit tutun. Tümör çıkarılması ve ekstraksiyon un başlaması arasında geçen süreyi en aza indirmek, kan dolaşımı incelenen dokudan kesildikten sonra bozulan kararsız metabolitlerin yakalanması için çok önemlidir.</li>
	<li>Oda sıcaklığında örnekleme yapın. Alternatif olarak, çıkarma işlemi gerçekleştirilirken numuneyi buzüzerine yerleştirin. Her iki durumda da, tüm numune kümesi için aynı koşulları koruyun.</li>
	<li>Sondayı şişeden çıkar.</li>
	<li>Lifleri sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC/MS) sınıfı su ile 5 s'lik su ile LC/MS dereceli suya batırarak yıkayın. Verilerin iyi tekrarlanabilirliğini sağlamak için lif takılmadan önce sorbentin kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>Mümkün olduğunca ayrı beyin tümör dokusuna lifleri yerleştirin, tüm ekstraksiyon fazı tümör içinde yer almasını sağlamak. NOT: Tümörün heterojen yapısını belirlemek için ekstraksiyonların çoğaltılması önerilir (Şekil 2). Örnek başına üç çoğaltma önerilir.</li>
	<li>Sondayı dokuda 30 dakika bekletin (zamanlayıcı ile ölçülür).</li>
	<li>Örneklenen tümör dışındaki kaynaklardan kaynaklanan eserlerin varlığıyla ilgili hata kaynaklarını ortadan kaldırmak için boş kontrolleri kullanın. Boş denetimler elde etmek için, lifleri yukarıda açıklandığı gibi aynı analitik iş akışına tabi takın, ancak örnekleme adımı olmadan (dokuya veya başka bir örnek/matrise ekleme) olmadan. Veri işleme adımında, çözücülerden veya elyaf üretiminden kaynaklanan kirleticilerden elde edilen sinyalleri dışlamak için bu liflerden çıkarılan analitleri bir "dışlama listesi" halinde derlayın. En az 3 boş çoğaltma kullanılması önerilir. NOT: Kontaminasyon riskini kontrol etmek için eldivenlerden, masalardan, cihazlardan veya kontaminasyon riski oluşturabilecek diğer yüzeylerden numune alınması gerekmektedir. Bu gibi durumlarda, lif hazırlama, çıkarma zamanı ve desorpsiyon protokolleri örnekler için aynıdır.</li>
	<li>Ekstraksiyon yapılırken, ekstraksiyon dan sonra probların depolanması için kullanılacak şişeleri etiketlendirin.</li>
	<li>30 dk sonra, beyin tümöründen lif(ler) çıkarın.</li>
	<li>Son ekstre sadece küçük moleküller ilerler, böylece son ekstre son dan kan veya hücre enkaz kalıntıları kaldırmak için LC / MS sınıf su onları batırarak 3 s su ile lifleri yıkayın. Kutup bileşiklerinin kaybına yol açabileceğinden daha uzun bir yıkama adımı önerilmez.</li>
	<li>Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) şişe kapağının ön yarık septasındaki lifleri, septayı alttan, kaplamalı olmayan ucuyla delerek hareketsiz hale getirin.</li>
	<li>Kapakta hareketsiz hale getirilen lifleri ayrı HPLC şişelerine koyun ve seçilen taşıma kabına yerleştirin.</li>
	<li>Boş denetimlere adanmış lifler için 2.11-2.13 adımlarını gerçekleştirin.</li>
</ol>3. Taşıma ve depolama
NOT: Numunelerin laboratuvara taşınması için çeşitli seçenekler mevcuttur. Bu bir sıvı azot Dewar veya kuru buz ile doldurulmuş polistiren kutu taşıma için kullanılması tavsiye edilir; alternatif olarak, buz paketleri hemen ve hızlı ulaşım için kullanılabilir.
<ol><li>Nakliye konteyner içinde lifler ile şişeleri yerleştirin.</li>
	<li>Laboratuvara vardıktan sonra, şişeleri hemen -80 °C veya -30 °C'lik bir dondurucuya SPME lifleri yerleştirin. Lifleri -30 °C'de 3 yıldan fazla veya -80 °C'de 5 yıl saklamayın.</li>
</ol>4. Metabolomik analiz için numune hazırlama
NOT: Bu adım yalnızca bir deneme için tüm numuneler toplandıktan sonra yapılmalıdır.
<ol><li>Enstrümantal analizden önce, desorpsiyon çözücü karışımını hazırlayın: asetonnitile:su 80:20 v/v.</li>
	<li>Dondurucudan karışık modlifler içeren şişeleri çıkar. Bunları metabolomik analiz için kullanın.</li>
	<li>Desorpsiyon için kullanılacak etiket şişeleri.</li>
	<li>2 mL şişeye yerleştirilen cam kesici uçlara desorpsiyon çözeltisinin (adım 4.1'de hazırlanmış) 300°L'lik pipeti.</li>
	<li>Kaplamayı ayrı bir kesici çözücüye tamamen batırarak ayrı bir kesici uçta yerleştirilen her bir elyaftan desorpsiyon yapın, ardından girdap kullanarak 120 dk'da 120 dakika boyunca çalkalayın.</li>
	<li>120 dk sonra (bir kez desorption tamamlandıktan sonra) probları ile kapakları çıkarın.</li>
	<li>Örnek kümesinden her numunenin 10 μL aliquot'larını karıştırarak QC numunesini hazırlayın. Örnek set boyutu deneysel tasarıma bağlıdır. Tüm örnekleri tek bir toplu olarak analiz etmek önemlidir.</li>
	<li>Şişeleri yeni kapaklarla kapatın.</li>
	<li>Şişeleri sıvı kromatografiyüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin (LC-HRMS) otoörnekleyicisine (4 °C) yerleştirin ve adım 5'e geçin. NOT: Kontrol boşlukları da dahil olmak üzere örneklerin enjeksiyon sırasını randomize edin. Aletin stabilitesini izlemek için her 8-10 numuneden sonra QC numunesi enjekte edin.</li>
</ol>5. Ters faz sıvı kromatografisi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (RPLC-HRMS analizi) kullanılarak metabolomik analizi
<ol><li>LC-HRMS analizi ve pozitif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Pozitif modda geçerli çalışmada kullanılan parametreler şunlardır: tetkik aralığı: m/z 80-1000; çözünürlük 70 000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; C-trap için zaman enjekte: otomatik; püskürtme gerilimi: 1,5 kV; S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: 25 V; skimmer gerilim: 15 V; kılcal damar sıcaklığı: 300 °C; kılıf gazı: 40 a.u.; aux gaz: 15 a.u.; aux gaz ısıtıcı sıcaklığı: 300 °C. Bu kromatografik yöntem Vuckovic ve ark.7'denuyarlanmıştır. Enjeksiyon hacmi: 10 μL.</li>
	<li>LC-HRMS analizi ve negatif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Negatif modda geçerli çalışmada kullanılan parametreler: tetkik aralığı: m/z 80-1000; çözünürlük 70 000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; C-trap için zaman enjekte: otomatik; püskürtme gerilimi: 2,5 kV; S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: -25 V; skimmer gerilimi: -15 V; kılcal damar sıcaklığı: 256 °C kılıf gazı: 48 a.u; aux gaz: 11 a.u.; aux gaz ısıtıcı sıcaklığı: 413 °C. Bu kromatografik yöntem Vuckovic ve ark.7'denbenimsenmiştir. Enjeksiyon hacmi: 10 μL.</li>
	<li>Üretici tarafından tavsiye edilen cihazı kalibre edin. NOT: Mevcut çalışmada, cihaz her 48 saatte bir harici kalibrasyon kullanılarak kalibre edilmiştir ve bu da kütle doğruluğu <2 ppm ile sonuçlandı.</li>
	<li>Cihazı çalıştıran yazılımdaki Başlat düğmesini tıklatarak analizi başlatın.</li>
	<li>Çözümleme tamamlandığında, RPLC sütununa HILIC sütunu değiştirin, mobil aşamaları değiştirin ve 6.</li>
</ol>6. Hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HILIC-HRMS analizi) kullanılarak metabolomik analizi
<ol><li>LC-HRMS analizi ve pozitif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Pozitif modda geçerli çalışmada kullanılan parametreler şunlardır: tetkik aralığı: m/z 80-1000; çözünürlük 70 000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; C-trap için zaman enjekte: otomatik; püskürtme gerilimi: 1,5 kV; S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: 25 V; skimmer gerilim: 15 V; kılıf gazı: 60 a.u.; aux gaz: 40 a.u.; aux gaz ısıtıcı sıcaklığı: 425 °C; kılcal damar sıcaklığı: 325 °C. Kromatografik yöntem Vuckovic ve ark.7'denuyarlanmıştır. Enjeksiyon hacmi: 10 μL.</li>
	<li>LC-HRMS analizi ve negatif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Negatif modda geçerli çalışmada kullanılan parametreler şunlardır: tetkik aralığı: m/z 80-1000; çözünürlük 70 000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; C-trap için zaman enjekte: otomatik; püskürtme gerilimi: 1.3 kV; S-lens RF seviyesi: 55%.; S-lens gerilimi: -25 V; skimmer gerilimi: -15 V; kılcal damar sıcaklığı: 263 °C; kılıf gazı: 60 a.u.; aux gaz: 30 a.u.; aux gaz ısıtıcı sıcaklığı: 425 °C. Kromatografik yöntem Vuckovic ve ark.7'denuyarlanmıştır. Enjeksiyon hacmi: 10 μL.</li>
	<li>Üretici tarafından tavsiye edilen cihazı kalibre edin. NOT: Mevcut çalışmada, cihaz her 48 saatte bir harici kalibrasyon kullanılarak kalibre edilmiştir ve bu da kütle doğruluğu <2 ppm ile sonuçlandı.</li>
	<li>Cihazı çalıştıran yazılımdaki Başlat düğmesini tıklatarak analizi başlatın.</li>
</ol>7. Lipidomik analiz için örnek hazırlama
NOT: Bu adım yalnızca deneyiçin tüm numuneler toplandıktan sonra yapılmalıdır.
<ol><li>Analize başlamadan önce, desorpsiyon çözücü karışımını hazırlayın: isopropanol:metanol 50:50 v/v.</li>
	<li>Dondurucudan lipidomik analiz için ayrılmış C18 lifleri içeren şişeleri alın.</li>
	<li>Desorpsiyon için kullanılacak etiket şişeleri.</li>
	<li>Pipet 200 μL desorpsiyon çözeltisi (adım 7.1'de hazırlanır) 2 mL şişelere yerleştirilen silanize cam kesici uçlara. NOT: Silanize olmayan kesici uçlar da kullanılabilir, ancak bunların kullanımı yüksek logP'li bileşiklerin kötü tekrarlanabilirliğine neden olabilir, çünkü bu bileşikler özellikle cam duvarlara eklenebilir.</li>
	<li>Kaplamayı desorpsiyon çözücüye tamamen batırarak, daha sonra girdap kullanarak 1.200 rpm'de 60 dakika boyunca çalkalayarak ayrı bir kesici uçtaki her bir elyaftan desorpsiyon yapın.</li>
	<li>Desorption tamamlandığında 60 dk sonra problar ile kapakları çıkarın.</li>
	<li>Örnek kümesinden her numunenin 10 μL aliquot'larını karıştırarak QC numunesini hazırlayın. Örnek set boyutu deneysel tasarıma bağlıdır. Tüm örnekleri tek bir toplu olarak analiz etmek önemlidir.</li>
	<li>Şişeleri yeni kapaklarla kapatın.</li>
	<li>Şişeleri sıvı kromatografiyüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin (LC-HRMS) otoörnekleyicisine (4 °C) yerleştirin ve adım 8'e geçin.</li>
</ol>8. Ters faz sıvı kromatografisi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (RPLC-HRMS analizi) kullanılarak lipidomik analiz
<ol><li>LC-HRMS analizi ve pozitif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Pozitif iyon modunda geçerli çalışmada kullanılan parametreler şunlardır: tetkik aralığı: m/z 100-1000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; C-trap için zaman enjekte: otomatik; püskürtme gerilimi: 3,5 kV, S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: 25 V; skimmer gerilim: 15 V; kılcal sıcaklık 275 °C; kılıf gazı: 30 a.u.; aux gaz: 10 a.u.; yedek gaz: 2 a.u.; sonda ısıtıcı sıcaklığı 300 °C. Kullanılan LC parametreleri: faz A: metanol:su, 40:60 ile 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit; faz B: isopropanol:metanol, 90:10 10mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit.; degrade: 0 dk – %20 B; 1.0 dk – %20 B; 1,5 dk – %50 B; 7,5 dk – %70 B; 13.0 dk – %95 B; 17.0 dk – %95 B; 17,1 dk – %95,5 B; 23.0 dk – STOP; C18 Kolonu, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; akış: 0.2 mL/dk; fırın sıcaklığı: 55 °C; enjeksiyon hacmi: 10 μL.</li>
	<li>LC-HRMS analizi ve negatif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Mevcut çalışmada kullanılan parametreler aşağıdaki gibidir: negatif iyon modu için HRMS parametreleri: tetkik aralığı: m/z 100-1000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; C-trap için zaman enjekte: otomatik; püskürtme gerilimi: 3,5 kV, S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: -25 V; skimmer gerilimi: -15 V; kılcal sıcaklık 275 °C; kılıf gazı: 30 a.u; aux gaz: 10 a.u.; yedek gaz: 2 a.u; sonda ısıtıcı sıcaklığı 300 °C. Kromatografik yöntem: 8.1 ile aynıdır.</li>
	<li>Üretici tarafından tavsiye edilen cihazı kalibre edin. NOT: Mevcut çalışmada, cihaz her 48 saatte bir harici kalibrasyon kullanılarak kalibre edilmiştir ve bu da kütle doğruluğu <2 ppm ile sonuçlandı.</li>
	<li>Cihazınızı çalıştıran yazılımdaki Başlat düğmesini tıklatarak analizi başlatın.</li>
	<li>Çözümleme tamamlandığında, RPLC sütununa HILIC sütunu değiştirin, mobil aşamaları değiştirin ve 9.</li>
</ol>9. Hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HILIC-HRMS analizi) kullanılarak lipidomik analiz
<ol><li>LC-HRMS analizi ve pozitif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Pozitif iyon modunda geçerli çalışmada kullanılan parametreler şunlardır: tetkik aralığı: m/z 100-1000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; püskürtme gerilimi: 1,5 kV; S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: 25 V; skimmer gerilim: 15 V; kılcal sıcaklık 325 °C; kılıf gazı: 60 a.u.; aux gaz: 30 a.u.; yedek gaz: 2 a.u.; sonda ısıtıcı sıcaklığı 320 °C. Kullanılan LC parametreleri: Faz A: 5 mM amonyum asetat suda; faz B: asetonitril; degrade: 0 – 2dk – %4 B; 15.0 – %20 B; 15.1 – %4 B, 21.0 dk – STOP; 3 μm 100 mm x 2.1 mm kolon; akış: 0.4 mL/dk; fırın sıcaklığı: 40 °C; enjeksiyon hacmi: 10 μL.</li>
	<li>LC-HRMS analizi ve negatif iyonizasyon modu parametrelerini ayarlayın. NOT: Negatif iyon modunda geçerli çalışmada kullanılan parametreler şunlardır: tetkik aralığı: m/z 80-1000; AGC (1.000.000 iyon) kullanılarak gerçekleştirilen satın alma; püskürtme gerilimi: 1.5 kV, S-lens RF seviyesi: %55; S-lens gerilimi: -25 V; skimmer gerilimi: -15 V; kılcal sıcaklık 320 °C; kılıf gazı: 50 a.u.; aux gaz: 21 a.u.; yedek gaz: 3 a.u.; sonda ısıtıcı sıcaklığı 320 °C. Kromatografik yöntem 9.1'de açıklananla aynıydı.</li>
	<li>Üretici tarafından tavsiye edilen cihazı kalibre edin. NOT: Mevcut çalışmada, cihaz her 48 saatte bir harici kalibrasyon kullanılarak kalibre edilmiştir ve bu da kütle doğruluğu <2 ppm ile sonuçlandı.</li>
	<li>Cihazı çalıştıran yazılımdaki Başlat düğmesini tıklatarak analizi başlatın.</li>
</ol>10. Veri işleme ve istatistiksel analiz
<ol><li>Ham veri dosyalarının biçimiyle uyumlu yazılımkullanarak verileri işleyin.</li>
	<li>İşlenen verileri kullanarak istatistiksel analiz yapın. NOT: Testin türü çalışmanın bilimsel hipotezine ve tasarımına bağlıdır. Mevcut çalışmada, Temel Bileşen Analizi, Kısmi-En Az Kare-Ayrımcı Analiz ve tek yönlü ANOVA kullanılmıştır.</li>
</ol>

<ol><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Bi, W. L., Beroukhim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+the+odds%3A+extreme+long-term+survival+with+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncology%22%5BJournal%5D)">Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma.</a> Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).</li>
<li>Ifa, D. R., Eberlin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Ionization+Mass+Spectrometry+for+Cancer+Diagnosis+and+Surgical+Margin+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation.</a> Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).</li>
<li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+methodology+for+in+vivo+endoscopic+phenotyping+of+colorectal+cancer+based+on+real-time+analysis+of+the+mucosal+lipidome%3A+a+prospective+observational+study+of+the+iKnife%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife.</a> Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).</li>
<li>Reyes-Garcés, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Solid+Phase+Microextraction+and+Perspective+on+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions.</a> Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Handbook+of+Solid+Phase+Microextraction%22">Handbook of Solid Phase Microextraction</a>. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).</li>
<li>Vuckovic, D., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Evaluation+of+Solid-Phase+Microextraction+Coatings+for+Untargeted+Metabolomic+Profiling+of+Biological+Fluids+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).</li>
<li>Cajka, T., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+lipids+in+biological+systems+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).</li>
<li>Goryńska, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+brain+tumour+metabolomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">A new strategy for brain tumour metabolomic analysis.</a> Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).</li>
<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+in+solid+cancer%3A+are+size-based+response+criteria+an+anachronism%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism.</a> Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aL%C3%A4mmerhofer%2C+M+%22Metabolomics+in+Practice%3A+Successful+Strategies+to+Generate+and+Analyze+Metabolic+Data%22">Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data</a>. , Wiley-VCH. (2013).</li>
<li>Lendor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Phase+Microextraction-+Based+Miniaturized+Probe+and+Protocol+for+Extraction+of+Neurotransmitters+from+Brains+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo.</a> Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).</li>
<li>Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Free+Drug+Concentration+from+Biological+Tissue+by+Solid-Phase+Microextraction%3A+In+Silico+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study.</a> Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).</li>
<li>Looby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry+via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hedeflenmemiş metabolomik ler ve lipidomikler tümör biyobelirteçlerinin belirlenmesine odaklanan çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, çoğu durumda, araştırmacılar hastalığın taranması için kullanılabilecek bileşikler arayın. Sonuç olarak, tercih edilen biyolojik örnekler kan veya idrar nispeten kolay erişim nedeniyle. Tümör dokusunun analizi esas olarak hastalığın arkasındaki mekanizmaları anlamak, farklı tümör tiplerini karakterize etmek vb. için yapılır. Tümör biyobelirteçlerinin yerinde analizi nadiren yapılır, çünkü bu tür uygulamalar kapsamlı numune hazırlama gerektirir. Alternatif olarak, belirli biyobelirteçlerin ön seçimi olmadan doku profillerinin gerçek zamanlı analizine dayalı stratejiler tıp camiasının dikkatini çekiyor3,4. Burada sunulan çözüm, bu tür yöntemlerle elde edilebilen bilgi türünü açıklayarak yerinde doku işlemeye başka bir bakış açısı sağlar.
Örnekleme, numune hazırlama ve çıkarma birleşimi, SPME'yi yerinde analiz için çok yararlı bir araç haline getirir. Ayrıca, örnekleme sırasında doku tüketiminin azlığı biyomarker analizi ve rutin testler (genotipleme, histolojik analiz) için aynı numunelerin daha fazla kullanılmasını sağlar ve bu nedenle standart test sonuçlarına yeni bilgiler ekler. Örnekleme cihazı çok basit bir tasarıma sahiptir, kullanımı çok kolaydır ve çıkarma işleminin kendisi için özel bir eğitim gerekmez. Ancak, güvenilir sonuçlar elde etmek, cihazların düzgün bir şekilde işlenmesinden çok daha fazlasını gerektirir. Denemeyi düzgün bir şekilde gerçekleştirmek için, çıkarma işlemini, örneğin doğasını anlamak ve verileri etkileyebilecek olası hataların farkında olmak gerekir.
Bu kanserli doku heterojenite dikkate almak önemlidir10; örneklenen tümörler nekroz, kalsifikasyon ve hipoksi geçiren parçalar içerebilir ve bu süreçlerin her biri elde edilen metabolom ve lipidom yansıtılır, böylece sonuçları etkileyen. Bu nedenle, uzamsal çözünürlük örnekleme kanserli doku farklı bölgelerinde çeşitli liflerin takılarak yapılması tavsiye edilir, ya da alternatif olarak, daha uzun bir kaplama böylece tümör hakkında ortalama bilgi elde etmek için tümörün tüm nüfuz etmek için kullanılması. Uzamsal çözünürlük örnekleme yöntemi uygulanıyorsa, lifler tek bir desorpsiyon çözücüye dönüştürülebilir; bu sadece tümör hakkında genel bilgi elde etmek için izin olmaz, ama aynı zamanda analiz duyarlılığını artırmak. Alternatif olarak, ayrı şişeler halinde bireysel liflerin desorpsiyon beyin tümörü iç çeşitliliği anlamaya soruşturma sağlayacak, hangi kanserli hücrelerden inşa çekirdek oluşur, ve dış bölge, hangi sağlıklı doku sınırıdır. Tümörün daha derin bölümleri genellikle daha fazla kanser ile ilgili süreçler tarafından zarar11. Ancak, araştırmacılar bu seçeneğin yöntem hassasiyetini ve saptanabilir bileşiklerin toplam sayısını tehlikeye attığını unutmamalıdır. Mevcut çalışmada 7 mm'lik bir kaplama kullanılmıştır; bu uzunluk çalışmada yer alan tümörlerin çeşitli boyutları için optimum olarak kabul edildi. Kaplamalar tümörleri deldi ve böylece özel olmayan çözünürlük sağladı, ancak örnek boyunca veri ortalaması. Seçilen protokolden bağımsız olarak, bireysel örneklemede kullanılan lif sayısı, kaplamanın uzunluğu, çıkarma süresi ve bu çalışmada belirtilen diğer tüm faktörler de dahil olmak üzere, tüm çalışma sırasında aynı protokolün izlenmesi önemlidir.
Analizin kalitesini kontrol etmek önemlidir. Havuzlanmış QC (protokoldeki 4.7 ve 7.7 adımlarını görün) hazırlanmalı ve tüm numune toplu iş lerinin çalışması sırasında alet kararlılığını izlemek için kullanılmalıdır. Boş denetimler (bkz. adım 2.8) daha sonra çözücülerden veya elyaf üretiminden kaynaklanan kirletici sinyalleri ortadan kaldırmak için bir "dışlama listesi" hazırlamak için kullanılabilir. Kontaminasyon riski gibi özel durumlarda, eldivenlerden, masalardan, cihazlardan veya kontaminasyon riski oluşturabilecek diğer yüzeylerden numune alınması gereklidir. Bu gibi durumlarda, lif hazırlama, çıkarma süresi ve desorpsiyon protokolleri örnekler için aynıdır.
Metabolomik ve lipidomik analizler tamamen bir organizmada veya organizmanın belirli bileşenlerinde görünen küçük moleküllere (1.500 Da'dan az) odaklanır, örneğin belirli organlar, dokular, sıvılar, hücreler, vb. Metabolomik ve lipidomik ler vücutta meydana gelen biyokimyasal değişikliklerin bir anlık görüntüsünü sunar lar ve kanser durumunda tümörün genomu, histolojisi ve malignitesi ile ilgili bilgileri bütünleştirirler. Bu omik bilimler proteinler veya genler12daha biyokimyasal merdivende daha yüksek olduğu gibi metabolitleri olarak fizyoloji ve fenotip arasında bir bağlantı oluşturmak. Kanserli tümörlerin metabolom ve lipidomlarını anlayarak, tüm omik bilimler arasında fenotipi keşfetmeye daha da yaklaşırız, çünkü bu çalışma dalları, canlı organizmaların çeşitli uyaranlara tepkisi olarak moleküllerin dinamik değişimleri hakkında daha derinlemesine bilgi sunar. Bu çalışmada da sunulduğu gibi, bir örneklemede elde edilen veriler kanser histolojisine, malignite derecesine karşılık gelir ve genom düzeyinde meydana gelen değişiklikleri yansıtır. Gliomas'ta, bu çalışmada ilgi kanser türü olarak, genomda gizli bilgiler özellikle önemlidir, kişiselleştirilmiş bir tedavi genetik testlerin sonuçlarına göre geliştirilmiştir. Özellikle mutasyonlar kemoterapi veya radyoterapi sonuçlarının prognostik belirteçleridir. Burada gösterildiği gibi, belirli bir mutasyonu yansıtan biyobelirteçlerin seçimi önerilen strateji ile mümkündür. Mutasyon belirteçleri, tümörün malignite derecesini gösteren ek tanımlayıcı tiplerin yanı sıra rutin tanı yöntemlerini desteklemek için de kullanılabilir.
Solid faz mikroekstraksiyon lifleri kullanımı ile ex vivo kimyasal biyopsi intraoperatif tanı yönteminin uygulanmasında ilk adımdır. Bu yöntem, uygun Etik Kurullardan izin almak için in vivo örnekleme için kolayca benimsenebilir. Bu gibi durumlarda, Örneklemenin yapılacağı hastanenin kabul edilen sterilizasyon işlemlerine göre SPME cihazlarının sterilizasyonu, yani otoklavlama veya etilen oksit sterilizasyonu yapılmalıdır. Önceden şartlandırılmış ve sterilize edilmiş lifler sterilizasyon son kullanma tarihi ile etiketlenmiş mühürlü ambalajlarda saklanmalıdır. Liflerin yüzey aktif madde kullanımı ile temizlenmemesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Böyle bir yordam sorbent bileşiminde spesifik olmayan değişikliklere neden olabilir, böylece analit lerin çıkarılmasını etkileyebilir. Burada açıklanan çalışmalarda, 30 dk çıkarma süresi kullanılmıştır, ancak diğer raporlar daha kısa süreler vivo çalışmalarda tatmin edici sonuçlar verebilir doğrulamak13. Huq ve ark. analit denge süresi basit matrisler14daha karmaşık bir matris olarak, dokuda daha hızlı elde olduğunu gösterdi. Ancak, elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliği daha kısa ekstraksiyon süreleri altında tehlikeye olabilir, zira ön denge koşullarında daha fazla analit çıkarılacaktır; bu nedenle, kesin zaman kontrolü uygulanmalıdır.
Bu çalışmanın bir parçası olarak sömürülen her iki omik bilim biyomarker keşif araçları olarak mükemmel bir potansiyele sahiptir. Biyobelirteçler seçildikten veya kemometrik bir model oluşturulduktan sonra, bu çalışmada tanımlanan SPME yaklaşımı gibi yerinde araştırmalar için geçerli yöntemlerle hedef metabolitlerin belirlenmesine dayalı tıbbi tanılar rutin tanılamanın bir parçası olarak geliştirilebilir ve uygulanabilir.
Bu el yazmasında önerilen protokol, potansiyel biyobelirteçlerin taranması için katı faz mikroekstraksiyonu kullanılarak kanser dokusunun hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Temsili bileşiklerin çıkarılmasını, tümörlerin farklılaşmasını ve belirli bir kanseri karakterize eden ayrımcı bileşiklerin belirlenmesini sağlamak için tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan SPME ile yapılan hedefsiz analizler, numunede bulunan tüm bileşiklerin taranması na gerek kalmadan seçilen bir bileşik panelinin belirlenebileceği hızlı intraoperatif tanının geliştirilmesinde bir başlangıç noktasıdır. Hızlı tanı sonuçları nın yararına, yerinde çıkarma için kullanılan SPME probları doğrudan hastane tesisinde bulunan analitik enstrümantasyonla birleşebilir. Kromatografi içermeyen analizin ardından minimum numune hazırlama ile yapılan basit ekstraksiyonlar, ilaçtakibiiçin açıklandığı üzere, genel süreyi saatten birkaç dakikaya önemli ölçüde kısaltır.

Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) ve Bilgisayarlı Tomografi (BT) beyin lezyonlarının gerçek zamanlı analizinde kullanılan başlıca yöntemlerdir. Beyin tümörü farklılaşması genellikle ek boyama ve ileri immünohistokimyasal tekniklerle histopatolojiye dayanır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından 2016 yılında yayınlanan merkezi sinir beyin tümörleri ile ilgili güncellenen kılavuza göre, genetik testler bu tümörlerin farklılaşması ve sınıflandırılması için çok önemlidir1. Tümörlerin farklılaşması ve sınıflandırılması hekimlerin belirli bir tümör tipi için en etkili tedaviyi seçmelerine olanak sağlayarak hastanın yaşam beklentisini genişletir. Ne yazık ki, hastaları için optimum bir tedavi seçiminde hekimlere yardımcı olmak için bu tür gelişmiş yöntemlerin durumu rağmen, glioblastoma tanısı hastaların yaşam beklentisi (IV sınıf glioma) sadece yaklaşık 15-16 ay2. Söz konusu görüntüleme ve histolojik yöntemlerin tanı araçları olarak gelişmişliği ve doğruluğu nun artmasına rağmen, hekimlere tedavinin seyri ile ilgili kararlarda yardımcı olmak için tamamlayıcı bilgi sunabilen yeni tekniklere hala büyük ihtiyaç vardır. Son yıllarda, kitle spektrometresi dayalı birkaç yeni yaklaşımlar kanser intraoperatif analizi için önerilmiştir3,4. Katı faz mikroekstraksiyon potansiyeli (SPME), hızlı bir yerinde analiz aracı olarak burada sunulan yöntem, zaten çalışmalar da çeşitli gösterilmiştir5. Mevcut el yazması yöntemin klinik uygulamalarından birini, hedefsiz metabolomikve insan beyin tümörlerinin lipidomiklerini göstermektedir. Hedeflenmemiş araştırmalar potansiyel biyobelirteçlerin keşfinde önemli bir başlangıç noktası dır. Kurulduktan sonra, bu tür biyobelirteçler daha sonra yerinde enstrümantasyon ile birleştiğinde aynı teknolojiyi kullanarak tümörler arasında ayırt etmek için tanısal referanslar olarak kullanılabilir.
SPME, küçük miktarlarda ekstraksiyon fazı kullanılarak örnek matrislerden küçük molekülleri çıkaran denge tabanlı bir numune hazırlama tekniğidir. Cihazın SPME en geleneksel yapılandırma (prob), bir lif uygun bir çıkarma aşaması ile kaplanır ve sağlam bir destek yani immobilize, bir metal tel5,6. Biyouyumlu kaplamalar ve cihazlar (problar), örneğin homojenizasyon ve filtrasyon gibi numune ön işleme olmadan doğrudan karmaşık biyolojik matrislerden ekstraksiyon sağlar. Ekstraksiyon işlemi sayesinde, analitler çıkarma aşaması ve numune matrisi arasında ilk konsantrasyonlarıyla orantılı olarak bölümlenir. Eğer ekstraksiyon yeterince uzun yapılırsa, o zaman denge elde edilir. Dengede çıkarma mümkün olan en yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirliği sağlarken, ön denge ekstraksiyonu da mümkündür ve hatta bazı durumlarda, yerinde örneklemeyle ilgili zaman kısıtlamalarının (örn. işletme veya acil servisler) hızlı ekstraksiyonlar gerektirdiği, in vivo örnekleme de mümkündür. Belirli bir analitin ekstraksiyon zaman profili genellikle analitin fizyokimyasal özelliklerinden, örnekleniyor olan matristen, kullanılan sorbent türünden ve diğer bazı ekstraksiyon koşullarından etkilenir. Bunların ekstraksiyon kinetiğini yöneten faktörlerin bolluğu, metabolomik veya lipidomik gibi hedeflenmemiş analizler yapıldığında tüm bileşiklerin denge ekstraksiyonunun sağlanmasını neredeyse imkansız hale getirir. Yukarıda belirtilen nedenlerle, geçerli protokolün çıkarma süresi, bir yandan metabolitlerin tatmin edici hassasiyetini ve kapsamını, diğer yandan da yerinde kullanım için pratikliği sağlamak için rasgele olarak ayarlanmıştır.
Dokulardan numune alınmasında kullanılan probların çok küçük bir boyutu sadece minimum doku hasarına neden olurken, örnekleme işleminin kendisi herhangi bir doku değil, örneklenen bölgeden çok az miktarda küçük molekül tüketir; bu nedenle, aynı örnek daha rutin testler yani, histolojik veya genetik için kullanılabilir, aynı örnekten temel ve tamamlayıcı bilgilerin elde edilmesini sağlayan. Bu tür tamamlayıcı, kapsamlı veriler tümör biyolojisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacak ve yeni tedavi hedeflerinin keşfini kolaylaştıracak. Bu yöntemden yararlanmak, hedef biyobelirteçleri belirlerken yerinde intraoperatif tanı olasılığını daha da arttırmaktadır.
Aşağıda metabolomik ve lipidomik analizler ve veri işleme için beyin tümörlerinin yerinde örneklenmesi için protokoller sayılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>asetik asit</td><td>Honeywell</td><td>49199</td><td>Mobil faz katkı maddesi, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>Honeywell</td><td>34967</td><td>HPLC çözücü, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>amonyum asetat</td><td>Honeywell</td><td>14267</td><td>Mobil faz katkı maddesi, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>BenchMixer MultiTube Vortexer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010*</td><td>Vorteks karıştırıcı</td></tr><tr><td>kapakları</td><td>Agilent</td><td>5183-2076</td><td>Mavi scrw tp, önceden yarık PTFE / Si septa</td></tr><tr><td>Bileşik Discoverer 2.1</td><td>Veri işleme için</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> yazılımı</tr><tr><td>Discovery HS F5 Supelguar Kartuşu 2 cm ve kez; 2,1 mm, 3 & mu; m</td><td>Supelco</td><td>567571-U</td><td>Koruma Kolonu</td></tr><tr><td>Keşfi HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 & m</td><td>Merck</td><td>567502-U</td><td>HPLC Kolon</td></tr><tr><td>formik asit</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Mobil faz katkı maddesi, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>cam flakon ekleri 250ul, devre dışı bırakılmış</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>cam flakon ekleri 350ul</td><td>Agilent</td><td>5188-5321</td><td></td></tr><tr><td>cam şişeler 1.5ml</td><td>Agilent</td><td>5183-2030</td><td></td></tr><tr><td>cam şişeler, 2 mL (amber, devre dışı)</td><td>Agilent</td><td>5183-2072</td><td></td></tr><tr><td>cam şişeler, 2 mL</td><td>Agilent</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 & mu; m, 200A, 100 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>HPLC Kolonu</td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Honeywell</td><td>34965</td><td>HPLC çözücü, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>LipidSearch 4.1</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>veri işleme yazılımı</td></tr><tr><td>Metaboanalist</td><td>Xia Lab @ McGill</td><td></td><td>istatistiksel analiz için çevrimiçi yazılım (Chong, J., Wishart, D.S. ve Xia, J. (2019) Kapsamlı ve Bütünleştirici Metabolomik Veri Analizi için MetaboAnalyst 4.0 Kullanımı. Biyoinformatikte Güncel Protokoller 68, e86 )</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Honeywell</td><td>34966</td><td>HPLC çözücü, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>Pierce LTQ Velos ESI Pozitif İyon Kalibrasyon Çözeltisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>88323</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Negatif İyon Kalibrasyon</td><td>Çözeltisi Thermo Scientific</td><td>88324</td><td></td></tr><tr><td>Q Eksaktif Odak hibrit dört kutuplu Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>726049</td><td>HILIC için Kütle Spektrometresi</td></tr><tr><td>SecurityGuard kartuşu, 4 mm ve kez; 2.0 mm</td><td>Phenomenex</td><td>KJ0-4282</td><td>Koruma Sütunu</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3 & mikro; m, 100 ve yükselen; 100 x 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>1506570001</td><td>HPLC Kolonu</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-HILIC Koruma Kiti 20 x 2,1 mm</td><td>Supelco</td><td>1504360001</td><td>Koruma sütunu</td></tr><tr><td>SPME LC fiber problar, C18</td><td>Supelco</td><td>özel sipariş</td><td>ticari problar: 57281-U; Deneyde kullanılan problar iğne ile monte edilmedi ve protokolde açıklanan uzunluğa göre önceden kesildi</td></tr><tr><td>SPME LC fiber problar, karışık Mod</td><td>Supelco</td><td>özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC sistemleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>5200.0345</td><td>HPLC sistemi</td></tr><tr><td>su</td><td>Merck</td><td>1153331000</td><td>HPLC çözücü, LCMS sınıfı</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3.5 & mu; m 2.1x75mm</td><td>Sular</td><td>186005644</td><td>HPLC Sütunu</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 VanGuard Kartuşu, 3.5 ve mikro; m, 3.9x5 mm</td><td>Sular</td><td>186007813</td><td>Kolon kartuşu</td></tr></tbody></table>

metabolomik ve lipidomik analizler için beyin tümörlerinin yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Kanser tanısı ve sınıflandırılması için mevcut araçların çeşitliliğine rağmen, tümörlerin hızlı ve basit karakterizasyonuna olanak sağlayan yöntemlerhala ihtiyaç duymaktadır. Son yıllarda, kütle spektrometresi bir hastalığın potansiyel biyobelirteçleri olarak ayrımcı bileşiğin hedeflenmemiş profilleme için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Biyoakışkanlar genellikle erişilebilirlik ve daha kolay örnek işleme verilen tercih edilen matrisler olarak kabul edilirken, doğrudan doku profilleme belirli bir kanser hakkında daha seçici bilgi sağlar. Geleneksel yöntemlerle analiz için dokuların hazırlanması çok daha karmaşık ve zaman alıcıdır ve bu nedenle hızlı yerinde analiz için uygun değildir. Mevcut çalışma, tümör rezeksiyonundan hemen sonra, numune hazırlama ve küçük moleküllerin yerinde çıkarılmasını birleştiren bir protokol sunmaktadır. Akupunktur iğnesi büyüklüğünde olan numune alma cihazı doğrudan dokuya takılabilir ve daha sonra enstrümental analiz için yakındaki laboratuvara taşınabilir. Metabolomik ve lipidomik analizlerin sonuçları, tümörün histolojik kökeni, malignite ve genetik mutasyonların yanı sıra ayrımcı bileşiklerin veya potansiyel biyobelirteçlerin seçimine bağlı tümörlerin fenotiplerinin kurulması için yaklaşımın yeteneğini göstermektedir. Tekniğin tahribatsız doğası, SPME analizinde kullanılan aynı numuneler üzerinde rutin olarak kullanılan testlerin, örneğin histolojik testlerin sonraki performansına izin vererek kişiselleştirilmiş tanılamayı desteklemek için daha kapsamlı bilgilere ulaşılmasını sağlar.

Sıvı kromatografisi ile birlikte yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve gelişmiş bir veri işleme yazılımı ile birleşen bir örnek hazırlama yöntemi olarak katı faz mikroekstraksiyonunun sömürülmesi, insan beyin tümörlerinin metabolom ve lipidomlarını başarılı bir şekilde karakterize etmemizi sağladı. Büyüklüğü akupunktur iğnesine eşdeğer olan sonda, incelenen dokuda minimum hasara ve doku tüketimine yol açarak histolojik veya genetik çalışmalar için örneklerin daha fazla kullanılmasını sağladı. Seçilen grupların hem ters faz hem de HILIC kolonlar için, hem de metabolomik ve lipidomik analizlerde iyonizasyon modları için tatmin edici ayrıştırma sağlandı. Her iki ayırma yönteminin sadece metabolomiklerde değil, lipidomik analizlerde de kullanılması değerli tamamlayıcı veriler sağlamıştır. Tersine çevrilmiş faz sütunu karbon zincirlerinin uzunluğu ve doymamış bağların varlığı na göre ayrı lipidler, HILIC kolon ise lipid gruplarının profillemi için yararlıdır, özellikle fosfolipidler8.
Enstrümental analizin tekrarlanabilirliği, ana bileşen analizi çiziminde QC örneklerinin sıkı kümelenmelerine bağlı olarak çok iyi bulunmuştur(Şekil 3A, üç QC örneği her sekiz hastanın numunesini dizi çakışması boyunca enjekte etti). Ayrıca, negatif kontrol analizi için kullanılan ekstraksiyon boşluklarının gerçek örneklerden ayrı olduğu bulunmuştur. Sondalar tarafından çıkarılan çok çeşitli analitler temsili türlerin keşfini kolaylaştırarak, histolojik kökenleri, maligniteleri ve diğer faktörlere (örn. genetik) bağlı olarak insan beyin tümörleri arasında başarılı bir şekilde farklılaşmaya olanak sağladı. Şekil 3B gliomas ve menenjiyomlu hastalardan alınan örnekler için lipidomik verileri göstermektedir. Menenjiyomlar genellikle iyi huylu tümör olarak kabul edilirken gliomlar en kötü huylu tümörlerden biri olarak kabul edilirken, farklı histolojik köken ve malignite ile karakterize olan bu tümörler arasında farklılaşmanın sağlanması çalışmanın önemli bir amacıydı. Ayrıca metabolomik verileri sunan Şekil 4'te gliomlar malignite derecesine göre yüksek ve düşük olarak ikiye ayrıldı. Bu alt gruplar menenjiyomların moleküler fenotipile karşılaştırıldı. Her iki durumda da kümelerin belirgin ayrımı gözlendi. Günümüzde glioma tanısı öncelikle tümör örneklerinde spesifik genetik mutasyonların belirlenmesine dayanmaktadır. Bu nedenle elde edilen sonuçlar genotipleme verileri ile karşılaştırıldı. Şekil 5A, saptanan co-silme 1p19q ve mutasyonun gözlenmediği örneklerle örneklerin ayrıştırıldığını gösterir.
İstatistiksel analiz aynı zamanda incelenen gruplardaki bileşiklerin seçimine de izin verir. Uygun büyüklükte bir kohortun örneklendiği durumlarda bu bileşikler potansiyel biyobelirteç ler olarak kabul edilebilir. Ancak, tespit edilen bileşiklerin parçalanma ile kesin olarak onaylanması ve tespit edilen türlerin analitik standartlarla karşılaştırılması da dahil olmak üzere daha derinlemesine analiz, biyolojik bir yapının kesin sonuçlarını çıkarmak için gereklidir. Bu tür ayrımcı metabolitlere örnekler Şekil 3C ve Şekil 5B'deverilmiştir. Bu bileşiklerin kimlikleri, yani, sfingomielyn: SM d36:1 ve proline örnek ve otantik standartlardan metabolitlerin parçalanma desenleri karşılaştırılarak doğrulandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig01.jpg"> Şekil 1: Çıkarma işlemi için hazırlanan SPME lifleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig02.jpg"> Şekil 2: SPME probları kullanılarak meningiom çıkarılması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig03.jpg"> Şekil 3: GLIOMA ve menenjiyom için PCA ve kutu çizimleri. (A)içeren ana bileşen analizi arsa boşluklar, ekstraksiyon QC, boşluklar, menenjiyomlar, gliomas dahil olmak üzere tüm analiz örnekleri; (B) sadece çalışılan grupları içeren (boşluklar ve QC'ler hariç tolduktan sonra); Sfingomielyn için (C) kutu bıyık çizimi: SM d36:1 glioma ve menenjiyom ile hasta ayırt edici. Lipidomics verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig04.jpg"> Şekil 4: HGG, LGG ve menenjiyom için PCA. (A ) yüksek dereceligliomas (HGG) ve menenjiyomlar (MEN)9 ve (B)düşük dereceli gliomlar (LGG) ve menenjiyomlar arasındaki farkı gösteren ana bileşen analizi çizimi. Metabolomics verileri Via Medica ref9'dan izin alınarak yeniden basıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig05.jpg"> Şekil 5: PCA ve silme olmadan glioma için kutu çizimleri. (A) Ana bileşen analizi arsa ile hastalarda farklılıklar gösterdi ve co-deletion 1p19q olmadan; (B) kol-silme 1p19q ile ve olmadan proin diferansiye hastalar için kutu bıyık çizimleri; n-silme olmadan, y-silme ile. Metabolomics veri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

El yazması, katı faz mikroekstraksiyonu ile insan beyin tümörlerinin yerinde örneklemesini ve ardından biyobelirteçlerin keşfine yönelik biyokimyasal profillemelerini sunmaktadır.

Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Bu protokol, katı faz mikroekstraksiyon lifleri kullanarak bir sunucu nun içinde veya yanında beyin tümörlerinden bir çıkarma gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, küçük moleküllerin doğrudan rezeke edilen tümörlerden çıkarılmasını sağlar ve ekstraksiyon cihazlarını doğrudan analitik enstrümantasyona bağlama ile hızlı intraoperatif tanılama olanağı sağlar. Katı faz mikroekstraksiyon cihazını hazırlamak için, her katı faz mikroekstraksiyon cihazı probunun kodlamasını karışık modveya C18 kaplamalarla tümörün büyüklüğüne göre uygun bir uzunluğa kesin.Ve sondaları ve 50 50 metanollü su çözeltisini numune toplamadan önce en az bir saat bekletin. Bu protokol beyin tümörleri üzerinde duruluyor ama strateji birçok farklı kanser tanısı için uygulanabilir. Teknoloji tamamen taşınabilir, bu nedenle herhangi bir ek cihazlar için gerek yoktur.Tümör çıkarılmasından sonra en kısa sürede tüm ekstraksiyon fazı tümör içinde bulunan sağlamak için, beyin tümör doku örneği içine mümkün olduğunca liflereklemeden önce beş saniye boyunca LCMS sınıf su ile prob lifleri batırın. Örnek tümör dışındaki kaynaklardan gelen eserlerin varlığı nedeniyle hata kaynaklarını ortadan kaldırmak için doku içinde probları tam olarak 30 dakika bekletin, aynı süre için masaya şartlı prob lifleri yerleştirin. Çıkarma sırasında, prob depolama için kullanılacak hplc şişeleri etiketi çıkarmadan sonra kullanılacak.Çıkarma sonunda, herhangi bir kan veya hücre enkaz kaldırmak ve lifleri hareketsizleştirmek için tek bir HPLC şişe kapağının septa alt yoluyla her prob eklemek için üç saniye lcms sınıf su lifleri batırın. Daha sonra şişeleri hareketsiz liflerle kaplayın ve şişeleri uygun bir taşıma kabına yerleştirin. Laboratuvara vardıktan sonra, şişeleri sırasıyla en fazla üç veya beş yıl süreyle eksi 30 veya eksi 80 santigrat derecelik bir dondurucuya yerleştirdi.Tek bir deneyden alınan tüm numuneler toplandıktan sonra, karışık modlifleri içeren şişeleri oda sıcaklığına yerleştirin. ve desorpsiyon için iki mililitrelik şişeleri etiketleyin her şişenin içine bir cam kesici yerleştirin ve her kesici uça taze hazırlanmış 80 20 asetonitril su çözeltisi 300 mikrolitre ekleyin. Desorpsiyon çözücümün ayrı şişelerinde her sondanın kodlanmasına tam olarak daldırılmış ve şişeleri 120 dakika boyunca bir girdap üzerinde dakikada 120 dakikada hareket ettirin.Desorpsiyon tamamlandıktan sonra, şişelerden kapakları çıkarın ve bir kalite kontrol örneği hazırlamak için tümörekstresi içeren her dosyadan 10 mikrolitre aliquots bir kenara koyun. Daha sonra şişeleri yeni kapaklarla kapatın ve şişeleri sıvı kromatografi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin dört derecelik santigrat otomatik örnekleyicisine yerleştirin. Lipidomik Analiz için numuneleri hazırlamak için oda sıcaklığında C 18 lifleri içeren şişeleri yerleştirin ve iki mililitre HPLC şişelerini, şişelerin içine silanize cam uçlarının bozulması için etiketleyin ve her kesici uça 200 mikrolitre taze hazırlanmış 50 50 isopropanol metanol çözeltisi ekleyin.Her prob kaplamasını çözücüye tamamen batırın ve numuneleri bir girdap üzerinde dakikada 1,200 devirde 50 dakika boyunca çalkalayın. Zaman sonunda, kapakları kaldırarak desorption durdurmak ve daha sonra kalite kontrol örneği hazırlamak ve yeni kapaklar ile şişeleri kapatmak için tümör ekstresi içeren her dosyadan 10 mikrolitre aliquots bir kenara koyun. Daha sonra şişeleri sıvı kromatografiyüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin dört derecelik santigrat otomatik örnekleyicisine yerleştirin.Enstrümental analizin tekrarlanabilirliği, temel bileşen analiz çizimindeki kalite kontrol örneklerinin sıkı kümelemesi nedeniyle çok iyi olarak belirlenmiştir. Gliom ve menenjiyomlu hastalardan alınan örneklere ait bu lipidomik veriler, tümör örneklerinin histolojik kökenlerine ve malignitelerine göre ayırt edilebilme yeteneğini vurgulamaktadır. Bu metabolomik verilerde gösterildiği gibi gliomlar malignite derecesine ve ilgi mutasyonlarının varlığına veya yokluğuna göre daha da ayrılabilir.İstatistiksel analiz aynı zamanda incelenen gruplar içinde belirli bileşiklerin seçimine de izin verir. Çıkarma süresini dikkatle kontrol etmek ve tüm numuneler için tekrarlanabilir koşulları korumak esastır. Alternatif olarak, numuneler belirli belirteçlerin hedeflenen analizine izin vererek ve tüm prosedürü birkaç dakikaya kadar kısaltarak kromatografik ayırma olmadan doğrudan lifden Ms'e çözülebilir.

on-site-sampling-extraction-brain-tumors-for-metabolomics-lipidomics

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, önceden hasat edilmiş bir donör böbrekten metabolitlerin SPME probu tabanlı ekstraksiyonunu gösteriyoruz. Ekstrakte edilen metabolitler, transplantasyon için organ kalitesini değerlendirmek amacıyla metabolomik ve lipidomik analiz yapmak için kullanılabilir.

Katı Faz Mikroekstraksiyon Örneklemesi: Greft Dokularından Örnek Ekstraksiyonu için Prob Tabanlı Bir Teknik

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Bu makalede doku lipidomik ve transkriptomik için modüler bir protokol ve inflamasyon ve nöronal aktivitenin altında kalan lipitleri, membran lipitlerini, aşağı akış habercilerini ve lipid fonksiyonu altında bulunan mRNA kodlayıcı enzimleri/reseptörleri hedefleyen nörolojik hastalık fare modellerinde plazma lipidomikleri sunulmaktadır. Örnekleme, numune işleme, ekstraksiyon ve nicelik prosedürleri özetlenmiştir.

Nörolojik Hastalıklarda Lipidomik ve Transkriptomik

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Burada, bir kan beyin bariyeri metastatik tümör mikro-ortamının hazırlanması ve kültürlenmesi ve konfokal görüntüleme ve yapay zeka (makine öğrenimi) kullanılarak durumunun ölçülmesi için bir protokol saklıyız.

Organ-On-A Chip 3D Modeli, Makine Öğrenimi ve Konfokal Tomografi Kullanarak Beyin Metastatik Tümör Mikro-Ortamının Ölçülmesi

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Beyin organoidlerinin kütle spektrometresi görüntülemesi (MSI) için bu modeller içindeki metabolit dağılımlarının haritalanmasına izin veren gelişmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Bu teknoloji, erken gelişim sırasında ve hastalıkta beyin metabolik yolları ve metabolit imzaları hakkında bilgi sunarak insan beyninin işlevinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını vaat ediyor.

İnsan Beyni Organoidlerinin Kütle Spektrometresi Kullanılarak Moleküler Görüntülenmesi 

In vivo, glioblastoma (GBM) gibi birçok merkezi sinir sistemi hastalığının temelini oluşturan hücreler arası iletişim, ölçülmesi ve karakterize edilmesi ile ünlüdür. Burada, GBM'nin uzunlamasına hayvan modelinde interstisyel sıvı bileşenlerini örneklemek için kullanılabilecek serebral açık akış mikroperfüzyon (cOFM) prosedürlerini açıklıyoruz.

Glioblastoma hayvan modelinde interstisyel sıvının boylamasına koleksiyonu için beyin açık akışlı mikroperfüzyonun kullanımı

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Stereotaktik intrakranial enjeksiyon tekniği, tümör hücrelerinin fare korteksine hassas ve lokal bir şekilde yerleştirilmesini sağlar ve böylece beynin metastatik kolonizasyonunu incelemek için güçlü bir model olur.

Beyin Metastazının Modellenmesi: Metastatik Kolonizasyon ve Histolojik Büyüme Kalıplarının Stereotaktik İntrakortikal Enjeksiyonla Standartlaştırılmış Analizi

Bu protokol, tümör anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için lazer-yakama mikrodiseksiyonu kullanarak glioma örneklerinden yeterli yüksek kaliteli neovasküler doku hazırlamış, geleneksel olarak anjiyojenik faktörlere odaklanan çalışmaların sınırlamalarını aşmış ve glioma anjiyogenezinin geniş ölçekli proteomik profilini sağlamıştır.

İnsan Glioma Dokularından Neovasküler Dokuların Tümör Anjiyogenezinin Nicel Proteomik Analizi İçin Hazırlanması

Öğrenin beyin tümörlerinden metabolit ekstraksiyonu için katı faz mikroekstraksiyon (SPME) yöntemini. Bu teknik, gliom ve meningiom örneklerinde hızlı intraoperatif tanı ve biyobelirteç keşfi sağlar.

Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

Daha fazla video keşfet