2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem
10 Temmuz 2020
Burada, bir cDNA ara ürünü olmadan kısa RNA'yı (çalışma başına <35 nt) dizilemek için doğrudan bir yöntem olarak ve tek bir çalışmada tek baz hassasiyetinde farklı nükleotid modifikasyonlarını dizilemek için genel bir yöntem olarak kullanılabilen LC-MS tabanlı bir dizileme yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.
Bu protokol, RNA örneğinin tek sarmallı, karışık veya modifiye edilmiş olmasına bakılmaksızın, RNA'yı doğrudan dizilemek için geliştirilen yeni yöntemi kullanırken gereken tüm temel adımları kapsar. Yöntem, enzimatik hatadan veya baz tamamlayıcılığından etkilenmez. Bir seferde belirli bir modifikasyon yerine farklı RNA modifikasyonlarını aynı anda sıralamayı mümkün kılan doğrudan bir iş akışı ve genel bir çözüm sağlar.
Bu teknoloji, insan hastalığıyla ilişkilendirmek için imza RNA segmentlerini belirlemek için bir tanı aracı ve epitranskriptomik düzeyde RNA modifikasyonlarını incelemek için doğru bir araç olarak geliştirilebilir. Yöntem, önceki herhangi bir sıralama yöntemine dayanmaz. Bunun yerine, bu tamamen yeni bir yaklaşımdır ve herhangi bir modifiye edilmiş RNA'yı dizilemek için başvurulacak yönteme geçmeyi amaçlıyoruz.
Bu protokolün bazı bölümleri, RNA LC-MS veri toplamanın 3'ünün etiketlenmesi ve MassHunter yazılımı tarafından veri analizi gibi görsel gösterimle daha doğru bir şekilde aktarılabilecek kritik yönleri içerir. Bu prosedürü göstereceğim ve LC-MS'yi kuracağım ve RNA örneklerimizi ölçeceğim. Tek adımlı bir etiketleme reaksiyonu gerçekleştirmek için, 2 mikrolitre 150 mikromolar AppCp-biotin, 3 mikrolitre 10x ligaz reaksiyon tamponu, 1.5 mikrolitre 100 mikromolar RNA örneği, 3 mikrolitre susuz DMSO, 10 ünite T4 RNA ligaz ve toplam 30 mikrolitre hacim için 19.5 mikrolitre DEPC ile muamele edilmiş su.
Reaksiyonu gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin, ardından el yazması talimatlarına göre sütun saflaştırması gerçekleştirin. RNA'yı üç alikota böldükten ve eşit hacimde formik asit ekledikten sonra, reaksiyonları 40 santigrat derecede inkübe edin. Her reaksiyon bittiğinde, asit bozunmasını söndürmek için numuneyi hemen kuru buz üzerinde dondurun.
Numuneyi yaklaşık 30 dakika kurutmak için bir santrifüj vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Kurutulmuş numuneleri 20 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda tekrar süspanse edin ve birleştirin. Numuneleri LC-MS ölçümüne kadar 20 santigrat derecede saklayın.
Mobil fazları hazırladıktan sonra RNA örneğini LC-MS örnek şişesine aktarın. Her enjeksiyon 100 ila 400 pikomol RNA ve 20 mikrolitre içermelidir. Verileri aldıktan sonra, kütle, bekletme süresi, hacim ve kalite puanı dahil olmak üzere bileşik bilgileri ayıklamak için moleküler özellik ayıklama iş akışını kullanın.
Küçük molekül ayarlarında centroid veri formatını kullanın. Tepe yüksekliğini en az 100, ancak 1.000'den az ve kalite puanını en az 50 olarak ayarlayın. Son olarak, verileri bir Excel dosyası olarak dışa aktarın.
3' merdivenin 5' merdivenden ayrılması ve diğer istenmeyen parçalar burada bir 2B kütle tutma süresi grafiğinde gösterilmiştir. Her RNA'da 5'biotin etiketi ile farklı uzunluklarda iki RNA ipliği içeren karışık numuneleri dizilemek de mümkündür. Üridini bir psödouridin'den ayırt etmek için, RNA, bir psödouridini bir CMC-psödouridin eklentisine dönüştüren CMC ile muamele edildi.
Adduktun, bir üridinde farklı bir kütleye sahiptir ve 2D-HELS MS Seq'de ayırt edilebilir. Reaksiyonu dönüştüren psödouridini CMC eklentisine dönüştüren ham ürünün HPLC profili, %42 olan dönüşüm yüzdesini hesaplamak için kullanıldı,% 42 olan beş farklı RNA zincirinin bir karışımı, 3'uç etiketleme ile 2D-HELS MS Seq yaklaşımı ile dizilendi ve çoklu RNA dizilerinin daha iyi görselleştirilmesi için normalleştirildi. Normalizasyon olmasaydı, beş RNA'nın dizileri için harf kodları bir araya toplanmış olurdu.
Bu prosedürü denerken, etiketli RNA örneklerinden yüksek verim elde etmek için etiketleme reaksiyonunu dikkatli bir şekilde ayarlayın. Ayrıca, güvenilir kütle merdivenleri oluşturmak için bozunma süresini dikkatlice izleyin ve 20 mikrolitre su ile maksimum miktarda kurutulmuş numune toplayın. Bu protokolü gerçekleştirdikten sonra sorulabilecek bir soru, sıralama yönteminin genişliğinin, uzunluğunun ve veriminin nasıl artırılacağıdır.
Daha iyi bir algoritma ve daha yüksek çözünürlük ve hassasiyete sahip daha gelişmiş bir cihaz yardımcı olabilir. Bu protokolün geliştirilmesinden sonra, CDA tabanlı RNA dizilimi ile ilgili herhangi bir hata olmaksızın hem kanonik hem de modifiye nükleotidleri içeren daha geniş bir RNA örneği yelpazesini doğrudan dizilemek mümkün hale geldi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, cDNA ara basamağına olan ihtiyacı ortadan kaldıran, kısa RNA'lar için yeni bir LC-MS tabanlı dizileme yöntemi sunmaktadır. Protokol, çeşitli RNA modifikasyonlarının tek baz hassasiyetiyle eş zamanlı olarak dizilenmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- RNA dizileme
- Epitranskriptomik
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- Güncel RNA dizileme yöntemleri genellikle cDNA ara ürünlerine dayanmaktadır.
- Enzimatik hatalar dizileme doğruluğunu etkileyebilir.
- RNA modifikasyonlarının eş zamanlı olarak dizilenmesi zordur.
- RNA modifikasyonlarını anlamak, insan hastalıklarını çalışmak için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- RNA için doğrudan bir sekanslama yöntemi sunmak.
- Tek bir analizde birden fazla RNA modifikasyonunun incelenmesine olanak sağlamak.
- Epitranskriptomik araştırmalar için güvenilir bir araç sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- LC-MS tabanlı sekanslama tekniği.
- Tek sarmallı, karışık veya modifiye edilmiş RNA'nın doğrudan sekanslanması.
- cDNA sentez adımının ortadan kaldırılması.
- Yüksek hassasiyet ve doğruluk için tasarlanmış iş akışı.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, cDNA olmadan kısa RNA'ların (<35 nt) sekanslamasını başarıyla gerçekleştirir.
- Çeşitli RNA modifikasyonlarının eş zamanlı tespiti sağlanmıştır.
- Teknik, enzimatik hatalara karşı direnç göstermiştir.
- İnsan hastalıklarının teşhisinde potansiyel uygulama alanları belirlenmiştir.
Sonuçlar
- Bu yeni sekanslama yöntemi, modifiye RNA analizleri için standart hale gelebilir.
- RNA modifikasyonlarını incelemek için kapsamlı bir yaklaşım sunar.
- Protokolün, RNA biyolojisindeki gelecekteki araştırmalar için önemli çıkarımları vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
LC-MS tabanlı bu RNA dizileme yöntemi, cDNA sentezi gerektirmeksizin modifiye edilmiş RNA karışımlarının doğrudan de novo dizilenmesini sağlayarak epitranskriptomik hedef doğrulamadaki temel bir darboğazı giderir. Kantitatif ve modifikasyon çözünürlüğüne sahip dizileme verileri sunarak, RNA tabanlı biyobelirteçlerin erken keşfini ve terapötik oligonükleotitlerin mekanistik risk analizini destekler. Bu yaklaşım, tarama ve assay geliştirme iş akışlarına doğrudan uygulanabilen, dizileme ile doğrulanmış ve modifikasyona özgü çıktılar sunarak lider bileşik tanımlamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Pseudouridine ve 5-methylcytosine gibi RNA modifikasyonlarının doğal bağlamlarında doğrudan sekanslanması yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kanonik ve modifiye nükleotidlerin eş zamanlı tespiti için genel bir çözüm sunarak, ardışık modifikasyona özgü analizlere duyulan ihtiyacı azaltır.
- Öngörücü Değer: Modifiye nükleobazların doğrudan kütle-tutunma süresi korelasyonu aracılığıyla hedef güvenilirliğini destekleyerek, doğru bölgeye özgü modifikasyon haritalamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: 12 farklı oligonükleotide kadar karışımlardaki RNA dizilerinin güvenilir şekilde ayırt edilmesini sağlayan kantitatif kütle ve tutunma süresi çıktıları üretir.
- Operasyonel Değer: Standart yüksek çözünürlüklü LC-MS sistemleriyle uyumlu, tekrarlanabilir ve normalizasyona hazır veriler sunarak kısa RNA panellerinde analiz standardizasyonunu destekler.
- Ölçeklenebilirlik: Belirlenmiş modifikasyon modellerine sahip, dizisi doğrulanmış RNA standartları sağlayarak, sonraki tarama işlemleri için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Modifiye edilmiş terapötik RNA oligonükleotidlerinin sekans doğrulamasını destekleyerek, keşif aşamasındaki modifikasyonları preklinik aday değerlendirmesiyle ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Karmaşık örneklerde gerçek sinyali degredasyon artefaktlarından ayırt etmek için modifikasyon kaynaklı kütle kaymalarının (örneğin, CMC-psödouridin addütü) tespit edilmesini sağlar.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Enzim kaynaklı sapma olmadan sekans onayı sağlayarak modifikasyon taramalarındaki yanlış negatifleri azaltır ve go/no-go karar güvenilirliğini artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, fonksiyonel tarama öncesinde sentetik veya endojen RNA hedeflerinin dizisini ve modifikasyon durumunu doğrulayarak öncü madde tanımlamaya katkı sağlayan, hipotez güdümlü RNA analizi için bir ön uç sekanslama aracı olarak erken keşif iş akışlarına entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Doğal veya sentetik karışımlarda RNA dizisi ve modifikasyon birlikteliğinin doğrudan kanıtlarını sunarak hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Bileşik kaynaklı RNA modifikasyonları veya degradasyon profillemesi için kantitatif referanslar olarak hizmet eden kütle-tutunma süresi merdivenlerinin oluşturulması yoluyla analiz hazırlığına olanak tanır.
- Analitik: Excel'e aktarılabilir merkez tabanlı moleküler özellik verileri (kütle, tutunma süresi, hacim, kalite puanı) üreterek, farklı koşullar arası karşılaştırmaya ve modifikasyon stabilitesinin istatistiksel değerlendirmesine imkan sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili sistemlerde biyobelirteç hizalaması ve fonksiyonel doğrulama için uygun olan, dizisi doğrulanmış modifiye RNA standartları sağlayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kısa RNA varyantlarının (<35 nt) hızlı dizilenmesi için yeniden kullanılabilir LC-MS tabanlı bir yetkinlik olarak işlev görür; dış kaynaklı dizilemeye olan bağımlılığı azaltır ve kurum içi modifikasyon tarama döngülerini hızlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: cDNA aracılı hataları ortadan kaldırarak ve modifikasyona özgü kütle imzalarının doğrudan gözlemlenmesine olanak tanıyarak hedef doğrulamada öngörüsel güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Karmaşık RNA karışımlarındaki çalışma arası değişkenliği minimize eden standartlaştırılmış etiketleme, asit sönümleme ve normalizasyon adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Modifiye edilmiş RNA'ların kurum içi dizilemesine olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır, dış tedarikçilere olan bağımlılığı azaltır ve aday optimizasyonundaki iterasyon döngülerini hızlandırır.
- Portföy Etkisi: Net dizi ve modifikasyon verileri sunarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler, tespit edilemeyen RNA heterojenliği veya hatalı anotasyon nedeniyle geç evre aşınmalarını azaltır.
Uygulama Hususları
- Doğru veri yorumlaması için RNA işlemleri, LC-MS kullanımı ve MassHunter tabanlı moleküler özellik çıkarımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Belirlenmiş pik yüksekliği (100–1000) ve kalite skoru (≥50) eşikleriyle centroid veri kazanımı yapabilen yüksek çözünürlüklü LC-MS sistemlerine erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar ve platformlar arasında tutarlı kütle merdiveni (mass ladder) oluşumunu sağlamak için etiketleme verimliliği, degradasyon zamanlaması ve normalizasyon protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Gelecekteki algoritma ve cihaz geliştirmelerine bağlı olarak, kısa RNA'ların (<35 nt) ötesine geçildiğinde veya kompleks biyolojik örnekler kullanıldığında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Güncel işlem kapasitesi kısıtlamaları ve verimi ve merdiven çözünürlüğünü maksimize etmek için etiketleme reaksiyonlarının (örneğin, AppCp-biotin, T4 ligaz, DMSO) manuel optimizasyonuna olan bağımlılık gibi pratik sınırlamalar içerir.
