Name: Kistik Fibrozis Zebrabalık Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Faj Tedavisi Uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Keşfedin kistik fibrozisli Danio rerio embriyolarında Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonuna karşı faj kokteyli hazırlama ve uygulama protokolünü. Bu yöntem, faj tedavisinin in vivo etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı tarafından desteklenmiştir (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo ve FFC#23/2019; Più Onlus La Mano tesa Onlus içinde Un respiro).

AB türünden (Avrupa Zebrabalığı Kaynak Merkezi EZRC) yetişkin zebra balıkları(Danio rerio),bilimsel amaçlariçin kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin uluslararası (AB Direktifi 2010/63/EU) ve ulusal yönergelere (İtalyankararnamesi 4 Mart 2014, n. 26) uygun olarak muhafaza edilmektedir. Standart koşullar 14 saat Açık/10 h karanlık çevrim ve 28 ° C tank su sıcaklığı ile balık tesisinde ayarlanır.
1. Çözüm ve araçların hazırlanması
<ol><li>Zebra balığı embriyoları yetiştirmek için E3 embriyo ortamı için 50x stok çözümü ve 1x çalışma çözümleri hazırlayın (Bkz. Tablo 1).</li>
	<li>24 saat sonra döllenme (24 hpf) (Tablo 1bakınız) embriyo pigmentasyon engellemek için, pigmentasyon engelleme çözeltisi olun.</li>
	<li>Tablo 1'deaçıklandığı gibi 25x stok ve 1x çalışma Tricane anestezik çözeltisi hazırlayın. NOT: Çözeltinin stok çözeltisine zarar verebilecek çözeltinin tekrar tekrar donmasını ve erimesini önlemek için 2 mL 25x tricaine'lik aliquots yapın ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>100 mL'lik distile H2O'nun mikrowavable bir şişede 1 g agarose'u eriterek embriyo mikroenjeksiyonu için izler hazırlayın. Mikrodalga 1-3 dk agarose tamamen çözülene kadar.</li>
	<li>Zebrabalığı mikroenjeksiyon kalıplarını konumlandırın (bkz. Malzemeler Tablosu)petri kabında (90 mm x 15 mm) ters çevrilmiş ve sıvı agarose jeli yaklaşık 10 mm genişliğe dökerek tüm yüzeyi kaplayın.</li>
	<li>Agarose katıladıktan sonra kalıbı çıkarın. Petri kabını 1x E3 embriyo ortasıyla doldurun. Bu yaklaşık bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Kullanmadan önce Tricaine içeren taze E3 ortamıile değiştirin. NOT: Eski kalıplarda mantar veya bakteriyel kontaminasyon gelişebilir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon için iğnehazırlamak ve kolları sıkarak mikropipet çekmeceonları güvenli için yangın cilalı 10 cm borosilikat kılcal kullanın. Aşağıdaki ayarları ile çekmece ayarlayın: ısı 500, hız 100, zaman 150, çekme 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) inokül hazırlama
<ol><li>GFP+P. aeruginosa zorlanma PAO119 5 mL LB suyu (Tablo 1bakınız) ve sallayarak (200 rpm) ile 37 °C'de bir gecede büyümek 1 koloni aşılayın.</li>
	<li>Yukarıdaki gece kültürünü OD600 = 0,1'e seyreltin 10 mL LB suyu ve 37 °C'de OD600 = 0,5'e kadar sallayarak (200 rpm) büyüyün.</li>
	<li>16.100 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca 2 mL'lik kültür ve hücre peletini od600 = 1'e, fizyolojik çözeltinin 1 mL'sine eşdeğer olarak 1 x 109 cfu/mL'ye yeniden askıya alın (Bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna fizyolojik çözeltide yaklaşık 5 x 107cfu/mL seyreltin ve 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. Faj stok hazırlama
<ol><li>1 p. aeruginosa süzme PAO1 kolonisi 5 mL LB suyu ve sarsıntı ile 37 °C gecede kuluçka. Bir gecede kültürü500 mL LB suyu içinde OD 600 = 0,01'e seyreltin ve 37 °C'de od600 = 0,05 ile büyüyün, yaklaşık 2,5 x 107 cfu/mL'ye eşdeğer.</li>
	<li>P. aeruginosaseyreltilmiş kültür için , 10-3enfeksiyon (M.O.I.) çokluğu elde etmek için, yaklaşık 1,25 x 107 fajekleyin. OD600 yaklaşık 0.1-0.3 (yaklaşık 3-5 saat, kullanılan faj bağlı olarak) düşer kadar sallayarak 37 °C'de kuluçka. NOT: PAO1 türünü etkileyen bu deney için dört faj seçilmiştir: İki Podoviridae, GenBank katılım numaraları vB_PaeP_PYO2, MF490236 ve vB_PaeP_DEV, MF490238 ve iki Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 ve vB_PaeM_E217, MF490240. Her faj için aşağıdaki adımları ayrı ayrı gerçekleştirin.</li>
	<li>37 °C'de 30 dakika boyunca 1 mg/mL DNase ve RNase ile inkübedin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve supernatant'ı (SN) dikkatlice kurtarın. SN'yi 0,8 m gözenek çapına sahip bir filtreyle filtreleyin.</li>
	<li>SN'ye 58 g/L NaCl ve 105 g/L PEG6000 ekleyin. RT 20 dk'da karıştırarak eritin ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Faj yağışı için 4 °C'de 30 dk için 20, 000 x g santrifüj. SN'yi çıkarın ve faj peletini 15 mL TN tamponunda dikkatlice eritin (Bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi CsCl yoğunluk gradyanı ile fajları arındırın.<ol>
<li>SW41 rotor için poliallomer ultracentrifuge tüplerde, Tablo 1'detanımlanan dört CsCl çözeltisinin 2 mL'sini tabakalandırarak CsCl adım yoğunluğu gradyanı hazırlayın.  4 tüpün her birine 3,5 mL faj süspansiyonu ekleyin. NOT: CsCl toksiktir, işlemek ve atmak için uygun güvenlik prosedürleri benimsemek.</li>
		<li>Tüpleri rotora tanıtılın ve tüplerin dengeli olduğundan emin olun (iki bakan tüp arasındaki ağırlık farkı 0,01 g ≤ olmalıdır).</li>
		<li>4 °C ve 100, 000 x g (SW41 rotor için 25.000 rpm) 2 saat için santrifüj. Santrifüjden sonra tüpleri yavaşça çıkarın ve dikkatlice bir destek le hareketsiz hale getirin. 19 G iğneli bir şırınga kullanarak, genellikle d=1.5 ile d=1.4 yoğunluk bölgesi arasında bulunan beyaz/opalescent bandını çizin.</li>
		<li>Şırıngadan gelen süspansiyonları SW60 rotor için yeni poliallomer tüplere aktarın ve tüpleri hassas bir şekilde dengelemek için d=1.4 çözeltisini kullanın.</li>
		<li>Süspansiyonu en az 16 saat boyunca 4 °C ve 150.0000 x g (SW60 rotor için 38.000 rpm) olarak santrifüj edin.</li>
		<li>Yukarıdaki gibi görünür bandı toplayın (bkz. adım 3.3.3) ve 6.000 Da kesme ile diyaliz tüplerine aktarın. Elde edilen görünür bandı 2x 2x'te 500 mL suya karşı 20 dk ve bir gecede 500 mL TN tampona karşı diyalize alın. 0,22 m gözenek filtresi ile filtre uygulayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Faj kokteyli hazırlama
<ol><li>Daha önce izole ve karakterize PAO1, bulaşmasını dört fajlar bir karışımını olun8. Karıştırmadan önce, plak tsay20ile her faj stok titresini tahmin .</li>
	<li>Her deneyden hemen önce aynı pfu/mL'de dört faj preparatını eşit olarak karıştırarak, 5 × 108 pfu/mL'lik genel bir titre ile faj kokteylini bir araya getirin ve doğru faj titrelerini sağlayın.</li>
</ol>5. Cftr morpholnos mikroenjeksiyon için zebra balığı embriyolarının toplanması ve hazırlanması
NOT: Ctr morpholinos(cftr-MOs) mikroenjeksiyonu için yabani tip zebra balıklarından 1-2 hücreli embriyo toplayın.
<ol><li>Bakteriyel mikroenjeksiyon deneyiki gün önce, üreme çiftleri kurmak ve daha önce açıklandığı gibi embriyoları toplamak21. AB suş yetişkin zebra balığı(Danio rerio)Avrupa Zebrafish Kaynak Merkezi, EZRC satın alındı.</li>
	<li>Ertesi gün, plastik bir pipet ile döllenme hemen sonra veya ince örgü süzgeç kullanarak embriyolar toplamak. Toplanan embriyoları E3 embriyosu içeren bir Petri kabına yerleştirin ve embriyo gelişimine zarar verebilecek kontaminasyonu önlemek için enkazı plastik bir pipetle dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Steril suda iki morfinno stok çözeltisini (1 mM) 0,25 pmol/embriyo ATG-MO + 0,25 pmol/embriyo splice-MO'ya seyrelterek 5 μL morfin enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Embriyo enjeksiyonunu takip etmek için, morpholno enjeksiyon çözeltisi karışımına 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyin.</li>
	<li>Bir mikroenjeksiyon iğnesini, ince jel yükleme ucuna sahip 20 μL'lik bir mikropipet kullanarak morpholno karışım çözeltisinin yaklaşık 5 0L'si ile yükleyin. İğneyi bir standa bağlanan mikromanipülatöre sabitle ve stereomikroskop altında yerleştirin. NOT: Mikroenjektör pompasının basıncı onu iteceği için çözeltinin iğnenin ucuna ulaşması gerekli değildir.</li>
	<li>İğne ucunu ince steril cımbızla keserek iğnenin ucunu kırpın. Mikroskobun oküler bir ölçek çubuğu kullanarak damla çapını ölçün. Alternatif olarak, bir mikrometre slayt üzerine mineral yağ bir damla oluşturmak ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağ damla içine çözelti enjekte ederek mikroenjeksiyon hacmi ayarlayın. 2 nL hacim enjekte etmek için 156 μm çapında bir damla kullanın.</li>
	<li>Kullanılan iğneye bağlı olarak doğru enjeksiyon hacmini elde etmek için kompanzasyon basıncını 15 hPa'ya, enjeksiyon süresini 0,5 s'e ve enjeksiyon basıncını 300 ile 600 hPa arasında ayarlayarak mikroenjektörü ayarlayın.</li>
	<li>Plastik bir pipet ile embriyoları adım 5.2'den 96 mm çapında ki Petri kabına yerleştirilmiş bir camın üzerine yerleştirin. NOT: Çok fazla E3 orta embriyoların chorion içine mikroenjeksiyon iğne uygun penetrasyon önleyecektir.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi embriyo içine 2 nL enjekte etmek için chorion ve daha sonra iğne ile sarısı nüfuz22.</li>
	<li>Enjekte edilen embriyoları E3 orta ile petri kabına yerleştirin ve 28 °C'de bir kuvöze koyarak ertesi güne kadar geliştirmelerini sağlar.</li>
</ol>6. Bakteri ve faj kokteyli ile zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyonu
NOT: Sistemik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için, embriyo genellikle 26 hpf sonra başlar kan dolaşımı na sahip olmalıdır.
<ol><li>Sonra 26 hpf (zebrabalığı gelişim aşamalarında Kimmel bakın21)pronase çözeltisi ile pronase çözeltisi ile pronase tozu 2 mg / mL konsantrasyonda E3 ortamda eriterek hazırlanan embriyolar. Yavaşça chorion kırmak için embriyolar pipet. Pronase/E3 ortamını atın ve tüm pronase'yi çıkarmak için yemeği taze E3 ile birkaç kez durulayın.</li>
	<li>E3 ortamda anti-balık embriyoları anestezi ktrikoin içeren yaklaşık 5 dk önce enjeksiyonlar.</li>
	<li>Pipet anestezi embriyoları parça içine adım 1 hazırlanan. Yanal pozisyonda embriyolar hattı için ince bir jel yükleme ucu kullanın.</li>
	<li>Bölüm 5'te açıklandığı gibi p. aeruginosa preparatının yaklaşık 5 μL'si ile bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.</li>
	<li>İğneyi, sarısı kesesinin üzerine yayılmaya başladığı Cuvier kanalının başlangıç noktasına yerleştirin. 1-3 nL hacim enjekte edin ve hacmin doğrudan kanal içinde genişleyip dolaşıma girmesini sağlayın.</li>
	<li>Enjekte edilen her 50 embriyodan yaklaşık olarak sonra, enjeksiyon hacminin aynı kalıp karip karip devam edip etmeyin kontrol etmek için 100 μL steril PBS ile 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri enjekte edin. CFU'yu değerlendirmek için bir gecede 37 °C'de LB agar Üzerinde inoculum plakası (Bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Mikroenjekte edilmiş embriyoları taze E3 orta + PTU ile iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Seçilen iki zaman noktasında: bakteri enjeksiyonundan 30 dakika veya 3 saat sonra, Petri yemeklerinden birini kuvözden bakteri enjekte edilmiş embriyolarla dışarı atın ve 6.3'te faj kokteyli enjeksiyonu için açıklandığı şekilde pistte hizalayın.</li>
	<li>Bir mikroenjeksiyon iğnesini, faj kokteylinin yaklaşık 5 μL'si (adım 4'te hazırlanmış) ince bir jel yükleme ucuyla yükleyin ve mikroenjektöre sabitleştirin (bkz. adım 5).</li>
	<li>Daha önce bakteri enjekte embriyoların Cuvier kanalında faj kokteylenjekte.</li>
	<li>Mikroenjekte edilmiş embriyoları taze E3 orta + PTU ile iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>7. PAO1 ve fajlar enjekte edilen embriyoların bakteriyükünün değerlendirilmesi
<ol><li>8 hpi'de pipet 15 anestezili embriyo Petri kabından 1,5 mL santrifüj tüpüne kadar uzanır.</li>
	<li>Anestezik solüsyonu PBS 'de (PBSTritonX) 300 μL %1 Triton X-100 ile değiştirin ve embriyoları en az 15x insülin şırıngasından steril 27-G iğneile geçirerek homojenize edin.</li>
	<li>Seyreltilmiş homojenin 100 μL'sini steril PBS'nin 900 μL'lik kısmına aktararak steril PBS'deki homojenlerin seri seyreltmelerini hazırlayın.</li>
	<li>Doğal olarak amp-dirençli PAO1 suşu için seçmek için, lb agar üzerindeki seyreltmelerin plakası 100 μL ampisilin (100 μg/mL) ile eklenir ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, kolonilerin sayısını sayın, cfu toplam sayısını belirlemek için seyreltme faktörü ile çarpmak ve CFU / enfekte embriyo ortalama sayısını elde etmek için homojenize embriyo sayısı ile bölün.</li>
</ol>8. PAO1 ve fajenjekte edilen embriyoların öldürücülüğünün değerlendirilmesi
<ol><li>PAO1 enfeksiyonunun ölümcüllüğünü değerlendirmek için enjekte edilen embriyoları stereomikroskop altında 20 hpi olarak puanlandırın ve ölü embriyolar için sayıyapın (beyaz/saydam değil).</li>
	<li>Enjekte edilen embriyoların %50'sinin 20 hpf'de ölümünü belirleyen pao1'in 50 (LD50) dozu yarı maksimal öldürücü konsantrasyonunu hesaplayın.</li>
</ol>9. GFP+ PAO1 enfeksiyonunun stereomikroskop zaman atlamalı görüntülemesi için embriyo hazırlığı
<ol><li>100 mL E3 çözeltisinde %1.5 düşük erime agaroseer eriterek canlı embriyo görüntüleme için kalıbı önceden değiştirin.</li>
	<li>Embriyoları anestezik için %1 Tricaine ekleyin (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>At 4 hpi bir cam alt çanak plastik bir pipet ile bir embriyo transferi ve sıcak düşük erime noktası agarose çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Cam alt çanağı stereomikroskop altında yerleştirin ve bir uç ile embriyoyu istenilen yönde konumlandırın. Dikkatle embriyo agarose bir damla eklemek için plastik bir pipet kullanın.</li>
	<li>Agarose 5-10 dakika soğumasını bekleyin ve yavaşça embriyo nemli tutmak için anestezik çözelti içeren E3 ile cam alt çanak doldurun.</li>
	<li>GFP+ bakteriler için floresan filtre (kanal 488 nm) ile floresan stereomikroskop altında embriyo ile cam alt çanak yerleştirin. 9, 14 ve 18 hpi aynı parametrelere sahip daha fazla satın alma kadar Petri çanak çıkarmayın.</li>
</ol>10. Pro-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu analizleri
<ol><li>20 hpi tricaine 1x çözeltisi ile embriyolar anestezi ve Petri çanak bir 1.5 mL santrifüj tüpü onları transfer.</li>
	<li>Bir duman kaputunun altında anestezik çözeltiyi çıkarın ve 200 μL guanidium hidroklorür reaktifi ile değiştirin.</li>
	<li>Embriyoları önce 200 μL'lik bir pipet, sonra en az 15 x steril 27 G iğneli bir insülin şırıngası ile tekrar tekrar pipetleyerek homojenize edin.</li>
	<li>Üreticinin talimatları uyarınca, ticari olarak kullanılabilen guanidium hidroklorür reaktiflerini kullanarak homojenize edilmiş zebra balığı embriyolarından toplam RNA ayıklayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uyarak, her RNA örneğinin 1 μg'sini 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-free) ile tedavi edin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre toplam 20 μL hacimde, ticari olarak kullanılabilen kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonu (RT) için RNA'yı 1 μg DNa'yı tedavi ettim.</li>
	<li>RT reaksiyonunun 1:6 seyreltilmesinin 1,5 μL'sini kullanarak 1x SYBR Green mastermix içeren 10 μL'lik toplam hacimde RT qPCR reaksiyonu gerçekleştirin. Normalleştirme amacıyla, ev tutma genleri rpl8 ve pro-inflamatuar sitokinler için astarkullanın, TNF-α ve IL-1β için astar kullanın (Tablo 2'yebakınız). qPCR protokolü oldu: döngü 1 adım 1: 95 °C, 2 dk, bir kez tekrarlayın; döngüsü 2: adım 1 95 °C, 10 s, adım 2 55 °C, 30 s, tekrar 40x; döngüsü 3: adım 1 72 °C, 15 dk.</li>
</ol>

<ol><li>Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment%3A+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+phage+therapy+in+cystic+fibrosis%3A+Essential+human-bacterial-phage+interactions+and+delivery+considerations+for+use+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).</li>
<li>Pacios, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+combat+multidrug-resistant+and+persistent+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases.</a> Antibiotics. 9 (2), 65(2020).</li>
<li>Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplication+of+bacteriophage+in+vivo+and+its+protective+effect+against+an+experimental+infection+with+shigella+dysenteriae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae.</a> Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).</li>
<li>Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+therapeutically+administered+bacteriophages+in+Pseudomonas+aeruginosa+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients.</a> Burns. 32 (5), 644-656 (2006).</li>
<li>Heo, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+efficacy+of+phages+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+mice+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646(2009).</li>
<li>McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+a+mouse+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028(2007).</li>
<li>Forti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+broad-range+bacteriophage+cocktail+that+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+treats+acute+infections+in+two+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573(2018).</li>
<li>Jault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+a+cocktail+of+bacteriophages+to+treat+burn+wounds+infected+by+Pseudomonas+aeruginosa+%28PhagoBurn%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial.</a> Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).</li>
<li>Clatworthy, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+of+zebrafish+involves+both+host+and+pathogen+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants.</a> Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).</li>
<li>Bernut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Protects+against+Mycobacterium+abscessus+Infection+by+Fine-Tuning+Host+Oxidative+Defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses.</a> Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).</li>
<li>Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+phage+therapy+efficacy+in+Burkholderia+cepacia+complex+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388(2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Doring, G., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+innate+immunity%3A+how+chloride+channel+mutations+provoke+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease.</a> Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).</li>
<li>Navis, A., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cftr+function+leads+to+pancreatic+destruction+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish.</a> Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).</li>
<li>Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cftr+controls+lumen+expansion+and+function+of+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 140, 1703-1712 (2013).</li>
<li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979(2015).</li>
<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazıda, zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa (PAO1) enfeksiyonu nun nasıl uygulanacağı ve daha önce PAO1'e bulaşabildiği tespit edilen bir faj kokteyli ile faj tedavisinin nasıl uygulanacağı protokolünü açıklanmıştır. Antibiyotik tedavisine alternatif olarak bakteriyofajkullanımı son birkaç yıldır artan ilgi olmuştur. Bunun başlıca nedeni, halk sağlığı için ciddi bir sorun teşkil eden çoklu ilaca dirençli (MDR) bakteriyel enfeksiyonların yayılmasıdır. Tabii ki, bu çalışmanın kapsamı bir hayvan modeli değ...

Faj tedavisi, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele için bakterilerin doğal düşmanlarının kullanımı, antibiyotiklere bakteriyel direnç yaygın hale geldikçe yenilenen ilgi topluyor1,2. Bu tedavi, Doğu Avrupa'da yıllardır kullanılan, CF olan hastalarda akciğer enfeksiyonları kür antibiyotikler için tamamlayıcı bir tedavi ve şu anda kullanılan antibiyotikler tüm dirençli bakteriler ile enfekte hastalar için olası bir tedavi alternatif olarak kabul edilebilir2,3. Antibiyotik tedavisinin avantajları bakteriyofajlar enfeksiyon yerinde çoğalmak vardır, antibiyotikler metabolize edilir ve vücuttan ortadan kaldırır ise4,5. Nitekim, farklı laboratuvarlarda izole öldürücü fajlar kokteyllerin uygulanması böcek ve memeliler6,7,,8gibi farklı hayvan modellerinde Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlarıtedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır . Faj tedavisi de randomize klinik çalışmada P. aeruginosa ve Escherichia coli ile enfekte yanık yaralarıbakteriyel yükü azaltmak mümkün olduğu gösterilmiştir9.
Zebra balığı(Danio rerio)son zamanlarda p. aeruginosa10,,11, Mycobacterium apse ve Burkolderia cepacia12dahil olmak üzere çeşitli patojenler ile enfeksiyonları incelemek için değerli bir model olarak ortaya çıkmıştır 12,13. Bakterileri doğrudan embriyo kan dolaşımına mikroenjekte ederek14,insan karşısına benzer nötrofiller ve makrofaj oluşumu ile korunmuş olan zebrabalığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından etkisiz hale getirilebilen sistemik bir enfeksiyon oluşturmak kolaydır. Ayrıca, yaşamın ilk ayı boyunca, zebra balığı embriyoları adaptif bağışıklık yanıtı eksikliği, onları doğuştan gelen bağışıklık eğitimi için ideal modeller yapma, hangi insan akciğer enfeksiyonları kritik savunmamekanizması15. Zebrabalığı son zamanlarda daha iyi CF başlangıcı anlamak ve yeni farmakolojik tedaviler geliştirmek için güçlü bir genetik model sistemi olarak ortaya çıktı10,16,17. Cftr knock-down CF zebrabalığı knock-down zebrabalığı morfinono enjeksiyonu ile oluşturulan bir sönümlü solunum patlaması yanıtı ve azaltılmış nötrofil göçsundu 10, cftr knock-out bozulmuş iç organ pozisyonu ve ekofrin pankreas imha yol açar ken, insan hastalığı aynalar bir fenotip16,17. En büyük ilgi p. aeruginosa bakteriyel yük önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulma oldu -ctr kaybı-fonksiyon embriyoları 8 saat post-enfeksiyon (hpi), hangi fareler ve insan bronşiyal epitel hücreleri ile elde edilen sonuçlara paralel kontroller daha2,18. cftr
Bu çalışmada, faj tedavisinin zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu gösterin.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>ortak adı trikain</td></tr><tr><td>Femtojet Mikromanipülatör</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/kahverengi P-97</td><td>Sutter Enstrüman Şirketi</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Erime Noktalı Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Metil Mavi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon iğneleri</td><td>Harvard aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiyoüre > =% 98</td> <td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Morpholino</td><td>Gen Araçları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Araştırmacı PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>tarafından tasarlanan 528877</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür ACS reaktifi, vb; % 99.0</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Oksoit</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Oksoit</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Mikroenjeksiyon</td><td>Kelime Hassas Aletler</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kistik fibrozis zebrabalık embriyolarında pseudomonas aeruginosa enfeksiyonuna karşı faj tedavisi uygulaması

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Tanısal belirsizlik ve antimikrobiyal overprescription önemli bir sonucu olan antimikrobiyal direnç, toplumumuz ve sağlık sistemi üzerinde büyük bir etkisi ile ciddi enfeksiyonlar, komplikasyonlar ve mortalite dünya çapında giderek tanınan bir nedenidir. Özellikle, bağışıklık sistemi zayıf veya kistik fibrozis (CF) gibi önceden var olan ve kronik patolojileri olan hastalar, multiila dirençli izolasyonların görünümü ve difüzyonu ile enfeksiyonları kontrol etmek için sık antibiyotik tedavileri tabi tutulur. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyonlara karşı alternatif tedaviler ele acil bir ihtiyaç vardır. Bakterilerin doğal düşmanları olan bakteriyofajların kullanımı olası bir çözüm olabilir. Bu çalışmada ayrıntılı protokol CF zebra balığı embriyolarında Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonuna karşı faj tedavisi nin uygulanmasını açıklamaktadır. Zebra balığı embriyoları, CF embriyolarında öldürücülüğü, bakteriyel yükü ve pro-inflamatuar immün yanıtı azalttığı için faj tedavisinin P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu göstermek için P. aeruginosa ile enfekte edildi.

Burada sunulan sonuçlar ve rakamlar cftr morfonoenjeksiyonu ile üretilen CF embriyolarına daha önce10 ve adım 5'te açıklandığı gibi atıfta bulunulmuştur. CF fenotipini doğrulamak için, daha önce açıklandığı gibi kalp, karaciğer ve pankreas gibi iç organların bozulmuş pozisyonu17 (Şekil 1)dikkate alındı. Benzer sonuçlar, önceki yayınımızda bildirilen WT embriyoları durumunda elde edilebildi19.
<p class="jove_...

Burada sunulan Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu ve kistik fibrozis faj tedavisi uygulaması için bir protokoldür (CF) zebra balığı embriyoları.

Kistik Fibrozis Zebrabalık Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Faj Tedavisi Uygulaması

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Bu protokol zebra balığı embriyolarında pseudomonas aeruginosa karşı viral ve faj kokteylhazırlanması ve uygulanması kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı, bakteriyel enfeksiyonla mücadelede faj etkinliğinin in vivo bir değerlendirmesini sağlamasıdır. Faj kokteyli hem yabani tip hem de kistik fibrozis zebrabalığı modellerinde etkilidir.Kistik fibrozis hastalarında faj tedavisinin bakteriyel enfeksiyonlara uygulanması imkanının açılması. Faj tedavisi de diğer model sistemlerinde belirli bakteriyel enfeksiyonları niçin karşı koymak için uygulanabilir. Deney için bir faj stoku hazırlamak için.0.05 P.aeruginosa kültürünün bir kat10'luk enfeksiyonuna 7. Kuluçka sonunda 37 santigrat derece 30 dakika boyunca DNAse ve RNaE mililitre başına bir mikrogram ile lysate inkübat. Ve santrifüj ile hücreleri pelet.Santrifüj filtresisonunda 0,8 mikro metre gözenek çapı ile supernatant ve peg 6000 litre başına sodyum klorür litre başına 58 gram ekleyin. Çözeltiyi bir gecede 4 derece yedirin. Ertesi sabah, fajı santrifüjle çökeltin.Santrifüj sonunda supernatant kaldırmak ve dikkatle Tris sodyum klorür tampon 15 mililitre faj pelet eritin. Sezyum klorür yoğunluğu gradyanı ile fajları arındırmak için, ilk bir SW 41 Rotor için poliallomer ultracentrifuge tüplerdört farklı sezyum klorür çözeltisi iki mililitre tabakalı ve her tüp için faj süspansiyon 3.5 mililitre ekleyin. Sezyum klorür zehirlidir.Bu bileşiği işlerken ve atırken her zaman uygun güvenlik prosedürlerini uygulayın. Tüm tüpler yüklendiğinde, tüplerin dengeli olduğuna dikkat edin, tüpleri rotora yerleştirin. Ve örnekleri 100, 000 kez g ve dört santigrat derecede iki saat santrifüj edin.Santrifüjsonunda, D arasındaki beyaz tabaka 1,5 ve D 1,4 yoğunluk bölgeleri eşittir arasındaki beyaz tabaka aspire etmek için 19 gauge iğne ile bir şırınga kullanın. Ve yeni SW 60 boyutunda poliallomer tüpler içine süspansiyonlar aktarın. Süspansiyonları 150, 000 kez g ve dört santigrat derecede en az 16 saat santrifüj edin.Ve görünür bantları 6,000 Dalton kesiğiyle diyaliz tüplerine aktarın. Daha sonra toplanan numuneleri diyaliz başına 20 dakika boyunca 500 mililitre suya karşı iki kez ve bir gecede 500 mililitre Tris sodyum klorür tamponuna karşı diyalize koyun. Ertesi sabah, ortaya çıkan faj stoğunu 0,22 mikro metre gözenek filtresi ile filtreleyin ve stoku dört santigrat derecede saklayın.Mikro enjeksiyon gününde beş mikrolitre morfolino enjeksiyon çözeltisi elde etmek için embriyo başına 0,25 picomolar nihai konsantrasyona steril suda iki bir mikromolar morpholnos stok çözeltileri seyreltmek. Ve her çözeltiye 0,5 mikrolitre fenol kırmızısı ekleyin. Sonraki morpholino karışık çözelti tüm hacmi ile bir mikro enjeksiyon iğnesi yüklemek ve bir mikro manipülatör bir stereo mikroskop altında bir standbağlı bir mikro manipülatör için iğne güvenli ince jel yükleme ucu ile 20 mikrolitrelik mikropipet kullanın.Sonra bir veya iki hücre ile, zebra balık embriyoları bir cam slayt üzerinde düzenlenmiş 96 milimetre çapında Petri çanak içine yerleştirilen, mikro enjeksiyon iğne ucu ile chorion ve sarısı nüfuz ve embriyo içine morphlino karışımı iki nanolitre enjekte. 26 saat sonra döllenme, P.aeruginosa inoculum yaklaşık beş mikrolitre ile bir mikro enjeksiyon iğnesi yükleyin ve kanal yumurta kesesi üzerinde yayılmaya başlar Cuvier kanalının başlangıç noktasına iğne dorsally takın. Embriyoiçine PAO1 inoculum bir ila üç nanolitre enjekte hacim doğrudan kanal içinde genişler ve dolaşıma girer emin olun.Enjeksiyondan sonra 28 santigrat derecede 30 dakika veya üç saatlik kuluçka için fenilthiourea ile takviye taze E3 orta içeren iki yeni Petri bulaşıkbirine embriyo transferi. Daha sonra, faj kokteyli yaklaşık beş mikrolitre ile bir mikro enjeksiyon iğnesi yükleyin ve mikro enjektör için iğne düzeltmek. Daha sonra daha önce bakteri enjekte her embriyocu kanalına faj kokteyli bir ila üç nanolitre enjekte ve 28 santigrat derece fenilthiourea ile desteklenen taze E3 orta içeren iki yeni Petri yemekleri içine embriyolar yerleştirin.Enfeksiyon dan sonra dört saat, bir cam alt çanak içine anestezi embriyo aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Ve sıcak düşük erime noktası agarose çözeltisi ile çanak doldurun. Agarose soğuk olduğunda, yavaşça anestezik çözelti ile takviye E3 orta ile çanak doldurun.Yemeği stereo mikroskobun altına yerleştirin ve embriyoyu istenilen yönde konumlandırmak için bir pipet ucu kullanın. Daha sonra, 18 saate kadar enfeksiyon sonrası GFP pozitif bakteriler için floresan filtre ile bir floresan stereo mikroskop altında çanak yerleştirin ve dokuz, 14 ve 18 saat post-enfeksiyon gfp ifade ilerlemesi için embriyo görüntü. Enfeksiyon sonrası sekiz saat bakteriyel yükü belirlemek için, 15 anestezik mikro enjekte edilmiş embriyoyu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve anestezik solüsyonu PBS'de %1 Triton X-100'ün 300 mikrolitresiyle değiştirin.Embriyoları homojenize etmek için iğneleri en az 15 kez bir insülin şırıngasının steril 27 gauge iğnesi ile geçirin. Ve elde edilen karışımın 100 mikrolitresini seyreltme başına 900 mikrolitre steril PBS'ye aktararak homojen seyreltmeleri hazırlayın. Doğal ampisilin dirençli P.aeruginosa suşu için seçmek için, plaka 10 lb agar üzerine seyreltme mikrolitre ampisilin ile takviye ve 37 santigrat derece gecede onları kuluçka.Ertesi gün kolonilerin sayısını saymak. Koloni oluşturan birimlerin toplam sayısının ve enfekte embriyo başına koloni oluşturan birimlerin ortalama sayısının hesaplanmasına izin vermek için. P.aeruginosa enfeksiyonunun öldürücülüğünü değerlendirmek için enjekte edilen embriyolar, ölü beyaz opak embriyoların sayısını sayarak bir stereo mikroskop altında enfeksiyon sonrası 20 saat olarak değerlendirilir.Sonra yarım maksimal öldürücü konsantrasyon hesaplamak 50 p.aeruginosa doz 20 saat sonra enjekte embriyoların% 50 ölümü ile sonuçlanan.. Kistik fibrozis fenotipini doğrulamak için kalp karaciğeri ve pankreas gibi iç organların bozulmuş pozisyonu değerlendirilebilir. P.Aeruginosa ile enfekte kistik fibrozis embriyolarında faj tedavisi ile bakteriyel yük azalır.48 saat sonrası döllenme sonrası gfp pozitif P.Aeroginosa bakterisi ile enfekte olan kistik fibrozis embriyoları embriyo dozu başına 30 koloni oluşturan üniteler 20 saat post-enfeksiyonda %50 ölümcül olduğunu göstermektedir. Faj tedavisi bakteriyel enjeksiyondan 30 dakika veya yedi saat sonra teslim edildiğinde enfeksiyon sonrası 20 saat eşit derecede etkilidir. Burada, bir kistik fibrozis ve GFP pozitif P.Aeruginosa enjekte embriyo dört, dokuz, 14 ve 18 saat post-enfeksiyon gösterilmiştir.Buna karşılık kistik fibrozis artı P.Aeruginosa artı faj enjekte embriyo bakteri karşı faj eylem nedeniyle azaltılmış floresan gösterir. Kistik fibrozis embriyolarında P.aeruginosa enfeksiyonu ile oluşturulan inflamatuar yanıt, p.aeruginosa enjeksiyonu sonrası pro-inflamatuar sitokinler, TNF alfa ve interlökin 1 beta ekspresyonu ile ortaya çıktıkça, enjekte edilen zebra balığının kontrolüne göre anlamlı olarak artmaktadır. Ancak her iki inflamatuar sitokinin ekspresyonu faj kokteyli ortak enjekte edilen hayvanlarda azalır.Fajlar dikkatle hazırlık sırasında tutulabilir herhangi bir kirletici endotoksin kaldırmak için arındırılmış olmalıdır. Faj preparatları virion morfolojisini değerlendirmek için elektron mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu psödomonas aeruginosa dışında bakteriler tarafından insan hastalarda enfeksiyon kistik fibrozis zebrabalığı modelinde faj tedavisi ile tedavi edilebilir olup olmadığını test etmek ilginç olurdu.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Video, kistik fibrozis zebra balığı embriyolarında Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonunu hedef alan faj tedavisi tekniğini göstermektedir. Faj tedavisi, bakterilerle enfekte olmuş KF zebra balığı embriyolarında bakteri yükünü etkili bir şekilde azaltır ve proinflamatuar bağışıklık tepkilerini hafifletir, bu da KF embriyo ölümcüllüğünün azalmasına yol açar.

Zebra Balığı Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Bir Faj Tedavisi

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Bu iletişim kuralı karter temizleme bezi kullanımı ve Zebra balığı sistemleri, hangi nöbetçiler tek kullanım göre artan algılama patojen Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. ve gibi algılamaya yol çamur analizini açıklar Pseudocapillaria tomentosa. P. tomentosa yumurta karantinada izlemek için bir sistem de önerilmiştir.

Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. ve Pseudocapillaria tomentosa Zebra balığı sistemlerinde çevre tarama

Burada biz yetişkin zebra balığı (Danio rerio) DNA tabanlı aşı ile Bağışıklama için bir iletişim kuralı tanımlamak ve doğrulama başarılı olay göstermektedir. Bu yöntem çeşitli enfeksiyon modellerinde aşısı adayların preklinik tarama için uygundur.

Yetişkin zebra balığı bağışıklama DNA tabanlı aşıların preklinik tarama için

Bu protokol, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında hücre hatlarından ve taze hasta materyalinden insan akut lenfoblastik lösemi (ALL) ksenogreftlerinin oluşturulması ve sorun giderilmesi için adım adım talimatların yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak ilaç yanıtı değerlendirmesi için kılavuzlar sağlar. Deneysel boru hattı katı tümörler için de uyarlanabilir.

Zebra Balığı Embriyolarında Lösemi Hücre Greftleri Kullanılarak Hızlı İn Vivo İlaç Yanıtı Tahmini

Şu anda kronik bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilaç taramasına uygun in vivo modellerin eksikliği vardır. Burada, zebra balığı larvalarında kalıcı bir enfeksiyon oluşturmak için bir Pseudomonas aeruginosa klinik izolatı ile yara enfeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Keşfedin kistik fibrozisli Danio rerio embriyolarında Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonuna karşı faj kokteyli hazırlama ve uygulama protokolünü. Bu yöntem, faj tedavisinin in vivo etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

Kistik Fibrozis Zebrabalık Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Faj Tedavisi Uygulaması

Daha fazla video keşfet