Name: Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Öğrenin, transgenik farelerdeki miyelinli aksonlarda nörofilament taşımacılığını floresan mikroskopi ile görüntüleme ve hız yön analizi yöntemini. Bu teknik sinir biyolojisi araştırmalarında aksiyonel sağlığı değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar öğretim ve konfokal mikroskopi ve tibial sinir diseksiyonu ve Dr Atsuko Uchida, Chloe Duger ve Sana Chahande fare yetiştiriciliği ile yardım için yardım için Paula Monsma teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen A.B.'ye ios1656784 osb'nin ortak Ulusal Bilim Vakfı Hibeleri tarafından desteklenmiştir. ve IOS1656765 P.J., ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 NS038526, P30 NS104177 ve S10 OD010383 A.B. N.P.B. Ohio State Üniversitesi Rektörü'nün Doktora Sonrası Akademisyenler Programı'ndan bir burs tarafından desteklendi.

<ol><li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li>
<li>Brown, A. Slow Axonal Transport. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+A+%22Reference+Module+in+Biomedical+Sciences%22">Reference Module in Biomedical Sciences</a>. , (2014).</li>
<li>Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li>
<li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li>
<li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li>
<li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li>
<li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li>
<li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li>
<li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li>
<li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).</li>
<li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li>
<li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD%28P%29H+and+flavoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li>
<li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li>
<li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li>
<li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li>
<li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).</li>
<li>Cohen, J. The effect size index: d. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+Power+Analysis+for+the+Behavioral+Sciences+2nd+ed%22">Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed</a>. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li>
<li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+%22P301L%22+tau+knockin+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li>
<li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li>
<li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bakım-kaçış ve nabız yayılımı deneylerinin analizinde dikkatli olunmalıdır, çünkü özellikle düz alan düzeltmesi, görüntü hizalama ve çamaşır suyu düzeltmesi sırasında, işlem sonrası hatanın ortaya çıkması için önemli bir potansiyel vardır. Düz alan düzeltmesi, aydınlanmadaki tekdüzelik için düzeltmegereklidir, bu da merkezden çevreye görüş alanı boyunca yoğunlukta bir düşüşe neden olur. Tekdüzeliğin kapsamı dalga boyuna bağlıdır ve bu nedenle, her zaman deneysel verilerin elde edilmesinde kullanılacak dalga boyunda yapıl...

Nörofilamentlerin aksonal nakli ilk kez 1970'lerde radyoizotopik nabız etiketleme1ile gösterilmiştir. Bu yaklaşım in vivonörofilament taşıma hakkında bilgi zenginliği vermiştir , ama nispeten düşük uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir, genellikle milimetre ve gün sırasına göre en iyi2. Ayrıca, radyoizotopik darbe etiketleme enjeksiyon ve tek bir zaman ders oluşturmak için birden fazla hayvan kurban gerektiren dolaylı bir yaklaşımdır. 1990'larda floresan proteinlerin keşfi ve floresan mikroskopi deki gelişmelerle, daha sonra nörofilament naklini doğrudan kültürlü nöronlarda saniye veya dakika lık bir zaman ölçeğinde ve mikrometre altı uzamsal çözünürlükte görüntülemek mümkün hale geldi ve hareketmekanizmasınaçok daha fazla fikir kazandırdı 3 . Bu çalışmalar, aksonların nörofilament polimerlerinin mikrotübül motor proteinleri tarafından itilen mikrotübül parçaları boyunca hem anterograd hem de retrograd yönlerde hızlı ve aralıklı olarak hareket ettiğini ortaya koymuştur. Ancak, nörofilamentler genellikle nanometre sadece onlarca tarafından komşularından ayrı aralıklı olan çapı sadece 10 nm kırınım sınırlı yapılardır; bu nedenle, polimerler sadece hareket eden polimerler komşularından çözülebilir böylece seyrek dağıtılmış nörofilamentler içeren kültürlü nöronlar izlenebilir4. Bu nedenle, miyelinatlı aksongibi bol nörofilament polimerler içeren aksonlarda tek nörofilamentleri takip etmek günümüzde mümkün değildir.
Floresan mikroskopisi kullanarak nörofilament açısından zengin aksonların nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için, kültürlü sinir hücrelerindeki nörofilamentlerin uzun süreli duraklama davranışını incelemek için geliştirdiğimiz floresan fotoaktivasyon darbe kaçış yöntemini kullanıyoruz4,5. Fotoaktibl floresan nörofilament füzyon proteini ile etiketlenen nörofilamentler akson kısa bir segmentte aktive edilir, ve daha sonra aktive bölgeden bu filamentlerin ayrılma oranı zaman içinde floresan çürüme ölçülerek ölçülür. Bu yaklaşımın avantajı, tek tek nörofilament polimerlerin hareketini izlemek için gerek kalmadan dakika veya saat bir zaman ölçeğinde uygulanabilir nörofilament taşıma bir nüfus düzeyinde analizi olmasıdır. Örneğin, miyelinating kültürlerde nörofilament transport kinetik analiz etmek için bu yöntemi kullandık6.
Son zamanlarda, insan nöron spesifik Thy1 organizatörü kontrolü altında nöronlarda bir paGFP etiketli nörofilament protein M (paGFP-NFM) düşük seviyelerde ifade bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare gelişimini anlattı7. Bu fare floresan mikroskopisi kullanarak yerinde nörofilament taşıma analizine izin verir. Bu makalede, bu farelerden gelen tibial sinirlerin miyelinli aksonları nörofilament naklini analiz etmek için deneysel yaklaşımları iki yaklaşım la açıklıyoruz. Bu yaklaşımlardan ilki yukarıda açıklanan darbe kaçış yöntemidir. Bu yöntem nörofilamentlerin duraklama davranışı hakkında bilgi üretebilir, ancak filamentlerin aktive edilen bölgeden ayrıldığı yöne kördür ve bu nedenle net yön ve taşıma hızının ölçülmesine izin vermez8. Bu yaklaşımların ikincisi, sadece aktive bölgeden gelen floresan kaybını değil, aynı zamanda floresan filamentlerin aktive edilen bölgeden hem anterograd hem de retrograd yönlerde hareket ettikleri iki yan penceredeki floresan geçici artışı da analiz ettiğimiz yeni bir nabız yayma yöntemidir. Her iki yaklaşımda da ortalama hız, net yönlülük ve duraklama davranışı gibi nörofilament taşıma parametreleri matematiksel analiz ve ölçüm pencerelerinde floresan değişikliklerin modelalınması ile elde edilebilir. Şekil 3 bu iki yaklaşımı göstermektedir.
Bu protokol, imageJ9'unFIJI dağıtım paketini kullanarak elde edilen görüntülerden sinirin diseksiyonunu ve hazırlanmasını, paGFP floresansının aktivasyonu ve görüntülenmesi ve nörofilament taşınmasının niceliğini göstermektedir. Kaval siniri uzun (birkaç cm) olduğu ve dallanmadığı için kullanıyoruz; ancak, ilke olarak paGFP-NFM ifade eden herhangi bir sinir aksonlar zarar vermeden diseksiyon ve de-sheathed olabilir eğer bu teknik ile kullanmak için uygundur.

<table><tbody><tr><td>14 x 22 Dikdörtgen Conta 0.1mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>iç conta</td></tr><tr><td>2-deoksi-D-glikoz</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>30mm Delikli Yuvarlak Conta</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>dış conta</td></tr><tr><td>35 x 10mm çanak</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>diseksiyon</td></tr><tr><td>kapları 40mm yuvarlak lameller</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>60 mL şırınga - Luer kilit ucu</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD eğirme diski konfokal sistem</td><td>Andor</td><td></td><td>Perfect Focus ve FRAPPA sistemleri ile donatılmıştır</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Floresein lam için</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td>ince uçlu forseps</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Balmumu ile diseksiyon tavası</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14061-09</td><td>başlangıç diseksiyon makası</td></tr><tr><td>FCS2 perfüzyon odası</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Floresein sodyum</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Satır içi çözelti ısıtıcısı</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Laminektomi forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11223-20</td><td>ilk diseksiyon forseps</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosu kemeri</td><td>slaytı Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>floresein slaytı için</td></tr><tr><td>Mikroskop aşaması eki</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Objektif ısıtıcı sistemi</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Objektif yakalı</td></tr><tr><td>Touch Objektif yağı - A tipi Nikon</td><td></td><td>durdurulan</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA objektif</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum iyodoasetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Adaçayı Aletleri</td><td>Model 355</td><td></td></tr><tr><td>Boru adaptörü - dişi</td><td>Küçük Parçalar A.Ş.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Boru adaptörü - erkek</td><td>Küçük Parçalar A.Ş.</td><td></td><td></td>1005012</tr><tr><td>Tygon boru</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16 "ID, 1/32" duvar kalınlığı</td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15018-10</td><td>ince makas</td></tr></tbody></table>

excised mouse tibial nerve nörofilament transport görüntüleme ve analizi

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Nörofilament protein polimerleri aksonal taşımanın yavaş bileşeninde aksonlar boyunca ~0.35-3.5 mm/gün ortalama hızlarda hareket eder. Yakın zamana kadar yerinde bu hareketin çalışma sadece radyoizotopik darbe etiketleme kullanarak mümkün oldu, hangi gün bir zamansal çözünürlük ve milimetre bir mekansal çözünürlük ile tüm sinirlerde aksonal taşıma analizi sağlar. Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile yerinde nörofilament taşıma çalışma için, nörofilament protein M nöroniklerde fotoaktivabl GFP ile etiketlenmiş ifade eden bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare geliştirdi. Burada floresan fotoaktivasyon darbe kaçış ve nabız-spread yöntemleri bu fareler ex vivotibial sinirlerin tek miyelinli akson nörofilament taşıma analiz etmek için açıklar. İzole sinir segmentleri oksijenli salin ile perfüzyon ile mikroskop aşamasında korunur ve dönen disk konfokal floresan mikroskop mikroskopile görüntülenir. Mor ışık kısa bir aksonal pencerede floresan etkinleştirmek için kullanılır. Aktive ve yan bölgelerdefloresan zaman içinde analiz edilir, dakika ve mikron sırasına göre zamansal ve mekansal çözünürlük ile nörofilament taşıma çalışma izin, sırasıyla. Matematiksel modelleme hız, yön önyargı ve ortaya çıkan verilerden duraklama davranışı da dahil olmak üzere nörofilament taşıma kinetik parametreleri ayıklamak için kullanılabilir. Nabız kaçış ve nabız yayma yöntemleri de diğer sinirlerde nörofilament taşıma görselleştirmek için adapte edilebilir. Ek transgenik farelerin geliştirilmesi ile, bu yöntemler de görüntü ve akson diğer sitoskelet ve sitosolik proteinlerin aksonal taşıma analiz etmek için kullanılabilir.

Şekil 3, darbe kaçışı ve darbe yayılımı deneylerinden temsili görüntüler gösterir. Biz darbe-kaçış yöntemi ve buverilerinanalizi için yöntemlerimiz5,6,,7,8,17kullanılarak elde edilen verileri açıklayan çeşitli çalışmalar yayınladık. Aşağıda, nabız yayılımı verilerinin daha önce bildirmediğimiz nörofilament taşımacılığının yön ve h...

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanarak genç veya yetişkin farelerden miyelinli aksonların nörofilament popülasyonunun doğrudan görüntülenmesine olanak sağlayarak izole sinir segmentlerinde nörofilament taşımanın yön ve hızını ölçmeyi mümkün kılar. Bu yöntem ilgi protein bir fotoaktiz floresan füzyon ifade farelerin durumu bağlıdır, ancak herhangi bir kolayca parçalanmış sinir kullanılmak üzere adapte edilebilir. Başlamak için, 60 mililitrelik şırınga içine oksijenli tuzlu dökün ve şırıngada minimum hava kaldığından emin olun.Şırıngayı boruya bağlayın ve çıkış tüpünü bir atık şişesine yerleştirin. Dış contayı perfüzyon odası gövdesine yerleştirin, akış giriş ve çıkış direklerinin contadaki deliklerle hizalanmasını sağlayın, sonra iç contayı 1,5 numaralı dairesel örtüye yerleştirin ve sıkı bir mühür sağlamak için contadaki kırışıklıkları dikkatlice düzeltin. Kapak ve contayı kağıt havluya veya conta yukarı bakacak şekilde bir görev mendili üzerine yerleştirin.Omurganın ortasına yakın deride bir dorsal kesi yapmak ve hayvanın ventral yönü etrafında kesmeye devam etmek için büyük diseksiyon makas bir çift kullanın. Yavaşça kas uzak deri çekin ve fasya kesti. Daha sonra, siyatik sinir ortaya çıkarmak için kuyruk ve diz arasında orta uyluk kasları bir kesi yapmak için mikrodiskes makas kullanın.Kas yoluyla görülebilir sinir, kesilmediğinden emin olun. Kas kaldırmak için kesi dorsally ve ventrally genişletin, sonra buzağı kasları kaldırmak, kesikler sığ ve kısa sinirlere zarar önlemek için tutmak. Tibial sinir tamamen topuk siyatik sinir dalları noktadan maruz kalana kadar kasları kaldırmaya devam edin.Forceps bir çift ile omurga proksimal ucunda tibial sinir kavramak ve mikrodizeksiyon makas bir çift ile kesilmiş, sinir için çok fazla gerginlik uygulamak değil emin olun. Dikkatle kas uzak kaldırın ve herhangi bir ekleri kesti, sinir üzerinde gerginlik koymak için dikkat. Tibial sinirin omurga distal ucunu kesin ve oda sıcaklığında oksijenli tuzlu küçük bir Petri kabına aktarın.Sinirproksimal ucundan başlayarak, yavaşça çok ince uç forceps bir çift ile maruz akson biter kavramak. Forceps ikinci bir çift ile, proksimally sinir kılıfı kavramak ve yavaş yavaş bu işlem sırasında hiçbir gereksiz gerginlik uygulandığından emin olmak için sinirdistal sonuna doğru çekin. Sinirproksimal ucunu kavrayın ve yavaşça bir kapak üzerine yatırın, sonra hafif gerginlik altında düzleştirmek.Mikroakemer kaydırakları, oluklu kaydırakla sinirin üzerine yerleştirin ve akış yönünü sinire paralel konumlandırın. Kapak ve mikroakemer tertibatını ters çevirin ve dış contaya karşı olan kaydırakla perfüzyon odası gövdesine yerleştirin. Profüzyon odasını sabitlemek için, metal gövdeye yerleştirin ve kilitleme halkasını döndürün.Yavaşça tuzlu şırınga piston depress ve perfüzyon odası doldurun. Kurulum ve görüntüleme sırasında giriş ve çıkış borusu, çıkış şişesi ve şırıngayı her zaman odanın üzerinde tutun. Profüzyon tertibatını ters bir mikroskop aşamasına aktarın ve tuzlu şırıngayı şırınga pompasına monte edin, ardından motoru çalıştırın ve hızı dakikada 0,25 mililitre akış hızına ayarlayın.Sıralı çözelti ısıtıcıbağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Objektif ısıtıcıbağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Hedefe yağ uygulayın ve profüzyon odasını sahne montajına takın.Oda ısıtıcı ped yağ uygulayın ve perfüzyon odasına takın, sonra bağlayın ve 37 santigrat derece ayarlayın. Profüzyon odasını sahne adaptörüne kilitleyin ve nesnel yağı odanın alt tarafındaki kapak kaymasıyla temas edin. Kapak yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanmak için Brightfield aydınlatmasını kullanın.Miyelinli aksonlar, Brightfield iletilmiş ışık aydınlatması altında kontrast geliştirme olmadan görülebilen bir miyelin kılıfının varlığı ile tanımlanabilir. Bir Brightfield referans görüntü elde, sinir in yön kaydı, sonra bir 488 nanometre lazer ve fotoaktibl GFP için uygun bir emisyon filtresi kullanarak bir konfokal görüntü elde. Lazer gücünü yaklaşık beş kat normal görüntüleme gücüne ayarlayın ve pozlama süresi üç ila dört dakika olan bir görüntü elde edin, ardından beyazlatma adımından sonra aktivasyon öncesi otofloresansı kaydetmek için başka bir konfokal görüntü edinin.Brightfield görüntüsünün istenen etkinleştirme penceresi boyutuna eşit uzunlukta aksonlarla paralel bir çizgi çizin. Bu satırı kılavuz olarak kullanarak, aksonları dik görüş alanına dikdörtgen bir ilgi alanı çizin. 405 nanometre ışıkla desen uyarma ile bu bölgedeki GFP floresansını etkinleştirin ve etkinleştirmeden hemen önce ve hemen ardından bir görüntü elde edilir.Etkinleştirme sona ererken, bir dakikalık zamanlayıcı başlatın. Patladığında, bir timelapse serisi nin edinimi başlar. 0,5 mililitre çift distile suya 250 miligram floresan tozu ekleyin ve görünür parçacıklar olmayana kadar karıştırın, ardından çözünmemiş herhangi bir malzemeyi tortulamak için bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca çözeltiyi döndürün.Bir slayta sekiz mikrolitre floresan çözeltisi ekleyin ve 1,5 kapak lı bir sayı uygulayın. Fazla sıvıyı blotlayın, kapağı ojeyle kapatın ve kaydırağın kurumasını bekleyin. Slayt kapağı tarafını ters mikroskop aşamasına yerleştirin ve odağı kapak kayması yüzeyindeki ince floresan düzlemine ayarlayın.Hava kabarcıkları veya büyük floresan parçacıkları içermeyen bir görüş alanı bulmak için kaydırağı hareket ettirin ve orta daki görüntünün orijinal odak düzlemi olması için 0,2 mikrometre aralıklarla altı mikrometreye yayılan bir Z-yığını edinin. Kamera deklanşörü de dahil olmak üzere tüm ışık yolu panjurlarını kapatın ve lazer gücünü ve pozlama süresini sıfır saniyeye ayarlayın. Karanlık alan görüntüsünü oluşturmak için ortalama olacak bu ayarlarla 100 görüntü yığını edinin.Darbe kaçış ve nabız yayılımı deneylerinden elde edilen temsili görüntüler burada gösterilmiştir. Darbe kaçış yöntemi için, aktive bölgede floresan çürüme kinetik uzun vadeli ve kısa vadeli duraklama davranışı hakkında bilgi verebilir. Etkinleştirilen bölge bu deneyler için kısa olabilir.Floresan nörofilamentler daha büyük bir havuz sağlamak için daha uzun aktif bölge nabız yayma yöntemi için kullanılır. Bu, kanat bölgelerindeki floresan artışının doğrusal olarak kaldığı süreyi uzatır. Burada 15 mikrometre yan pencere kullanılmaktadır.Ölçüm penceresinden gelen toplam floresan ölçüldü. Çürüme, on-track nörofilamentlerin gidişini temsil eden ilk üstel bozunma ve 10 ila 20 dakika arasında ikinci bir yavaş üstel çürümeyi temsil eden, pist dışı filamentlerin gidişini temsil eden darbe kaçış yöntemi için bifhasiktir. Darbe yayılımı stratejisi için, hareketin hız ve yönlülüğünün hesaplamaları sadece yan camların eğimlerine bağlıdır.Burada kullanılan pencere uzunlukları için doğrusal faz yaklaşık beş dakika uzar. Glikoletik olarak inhibe edilmiş bir sinirin timelapse burada gösterilmiştir, aktive bölgenin dışına taşıma belirgin bir azalma gösteren. Gerçekten de, distal ve proksimal eğimler inhibitör ile tedavi sinirlerde önemli ölçüde daha düşüktür.Ayrıca bu iki durum arasında nüfus hızında önemli bir azalma vardır. Bu protokolü denerken, hayvanın kurban edilmesinden sonra sinir sağlığı nın düşmesi nedeniyle diseksiyonu ve oda montaj bölümlerini yaparken aceleci davranmanın çok önemli olduğunu unutmayın. Nöronal hücre kültürü, bu protokol kullanılarak toplanan nüfus ölçeği verilerini tamamlayacak olan bireysel nörofilamentlerin hareketinin ölçülmesine ve analizine izin verebilir.

imaging-analysis-neurofilament-transport-excised-mouse-tibial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Bu yazıda fare siyatik sinir ezmek için bir metodu tanımlar. Bu yöntem, hazır hemostatik forseps kullanır ve kolay ve tekrarlanabilir tam siyatik sinir üretir. Buna ek olarak, siyatik sinir sonra rejenerasyon analizi için uygun kas bütün bağlar hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Floresan mikroskobu kullanarak, aksonal şişliklerde ve bağlantı kopmalarında ilerleyici bir artış gösteren yaralı siniri görselleştirin.

Beyin Hasarı Olan Farelerin Optik Sinirindeki Aksonal Hasarın Elektron Mikroskobik Analizi

Kaynak: Boyer, N. P. et. al., Eksize Fare Tibial Sinirinde Nörofilament Taşınmasının Görüntülenmesi ve Analizi. J. Vis. Uzm.  (2020) Bu video, analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemini göstermektedir. periferik sinirlerin miyelinli aksonlarında nörofilament taşınımı. Teknik, fotoaktif yeşil florofor etiketli nörofilamentleri izleyerek, nörodejeneratif hastalıklarda aksonal taşıma hakkında bilgi sağlar.

Miyelinli Fare Aksonlarında Nörofilament Taşınmasının Floresan Fotoaktivasyon Görüntülemesi 

Dinamik boyuna görüntüleme ve muhabiri transgenik farelerin sinir uçlarının selektif lazer lezyon için protokol sunulmuştur.

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.

Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi

Öğrenin, transgenik farelerdeki miyelinli aksonlarda nörofilament taşımacılığını floresan mikroskopi ile görüntüleme ve hız yön analizi yöntemini. Bu teknik sinir biyolojisi araştırmalarında aksiyonel sağlığı değerlendirmeye olanak tanır.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Daha fazla video keşfet