Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi
16 Temmuz 2020
Kan-beyin bariyeri (BBB) mikrobubble aracılı odaklanmış ultrason (FUS) ile geçici olarak bozulabilir. Burada, ultrason olmayan uzmanlar için erişilebilen modüler bir FUS sistemi kullanarak yüksek verimli BBB açma in vivo için adım adım bir protokol açıklıyoruz.
Diffüz intrinsik pontin glioma gibi yüksek dereceli gliomlar, yüksek mortaliteye sahip oldukça invaziv tümörlerdir. Yıllarca süren kapsamlı araştırmalara rağmen, kan-beyin bariyeri önemli bir husustur çünkü kemoterapi beyne etkili bir şekilde ulaşamaz. Neyse ki, odaklanmış ultrason, etkili tedaviler için kan-beyin bariyerini geçici ve lokal olarak açabilir.
Kan-beyin bariyerinin bozulması için küçük ve uygun maliyetli bir nöro-navigasyonlu odaklanmış ultrason sistemi geliştirdik. Bu sistem, ticari olarak temin edilebilen bileşenlerle inşa edilmiştir ve yüksek derecede otomasyon ile klinik öncesi ilaç değerlendirme çalışmalarına izin verir. Hassas tıp, doğru zamanda doğru hasta için doğru dozda doğru ilacın kullanılması olarak tanımlanır.
Bunu başarmak için, önceden seçilmiş birçok ilacın taranması gerekir. Kan-beyin bariyerinin bozulması için kompakt, yüksek verimli odaklanmış ultrason sistemimiz tam da bunu yapmamızı sağlıyor. Prosedürü göstermek, araştırma grubumdan iki doktora öğrencisi olan Rianne Haumann ve Elvin t Hart olacak.
Görüntü kılavuzluğunda stereotaktik nöro-navigasyon odaklı ultrason iş akışı, ultrason platformunda sonoporasyon için girişimsel görüntüleme ve akustik kuplaj içerir. Sonrasında takip görüntülemesi yapılabilir. Tasarlanan deneyin gereksinimlerine göre uygun bir dönüştürücü seçin.
Gazdan arındırılmış suyla doldurulmuş ve altta akustik olarak şeffaf bir Mylar membran ile kapatılmış 3D baskılı bir koni içine yerleştirin. Dönüştürücüyü bir fonksiyon üretecine ve bir güç amplifikatörüne bağlayın. Otomatik dikey konumlandırma için dönüştürücüyü motorlu bir doğrusal kademeye monte edin ve güç amplifikatörüne bağlayın.
Sıcaklık ayarlı ısıtma, ısırma ve kulak çubukları, anestezi ve çok modaliteli referans belirteçleri içeren çıkarılabilir bir stereotaktik platform kullanın. Platformu 2B doğrusal aşamaya takın. FUS sistemi kullanılmadan önce kalibre edin ve dönüştürücünün odak noktasını belirleyin.
Odak noktası, hayvanın stereotaktik platformdaki dikey konumuna karşılık gelir. Hayvanı varıştan sonra en az bir hafta boyunca tesise alıştırın ve düzenli olarak tartın. Deney gününde, FUS tedavisinden 30 dakika önce deri altı enjeksiyon yoluyla buprenorfin uygulayın.
Fareyi uyuşturduktan sonra, kuru gözleri önlemek için göz merhemi sürün. Gerekirse, hayvanın başının üstündeki tüyleri bir jilet ve tüy dökücü kremle alın. Kalıntıları gidermek için cildi suyla yıkayın.
BLI tümör modelleri ile yapılan deneyler için, 29 gauge insülin şırıngası ile peritoneal olarak 150 mikrolitre D-lusiferin enjekte edin. BBB açılması için mikro kabarcıkların uygulanması için, 26 ila 30 gauge kuyruk damar kateteri yerleştirin ve damarı küçük bir hacimde heparin çözeltisi ile yıkayın. Ayrılmayı önlemek için kateteri doku bandı ile sabitleyin.
Kateterizasyon başarılı olursa, kanın pıhtılaşmasını önlemek için kateteri heparin solüsyonu ile doldurun. Hipotermiyi önlemek için hayvanı sıcaklık ayarlı stereotaktik platforma yerleştirin. Bir ısırma çubuğu ve kulak çubukları kullanarak hayvanın kafasını sabitleyin ve kuyruğu ve kateteri platforma bantlayın.
Farenin gövdesini bir kayışla sabitleyin. Stereotaktik platformu monte edilmiş fare ile görüntüleme modalitesine yerleştirin ve hayvanın görüntülerini çekin. Hayvanın platforma doğru şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini belirleyin.
Dönüştürücünün odak noktasına göre görüntü işleme boru hattı ile birlikte çok modaliteli referans işaretleyicileri kullanarak hayvanın konumunu işaretleyin. Elde edilen x-ışını görüntüsünün üzerine bir beyin taslağı yerleştirerek veya tümörün merkezini belirlemek için BLI görüntülerini kullanarak hedef alanı belirleyin. Dönüştürücüyü yerleştirmeden önce, ultrason jelinin solunumu engellemesini önlemek için hayvanın burun deliklerini ve ağzını bantla koruyun.
Düzgün ses iletimi için farenin kafasının üzerine ultrason jeli uygulayın. Oksipital kemiğin hemen yakınına yerleştirilen iğne hidrofonu ile mikro kabarcık kavitasyonunu kaydedin. Kalibrasyon değerlerine dayanarak, dönüştürücüyü hayvanın üzerinde doğru konuma yönlendirin.
İlgilenilen beyin bölgesini hedeflemek için bağlı tüm cihazlara önceden yapılandırılmış ayarları uygulayın. Dönüştürücü doğru konuma yerleştirildikten sonra, mikro kabarcıkları üretici tarafından açıklandığı gibi çözün ve etkinleştirin. Mikro kabarcık enjeksiyonundan önce, kuyruk damarı erişimini doğrulamak için kuyruk damar kateterini salinle yıkayın.
İnsonication yörüngesini başlatın ve aynı anda mikro kabarcıkları enjekte edin. Aynı zamanda, iğne hidrofonu mikro kabarcık kavitasyonunu gerçek zamanlı olarak algılayacak ve doğrulayacaktır. İstenirse, sonoporasyondan sonra intravasküler bir kontrast madde veya ilaç uygulayın.
Hayvanı önceden belirlenmiş bir zaman noktasına kadar izleyin. Mikro kabarcıklarla kombinasyon halinde 0.4'lük bir mekanik indekse sahip akustik basınç, mikro kabarcıklar enjekte edilmediğinde alt harmoniklerin tespit edilmemesine veya 0.6'lık bir MI uygulandığında atalet kavitasyonunun gözlemlenmesine kıyasla çok hassas ve güvenilir bir kararlı kavitasyon tespiti aracı sağladı. MI'sı 0.6'ya kadar olan akustik basınç makroskopik hasara neden olmazken, mikroskobik hasar histolojik olarak 0.6'lık bir MI'da kanıtlandı.
MI'si 0.8 olan bir basınç genliği, daha büyük damarlarda makroskopik beyin kanaması ve eritrositlerin ekstravazasyonu ile yaygın doku lizisi ile sonuçlandı. Pontin bölgesinde BBB'nin açılmasını doğrulamak için intravenöz Evans mavisi enjekte edildi. FUS ve mikro kabarcıklarla tedavi edilen farede pons ve beyincik seviyesinde Evans mavisi konjuge albüminin ekstravazasyonu gözlendi ve bu da ilgilenilen bölgenin kesin olarak hedeflendiğini gösterdi.
Bu protokolün en önemli adımları, kuyruk ven kateterinin doğru yerleştirilmesi, hayvanın konumlandırılması ve hedeflenmesi ve kavitasyon algılamalı odaklanmış ultrason ile mikro kabarcık enjeksiyonudur. Bu kendi kendine yapılan odaklanmış ultrason sistemi, birden fazla araştırma sorusu için uyarlanabilir ve yeniden tasarlanabilir, bu da uygun maliyetlidir ve otomatik bir iş akışına sahiptir, bu da onu nispeten deneyimsiz araştırmacılar için uygun hale getirir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kan-beyin bariyerinin (BBB) geçici olarak bozulması için modüler bir odaklı ultrason (FUS) sistemi kullanarak yüksek verimli bir protokol sunmaktadır. Mikrokabarcık aracılı sonoporasyondan yararlanarak, bu teknik, BBB tarafından engellenen gliomalar gibi durumlar için tedavilerin etkili şekilde iletilmesini sağlar. Metodoloji, uzman olmayanların in vivo BBB açılımını uygulamasına izin verecek şekilde tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyomedikal Mühendisliği
- Terapik İlaç Uygulama
Arka Plan
- Yüksek dereceli gliomalar, BBB nedeniyle sınırlı tedavi seçeneklerine sahip oldukça invaziv tümörlerdir.
- Odaklı ultrason, BBB bozulması için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır.
- Uzman olmayanlar tarafından kolayca kullanılabilen maliyet etkin cihazlara durum vardır.
- Burada özetlenen protokol, klinik öncesi ilaç değerlendirme çalışmalarını güçlendirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- BBB bozulması için yüksek verimli bir FUS sistemi geliştirmek.
- Hassas tıp uygulamaları için önceden seçilmiş ilaçların taranmasını sağlamak.
- Prosedürü otomatik bir sistem kullanarak etkili bir şekilde göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- In vivo deneyler için modüler bir odaklı ultrason sistemi kullanılmıştır.
- BBB bozulması ve terapötik ajanların iletimi çalışmak için fare modelleri kullanılmıştır.
- Süreç, sonoporasyon için girişimsel görüntüleme ve akustik çiftlemeyi içerir.
- Kritik adımlar arasında hayvan alıştırması, anestezik uygulaması, kateterizasyon ve ultrason transdüserinin kesin konumlandırılması bulunmaktadır.
Ana Sonuçlar
- Prosedür, BBB boyunca ilaç iletiminin geliştirilmesine yönelik güvenilir bir şekilde yeteneğini göstermiştir.
- Tedavi etkinliğini izlemek için mikrokabarcık kavitasyon tespiti esastır.
- Niteliksel sonuçlar, BBB bozulmasının kesin lokalizasyonunu doğrulamıştır.
- Ultrason uygulamasından sonra sistemik etkiler ölçülmüş ve güvenlik ile etkinliği göstermiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, BBB bozulması için pratik ve etkili bir yöntem oluşturarak gelişmiş terapötik müdahalelere olanak tanır.
- Özelleştirilebilir FUS sistemi, ilaç iletimi ve CNS hastalıklarının tedavisinde daha fazla araştırma için bir temel sağlar.
- Elde edilen bilgiler, nöroloji koşullarında hassas tıp ve terapötik hedefleme konusundaki anlamayı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This high-throughput focused ultrasound system enables precise, reproducible blood-brain barrier opening in rodent models, directly supporting preclinical drug evaluation for CNS therapeutics. By integrating image-guided stereotactic navigation with automated cavitation monitoring, the system reduces variability and enhances data reliability in high-volume screening campaigns. Its cost-effective, modular design facilitates scalable implementation across discovery workflows targeting glioma and other brain diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of blood-brain barrier permeability for target validation in glioma models.
- Operational Value: Supports standardized, automated workflows that reduce intra-group variability and improve reproducibility in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cavitation detection as a biomarker for successful blood-brain barrier opening.
- Operational Value: Enables high-throughput screening of preselected drug compounds through automated transducer positioning and microbubble delivery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Validated in patient-derived xenograft models of glioblastoma and diffuse midline glioma, ensuring disease-relevant preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by confirming precise, localized drug delivery across the blood-brain barrier.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling image-guided, reproducible blood-brain barrier disruption for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of blood-brain barrier modulation in glioma models through precise, stereotactic targeting.
- Screening: Delivers assay readiness via automated workflows, standardized microbubble injection, and real-time cavitation monitoring for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cavitation signals, Evans blue extravasation, and histological confirmation of barrier opening.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through validation in patient-derived glioma models, supporting biomarker-aligned therapeutic assessment.
- Enterprise Reuse: Built from commercially available components with a modular design, enabling adaptation across multiple research questions and repeated use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in blood-brain barrier penetration data, reducing mechanistic ambiguity in CNS drug delivery.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation and image-guided targeting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative blood-brain barrier opening data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS drug candidates based on confirmed, localized barrier disruption and drug delivery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, ultrasound physics, and microbubble handling.
- Needs instrumentation including function generator, power amplifier, motorized linear stage, needle hydrophone, and imaging modalities (X-ray, bioluminescence).
- Demands cross-team standardization of animal preparation, catheterization, and transducer calibration procedures.
- Involves adaptation considerations for different transducer frequencies, targeting coordinates, and model systems (e.g., rat vs. mouse).
- Practical limitations include the need for surgical skill in tail vein catheterization and potential variability in skull thickness affecting ultrasound transmission.
