Name: Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Öğrenin, üç boyutlu tek eksenel mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi kullanarak tendon türevi kök hücrelerin tenojenik farklılaşmasını nasıl indükleyeceğinizi. Bu yöntem, tendinopati tedavisinde yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma, yazar "Batı Avustralya Üniversitesi Uluslararası Ücret Bursu ve Batı Avustralya Üniversitesi'nde Üniversite Yüksek Lisans Ödülü" alırken gerçekleştirildi. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81802214) tarafından desteklenmiştir.

Açıklanan yöntemler, Batı Avustralya Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi'nin yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. Fare TDSC'lerinin İzolasyon
<ol><li>6-8 haftalık C57BL/6 farelerini servikal çıkığı ile ötenazi.</li>
	<li>Hasat patellar tendonu24 ve Aşil tendonu25.</li>
	<li>Tip I kollajenaz (3 mg/mL) 6 mL olan birinden sindirin tendon 3 saat. NOT: Faredeki tendon boyutu küçük olduğundan, bu adımda bir fareden alınan tüm tendon kullanılmalıdır.</li>
	<li>7 gün boyunca fetal sığır serumunun (FBS) %10'u ve streptomisin ve penisilin karışımının %1'ini içeren hücreleri ve kültürü tam minimal esansiyel ortamda (Alpha-MEM) toplayın.</li>
	<li>Akış sitometrisine göre floresan aktive hücre sıralaması nı kullanarak TDSC'leri tanımlayın (CD44, CD90 ve Sca-1 dahil hücre yüzey ibelirteçlerinin ifadesi; CD34 ve CD45 ifadesinin olmaması).</li>
	<li>Geçiş ve dondurucu hücreler (geçiş 4 hücreleri daha sonraki adımlar için kullanılacaktır).</li>
</ol>2. Kültür ve fareler TDSCs genişlemesi
NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Isınmış hücreleri (fareler TDSC' leri, 1 milyon hücre, 4.</li>
	<li>Yavaş yavaş tam Minimal Esansiyel Orta (Alpha-MEM) ekstra 4-5 mL ekleyin.</li>
	<li>Karışımı pipetli 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Bir pipet ile orta ila 8 mL toplam ile topup.<ol>
<li>37 °C'lik fırın kuluçka makinesinde önceden ısınmış ortam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüpü santrifüj ve dengeye yerleştirin.</li>
	<li>Santrifüj ve pelet hücreleri 347 x g 5 dk.</li>
	<li>Santrifüj den sonra dışarı atın ve alt pelet kontrol edin.</li>
	<li>Donma ortamını decant ve hücreleri 1-2 mL'lik tam ortamda hafifçe uzaklaştırın (çok fazla kabarcık yapmaktan kaçının).</li>
	<li>Yeniden askıya alınan hücreleri bir pipetle T-75 şişesine aktarın.</li>
	<li>13.000 hücre/cm2son konsantrasyonu ile 10 mL toplam hacmine ulaşmak için şişeye tam Alpha-MEM Orta eklemek için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Şişeyi %5 CO2ile 37 °C'de kuvöze ve kültüre yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı her 3 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Hücreler %100 kesişme (yaklaşık 40.000 hücre/cm2)kültüre girene kadar ortamı değiştirirken hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve izleyin.</li>
</ol>3. Hücre sayfası oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması
NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>15 mL steril boruiçine 15 mL tam Alfa-MEM ortamı dökün.</li>
	<li>4.4 g/mL'lik son konsantrasyon için 15 mL orta ortama 6 μL askorbik asit (11 mg/mL) ekleyin. NOT: Ayrıca stimülasyon kültürü ortamına 25 ng/mL bağ dokusu büyüme faktörü eklemek tüm büyüme ve farklılaşma sürecini hızlandırabilir.</li>
	<li>Yukarı ve aşağı ters çevirerek yavaşça karıştırın.</li>
</ol>4. Stimülasyon ortasında kültüredilerek hücre levhası oluşumu
NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Normal tam alfa-MEM ortamını dikkatlice atın ve şişenin altına bağlı hücrelere dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>Yavaş yavaş stimülasyon orta 10 mL ekleyin ve tam olarak konfluent hücrelerde herhangi bir rahatsızlık neden önlemek.</li>
	<li>Kültür 9 gün boyunca stimülasyon orta hücreleri (her 3 günde bir orta değiştirmek) yeterli% 5 CO2ile 37 °C'de hücre levha oluşturmak için . NOT: Hücre dışı matriks kalın olacak ve askorbik asit tarafından uyarılmış sonra şişenin altından gözlendiğinde bulutlu olmak mevcut, hangi hücre sayfası yeterince oluşturulur anlamına gelir.</li>
</ol>5. 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması
NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Şişeyi kuvözden çıkar.</li>
	<li>Stimülasyon ortamını tamamen atın.</li>
	<li>Tek katmanlı hücre sayfasını şişeyi döndürerek fosfat tamponu (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi tamamen atın.</li>
	<li>Şişenin köşesine 1 mL %0,25 tripsin eklemek için pipet kullanın.</li>
	<li>Hücre sayfasının köşesi şişenin alt kısmından inene kadar tek katmanlı hücre sayfasını bağlamak için şişenin köşesine dokunun.</li>
	<li>Trippsinizasyonu durdurmak için hemen 9 mL tam Alfa-MEM ortamı ekleyin.</li>
	<li>Tamamen monolayer hücre levha soymak için şişe girdap devam edin.</li>
	<li>Toplam de-bağlı hücre levhasını orta ile bir Petri kabına dökün.</li>
	<li>Hücre sayfasının bir köşesini almak ve 15 kez saat yönünde döndürmek için steril bir cızırtıcı kullanın.</li>
	<li>Hücre sayfasının başka bir ucunu al ve tendon benzeri bir in vitro yapı oluşturmak için 10 kez saat yönünün tersine döndürün(Şekil 1A).</li>
</ol>6. Benzersiz tasarlanmış biyoreaktörde tek yönlü germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı
NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Kancaları konektörle bağlayın ve iki kanca arasında istenilen mesafeye (2 cm) ayarlayın.</li>
	<li>3D TDSC'leri her kancada 3 kez monte edilmiş kancaüzerinde hafifçe rüzgarlayın(Şekil 1B).</li>
	<li>İki uçtaki vidaları sıkarak kancaları biyoreaktör odasına hücre yapısıile sabitle. NOT: Vidalar ve kancalar da dahil olmak üzere tüm hazne sterildir (134 °C'de 1,5 saat otoklav ve kullanmadan önce 24 saat boyunca ultraviyole ışınları (UV) açığa çıkar). Odaların metal tutucusu için UV ışığı kullanılmadan önce 48 saat boyunca açığa çıkar.</li>
	<li>Odayı tam alfa-MEM ortamı ile doldurun.</li>
	<li>Aktüatörü kabloile kültür odasına bağlayın.</li>
	<li>Kanca konektörünü steril makaslarla kesin.</li>
	<li>Mekanik stimülasyon başlatmak için güç ve ilgili kanal denetleyicisini açın.</li>
	<li>Kapağı odanın kapağını kapatın.</li>
	<li>Gösterge ışıklarını kontrol edin ve biyoreaktörün düzgün çalışabildiğinden emin olun.</li>
	<li>Biyoreaktörü kuvöze koyun ve 3D hücre yapısını 6 gün boyunca mekanik germeye tabi tutarak (6% germe, 0,25 Hz, 8 saat, ardından 16 saat dinlenme).</li>
</ol>7. Mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi
<ol><li>Vidaları bir tornavida ile gevşetin ve montajı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>15 dakika fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine tendon benzeri doku koyun.</li>
	<li>Sabit tendon benzeri dokuyu biyopsi köpük pedli bir biyopsi kasetine yerleştirin.</li>
	<li>İşlem örnek dehydrate ve nihayet H & E histolojik boyama ile değerlendirmek.</li>
	<li>Tüm protokolü tekrarlayın ve tenojenik belirteçlerin kantitatif PCR (qPCR) ile ekspresyonunu değerlendirmek için tendon benzeri dokudan RNA ayıklayın. Seçilen genler için astarlar Tablo 1'delistelenmiştir. NOT: Histoloji protokolü ve qPCR protokolü standart ve bir önceki çalışma21aşağıdaki .</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tendon mekanosiz fibröz bağ dokusudur. Önceki araştırmalara göre, aşırı mekanik yükleme tendon kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasına yol açabilir, yetersiz yükleme tendon farklılaşması sırasında düzensiz kollajen lif yapısına yol açacak ise21.
Ortak bir görüş, ideal bir biyoreaktör için anahtar in vitro hücresel mikroenvironment hücreler in vivo geçmesi simüle yeteneği olmasıdır. Bu nedenle, in vivo normal stres ortamını in vitro taklit tendon hücrelerine TDSCs te...

Tendinopati yaygın spor yaralanmalarından biridir. Esas olarak ağrı ile kendini gösterir, lokal şişlik, etkilenen bölgede azalmış kas gerginliği, ve disfonksiyon. Tendinopati insidansı yüksektir. Aşil tendinopati varlığı orta ve uzun mesafe koşucuları için en sık görülür (kadar 29%), patellar tendinopati varlığı da voleybol sporcular yüksek iken (%45),% 45), basketbol (%32), atletizm (%23), hentbol (%15), ve futbol (%13)1,2,3,4,5. Ancak, tendonun sınırlı kendi kendine iyileşme yeteneği nedeniyle, ve etkili tedavilerin eksikliği, tendinopati hala olumsuz hastaların hayatını etkiler6,7. Ayrıca, tendinopati patogenezi belirsizliğini korumaktadır. "İltihap teorisi", "dejenerasyon teorisi", "aşırı kullanım teorisi" ve benzeri8dahil olmak üzere patogenezi hakkında birçok araştırma yapılmıştır. Şu anda, birçok araştırmacı tendinopati tendon deneyimleri aşırı mekanik yükleme neden mikro yaralanmalar başarısız kendi kendine onarım nedeniyle olduğuna inanıyordu9,10.
Tendon türetilmiş kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati ve fonksiyonel ve yapısal restorasyon tendinopati11sonra hem gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır11 ,12,13. Bu mekanik stres stimülasyonu proliferasyon ve osteositler, osteoblastlar, düz kas hücreleri, fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler ve diğer kuvvete duyarlı hücreler14,,15,16,17,18farklılaşmasına neden olabileceği bildirilmiştir . Bu nedenle, TDSCs, mekanosensitive ve multipotent hücrelerden biri olarak, benzer mekanik yükleme19,20ile ayırt etmek için uyarılabilir.
Ancak, farklı mekanik yükleme parametreleri (yükleme mukavemeti, yükleme frekansı, yükleme türü ve yükleme süresi) farklı hücrelere21ayırt etmek için TDSCs neden olabilir. Bu nedenle tenogenez için etkili ve geçerli bir mekanik yükleme rejimi çok önemlidir. Ayrıca, şu anda TDSCs mekanik yükleme sağlamak için kullanılan stimülasyon sistemleri olarak biyoreaktörler farklı türleri vardır. Her tür biyoreaktörün prensipleri farklıdır, bu nedenle farklı biyoreaktörlere karşılık gelen mekanik yükleme parametreleri de farklıdır. Bu nedenle, biyoreaktör türü, ilgili stimülasyon ortamı ve mekanik yükleme rejimi de dahil olmak üzere basit, ekonomik ve tekrarlanabilir stimülasyon protokolü talep görmektedir.
Bu makalede, TDSC'leri tendon benzeri dokuya ayırmak için uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemine dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Tüm prosedür çok bazı mevcutyöntemler22,23daha az 3D hücre yapısı, elde etmek için 3 haftadan az sürer. Mevcut protokol tendon dokusu na farklılaştırmak için TDSCs ikna edebilmek için kanıtlanmıştır, ve daha mevcut kullanılan iki boyutlu daha güvenilir (2D) germe sistemi21. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Kısacası, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma-aldrich</td><td>PHR1008-2G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Gibco&auml; Life Technologies</td><td>tarafından 1908361</td><td></td></tr><tr><td>Histoloji işlemcisi</td><td>Leica</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta (Alpha-MEM)</td><td>Gibco&auml; Life Technologies</td><td>tarafından 2003802</td><td></td></tr><tr><td>Fare Tendonundan Türetilmiş Kök Hücre</td><td></td><td></td><td>6 ila 8 haftalık C57BL / 6 farelerin Aşil tendonlarından izole edilmiştir. Daha sonra tip I kollajenaz (3 mg / ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD) 3 saat boyunca ve tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için 70 mm'lik bir süzgeçten geçirildi.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin ve penisilin karışımı</td><td>Gibco&auml; by Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Üç Boyutlu Tek Eksenli Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi</td><td>Ortopedik Translasyonel Araştırma Merkezi, Tıp Fakültesi, Batı Avustralya</td><td></td> <td>Üniversitesiİstek üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir. Veya tasarımımıza göre yapın* * Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programlanabilir mekanik stimülasyon, bir biyoreaktör sisteminde tendon homeostazını etkiler. Biyoteknoloji Biyomüh. 2013; 110(5):1495&ndash;1507. doi:10.1002/bit.24809</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco&auml; tarafından Life Technologies</td><td>1858331</td><td></td></tr></tbody></table>

tendon türevi kök hücrelerin tenojenik farklılaşmasını İndüklemek için Üç boyutlu tek eksenel mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi uygulama

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Tendinopati bir ortopedik alanda inflamasyon ve dejenerasyon ile ilgili yaygın bir kronik tendon hastalığıdır. Yüksek morbidite, sınırlı kendi kendini onarma kapasitesi ve en önemlisi kesin tedaviler iyatsi olmaması yla, tendinopati hala hastaların yaşam kalitesini olumsuz etkilemez. Tendon kaynaklı kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati nin gelişiminde ve tendinopati sonrası fonksiyonel ve yapısal restorasyonda önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, in vitro tendon hücrelerine TDSCs in vivo farklılaşma taklit edebilirsiniz bir yöntem yararlı olacaktır. Burada, bu protokol tendon benzeri dokulara farklılaşmak için TDSCs uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemi dayalı bir yöntem açıklar. Bu protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Tüm işlem 3 haftadan az sürer. Ekstrasellüler matriks birikimini teşvik etmek için stimülasyon kültürü ortamda 4.4 mg/mL askorbik asit kullanıldı. Lineer motorlu ayrılmış bir hazne doğru mekanik yükleme sağlar ve biyoreaktör için uygulanan taşınabilir ve kolayca ayarlanabilir. Mevcut protokoldeki yükleme rejimi %6 gerinim, 0.25 Hz, 8 saat, ardından 6 gün boyunca 16 saat istirahat edildi. Bu protokol tendondaki hücre farklılaşmasını taklit edebilir, bu da tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır. Ayrıca, tendon benzeri doku potansiyel olarak tasarlanmış bir otolog greft olarak tendon yaralanması tendon iyileşmesi teşvik etmek için kullanılır. Özetle, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.

Mekanik stimülasyondan önce TDSC'ler tam ortamda 0 biraraya gelir ve düzensiz bir ultrayapısal morfoloji gösterilmiştir(Şekil 2A). 6 günlük tek eksenli germe mekanik yüklemeden sonra, hücre dışı matriks (ECM) ve hücre hizalamaları iyi yönlendirilmiştir(Şekil 2B). Hücreler iyi doldurulur ve mekanik yükleme den sonra ECM'de iyi zarflanmış. Hücre morfolojisi uzatılmış olarak sunuldu ve esneme denkemeyen hücreye göre normal tendon hücresine daha çok benziyordu(Şekil 2C). Yük...

Üç boyutlu tek boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi tendon kaynaklı kök hücrelerin tenojenik spesifik farklılaşması ve neo-tendon oluşumu için ideal bir biyoreaktördür.

Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

Farklı mekanik yükleme parametreleri tendon kaynaklı KÖK hücreleri farklı hücrelere farklı olarak neden olabilir. Bu üç boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemini, tendon kaynaklı KÖK hücrelerin tenojenik farklılaşmasını sağlamak için ayrıntılı bir şekilde uygulama süreci başlatıyoruz. Tendinopati ortopedi bölümünde sık görülen spor yaralanmalarından biridir.Aşil tendinopati varlığı orta ve uzun mesafe koşucuları için% 29'a kadar en sık görülür, patella tendinopati varlığı voleybol sporcular da yüksek iken, basketbol, atletizm, hentbol, ve futbol. Ancak, tendon sınırlı kendi kendine iyileşme yeteneği ve etkili tedavi eksikliği nedeniyle, tendinopati hala hastaların yaşam kalitesi üzerinde önemli olumsuz etkisi vardır. Tendon hücrelerinin önemli öncü hücreleri olarak TDSC olarak bilinen tendon türetilmiş KÖK hücreler, tendinopati gelişiminde önemli bir rol oynar, ayrıca tendinopati sonrası fonksiyonel ve yapısal restorasyon.Ancak yükleme gerilimi, yükleme sıklığı, yükleme türü ve yükleme süresi gibi mekanik yükleme parametrelerinden farklı olarak TDSC'lerin farklı hücrelere farklılaşmasına neden olabilir. Bu nedenle, etkili ve geçerli bir mekanik yükleme rejimi tendon oluşumu için çok önemlidir. Mevcut protokolün, fare TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültür ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültüredilerek hücre sayfası oluşumu, 3D tendon KÖK hücre yapısının hazırlanması, mekanik stimülasyon kompleksini esneten tek eksenli hücrelerin biraraya edilmesi ve vitro tendon benzeri dokularda uyarılan mekanik uyarılmış mekanik değerlendirilmesi gibi yedi aşaması vardır.Fare lerin izolasyonu TDSC'ler. Servikal çıkış nedeniyle altı ila sekiz haftalık farelerde kullanılır. Hasat patella tendonu ve Aşil tendonu.Üç saat boyunca altı mililitre Tip 1 kollajenaz ile tendon sindirin. Yedi gün boyunca FBS% 10 ve streptomisin ve penisilin karışımı% 1 içeren tam alfa MEM hücreleri ve kültür toplayın. akış sitometrisine göre floresan aktif hücre sıralaması, CD44, CD90 ve Sca-1 dahil olmak üzere hücre yüzey ibelirteçlerinin ekspresyonu kullanarak TDSC'leri tanımlayın.CD34 ve CD45 ifadesini kapalı eksikliği. Hücreleri geçiş ve dondurma. Pasajlı hücreler daha sonraki adımlar için kullanılacaktır.Kültür ve fareler TDSCs genişlemesi. Isınmış fare tendon KÖK hücreleri alın. Yavaş yavaş tam alfa MEM ekstra dört ila beş mililitre ekleyin.Karışımı bir pipetle 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir pipet ile toplam sekiz mililitre orta ile top up. Tüp bir kuyu dengesi santrifüj içine yerleştirin.Santrifüj hücreleri 347 g'da 5 dakika. Santrifüjden bir tüp çıkar. Alttaki peleti kontrol et.Serbest ortamı dekant. Hücreleri bir ila iki mililitrelik tam ortamda yavaşça askıya alın. Çok fazla kabarcık lar yapmaktan kaçının.Yeniden askıya alınan hücreleri bir pipetle T75 şişesine aktarın. Santimetre kare başına 13,000 hücre son konsantrasyonu ile 10 mililitre toplam hacmine ulaşmak için şişe ye tam alfa MEM orta eklemek için bir pipet kullanın. Şişeyi kuvöze yerleştirin ve %5 karbondioksitle 37 derecede kültüredin.Ortamı her üç günde bir değiştirin. Hücreler %100 biraraya gelene kadar ortamı değiştirirken hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve izleyin. Hücre sayfası oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması.15 mililitrelik steril bir tüp içine 15 mililitre tam alfa MEM ortamı dökün. Mililitre başına 4,4 mikrogram son konsantrasyona 15 mililitre lik ortama altı mikrolitre askorbik asit ekleyin. Yukarı ve aşağı ters çevirerek yavaşça karıştırın.Stimülasyon ortamında kültüredilerek hücre tabakasının oluşumu. Normal olmayan tam alfa MEM ortamını dikkatlice atın. Şişenin altına bağlı hücrelere dokunmaktan kaçının.Yavaş yavaş 10 mililitre stimülasyon orta ekleyin. Tam olarak etkili hücrelerde herhangi bir rahatsızlık neden kaçının. Kültür dokuz gün boyunca stimülasyon orta hücreleri ve yeterli karbondioksit% 5 ile 37 derece hücre levha oluşturmak için her üç günde bir orta değiştirin.3D tendon KÖK hücre yapısının hazırlanması. Şişeyi kuvözden çıkar. Stimülasyon ortamını tamamen atın.Tek katmanlı hücre sayfasını şişeyi döndürerek PBS ile yıkayın. PBS'yi tamamen atın. Şişenin köşesine bir mililitre, %0,25 tripsin eklemek için pipet kullanın.Hücre sayfasının köşesi şişenin alt kısmından yıkayana kadar tek katmanlı hücre sayfasını ayırmak için şişenin köşesine dokunun. Hemen tripsinizasyon reaksiyonu durdurmak için dokuz mililitre tam alfa MEM orta ekleyin. Tamamen monolayer hücre levha soymak için şişe girdap devam edin.Orta ile Petri kabına hücre levha eklemek için toplam dökün. Hücre sayfasının bir köşesini almak ve 15 kez saat yönünde döndürmek için steril bir cızırtıcı kullanın. Hücre sayfasının başka bir ucunu seçin ve tendon benzeri bir in vitro yapı oluşturmak için 10 kez saat yönünün tersine döndürün.Benzersiz tasarlanmış biyoreaktör de tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı. Kancaları konektörle bağlayın ve iki kanca arasında iki santimetreye ayarlayın. 3D TDSC'leri her kancada üç kez demo kancası üzerinde inşa edin.İki uçtaki vidaları sıkarak kancaları biyoreaktör odasına hücre yapısıile sabitle. Odayı tam alfa MEM ortamı ile doldurun. Hızlandırıcıyı kabloile kültür odasına bağlayın.Kancaların konektörünü steril cımbızla kesin. Mekanik bir uyarımı başlatmak için güç ve kanal denetleyicisini açın. Kapağı odaya koyun, gösterge ışıklarını takip edin ve biyoreaktörün düzgün çalışabildiğinden emin olun.Biyoreaktörü kuvöze koyun ve 3D hücre yapısını mekanik germeye tabi edin. Yükleme rejimi% 6 zorlanma, 0.25 Hertz frekans, sekiz saat altı gün boyunca 16 saat dinlenme takip. Mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi.vidaları bir tornavida ile gevşetin ve montajı dikkatlice çıkarın. 15 dakika fiksasyon için% 4 PFA içine tendon benzeri doku koyun, evcil hayvanların biyopsi ile bir biyopsi kaset içine sabit tendon benzeri doku yerleştirin. Bir numuneyi susuz katmak için işlem.Ve son olarak, HD histolojik duruş tarafından değerlendirin. Tüm protokolü tekrarlayın ve tenojenik belirteçlerin qPCR ile ekspresyonunu değerlendirmek için tendon benzeri dokudan RNA ayıklayın. Mekanik stimülasyon dan önce, TDSC'ler tam ortamda %100 biraraya gelecek ve düzensiz bir dışyapısal morfoloji sergileyecekler.Altı gün sonra germe, mekanik yükleme, ekstra hücresel matris ve hücre hizalamaiyi gördün. Hücreler iyi doldurulur ve mekanik yükleme den sonra ECM'de iyi zarflanmış. Hücre morfolojisi tespit edildi ve germe olmadan bir göre normal tendon hücrelerine daha benzerdi.Yükleme ile hücre yapısındaki hücre yoğunluğu, yükleme yapılmadan olandan daha yüksekti. qPCR sonuçları, mevcut konuların skleraxis, Mohawk, tenomodulin ve Tip 1 kollajen gibi tenojenik belirteçlerin ekspresyonunu, belirtilen kültür tarafından tedavi edilenlere göre artırdığını göstermiştir. Bu protokolde mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi açısından lineer motorlu ayrılmış oda kullanılmıştır.Doğru mekanik yükleme sağlayabilir ve taşınabilir ve kolay geleneksel 2B hücre levha ve biaksiyel streç yolları ile karşılaştırıldığında ayarlanabilir olduğundan, 3D hücre yapısı tendon gerçek şekline daha benzer. Ve tek eksenli streç tendon hücrelerinin güçlü özelliklerine daha benzer. Bu TDSCs farklılaşmasını uyarmak için 3D uniaxial gerilmiş sistemi kullanarak teorik bir temel sağlar.Böylece, 2D hücre sayfası nihayet bir 3D hücre yapısına yönlendirildi ve mevcut protokolde tek taraflı olarak uygulandı. Biyoreaktör sistemimize göre yükleme rejimimiz %6 gerinim, 0.25 Hertz frekansı ve ardından sekiz saat ve ardından altı gün boyunca 16 saat istirahat. Son olarak, protokolün etkinliği morfoloji ve tenojenik belirteçlerin ifade düzeyi ile gösterilmiştir.Tüm işlem süreci basittir, ancak operatör tdsc ortamıher zaman sterilize tutmak için dikkat etmek gerekir. Protokolümüzün birçok uygulaması var. TDSC'leri in vivo farklılaşmayı taklit etmek için uyarma süreci, tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır.Ayrıca, bu protokol tendon benzeri doku içine TDSC'lerin yönlendirilmiş farklılaşması için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yüzden basit ve etkili bir şekilde potansiyel mühendislik tendon kültürü için kullanılabilir. Özetle, 3D tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi uygulamak basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve TDSC'lerin tenojenik farklılaşmasını sağlamak için geçerli bir yöntemdir.Protokolümüz tüm süreci ayrıntılı olarak sağlar.

applying-three-dimensional-uniaxial-mechanical-stimulation-bioreactor

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu yaygın vücut mekanik kuvvetleri, hücre farklılaşması ve proliferasyonu etkisi olduğu anlaşılmaktadır. Burada esnek micropatterned yüzeylerde kültüre kök hücre, tek eksenli döngüsel çekme gerilme sağlamak için özel olarak inşa edilmiş biyoreaktör kullanımını gösteren bir video protokolü mevcut.

Devirli Tek Eksenli Gerilme kullanarak Kök Hücre Mekanik Uyarım

Biz eklem kıkırdağı kusur içine önce nakli için bir kıkırdak biokompozit için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulayabilirsiniz yeni bir mekanik yüklenme biyoreaktör tasarlanmıştır.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis'in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC'den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi

Burada, yük taşıyan tendon çekirdek dokusu ile hastalık ve yaralanma ile aktive olan hücre popülasyonlarını içeren bir dışsal bölme arasındaki tendon hücresel karışmasını taklit etmek için bir asambloid model sistemi sunuyoruz. Önemli bir kullanım durumu olarak, sistemin dışsal endotel hücrelerinin hastalıkla ilgili aktivasyonunu araştırmak için nasıl konuşlandırılabileceğini gösteriyoruz.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

Transkraniyal manyetik uyarımın (TMU), insan sinir sistemi fizyolojisi ve fonksiyon anlamak için bir non-invaziv bir araçtır. Burada, biz, üst bacak ve bel kas kortikal eksitabilite çalışma TMS teknikleri mevcut.

İnsan Nöromusküler Sistem Eğitim Transkraniyal Manyetik Uyarım kullanımı

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Biz kronik inme ve akıcı olmayan afazi olan hastalarda dil becerilerini geliştirmek için tekrarlayan transkranial manyetik stimülasyon (rTMS) kullanımını keşfetmek. Stimülasyon en iyi yanıt her hasta için sağ frontal girus bir site belirledikten sonra, biz rTMS tedavi on gün boyunca bu siteyi hedef.

Kronik olmayan akıcı Afazi ile İnme Hastalarda Dil Fonksiyonu Geliştirmek için Transkraniyal Manyetik Uyarım kullanılması

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Öğrenin, üç boyutlu tek eksenel mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi kullanarak tendon türevi kök hücrelerin tenojenik farklılaşmasını nasıl indükleyeceğinizi. Bu yöntem, tendinopati tedavisinde yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama (Video) | JoVE Journal

Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama

Daha fazla video keşfet