Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Mevcut protokol, in vivo olarak nörodevrelerin kombine nöroanatomik ve elektrofizyolojik izlenmesi için uygun maliyetli ve basit bir yöntemi analiz eder. Teknik, belirli nöron popülasyonundan bir hedef bölgeye yardımcı terminallerin haritalanmasına izin verir. Benzer şekilde, bu terminaller için anatomik harita, hedef bölgede hücre dışı kayıt sırasında optogenetik stimülasyon ile doğrulanabilir.

Bu protokol, duyusal, motor ve bilişsel işlevlerle ilişkili çoklu nöral devreleri incelemek için uygulanabilir. Bu prosedürün uygulanması, kemirgen stereotaksik cerrahisi ve hassas nöral elektrotların kullanımı hakkında biraz bilgi gerektirir. Kayıtlarda gürültüyü önlemek için kayıt sistemi bağlantısı.

Görsel gösterim, in vivo optogenetik için uygun fiyatlı bir LED sistemi kurmanın temel adımlarını vurgulamaktadır. Ayrıca, anestezi uygulanmış bir farede senkronize kayıt ve stimülasyon için amplifikatörün LED sürücüsüne nasıl bağlanacağını gösterir. Stereotaksik çerçeveye, farenin gövdesi üzerinde yatacak şekilde bir ısıtma yastığı yerleştirin, bu da prosedür boyunca vücut sıcaklığının korunmasına yardımcı olacaktır, ardından kafayı stereotaksik aparatın üzerine nazikçe sabitleyin.

İyotu çıkarmak için ameliyat bölgesini önce iyot solüsyonu ile sonra alkol ile temizleyerek hazırlayın. Ardından, kafa derisindeki hissi engellemek için topikal lidokain uygulayın. Daha sonra bir neşter kullanarak, frontalden oksipital bölgeye uzanan bir orta hat kesisi yapın.

Ventral tegmental alan veya VTA enjeksiyonu için, regmaya göre negatif 3.08 milimetre anterior posterior ve 0.5 milimetre medial lateral koordinatlarda ultra ince künt uçlu bir iğne şırıngası yerleştirin. İşaretli koordinatta kafatasında bir milimetrelik bir delik açmak için bir delme aleti kullanın. Şırınga tutucuyu bir mikromanipülatöre sabitlemek için üreticinin talimatlarını izleyin ve sıvı akışını temizlemek ve test etmek için şırıngayı çift damıtılmış suyla doldurun.

Ardından şırınganın akışını test etmek için suyu dağıtın. Adeno ile ilişkili virüsün veya AAV kokteylinin alikotlarını buz üzerinde çözün. Takılı şırıngayı 1.000 nanolitre AAV çözeltisi ile doldurun ve sıvının akışını doğrulamak için 10 nanolitre çözelti dağıtın.

İğneyi enjeksiyon bölgesine indirmek için mikromanipülatörü kullanın ve VTA'ya 600 ila 800 nanolitre AAV enjekte edin ve çözeltiyi dakikada 60 nanolitre olarak verin. AAV enjeksiyonundan üç hafta sonra, hayvanın kafasını daha önce tarif edildiği gibi stereotaktik bir çerçeveye yapıştırın ve durayı ortaya çıkarmak için bir kraniyotomi yapın. Parietal kemiğin bir kısmını çıkarmak için bir delme aleti kullanın.

Diseksiyon mikroskobu altında, açıkta kalan durayı çıkarmak için bükülmüş 27 gauge bir iğne ucu kullanın ve bu bölgedeki hassas kabuk kaplamasını ve kortikal dokuları ayırmamaya dikkat edin. Kuruluğu önlemek için kraniyotomi bölgesine yapay beyin omurilik sıvısı damlaları uygulayın. Topraklama vidasını tutmak için oksipital kemikte bir delik açın ve paslanmaz çelik bir topraklama kablosu bağlayın.

Kanülü indirmeden önce, fiber optik kabloyu fiber bağlantılı bir LED kaynağına bağlayın. 400 mikrometre çapındaki optik fiberi AP negatif 3.08 milimetre ve ML 0.5 milimetre koordinatlarında VTA'ya indirin. Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrot temas bölgelerini CA1'in piramidal hücre tabakasına yerleştirin.

Işık darbesini nöral kayıtla senkronize etmek için, LED sürücüsünü ve kayıt denetleyicisi dijital içe aktarmayı bir BNC ayırıcıya sahip bir transistör-transistörlü mantık pulserine bağlayın. Fotoelektrik artefaktlar üretmeden bir yanıt oluşturabilecek etkili yoğunluğu belirlemek için düğmeyi ayarlayın ve kafatasındaki zemini adaptör üzerindeki zemine bağlayın. Ön'ü bağlayınampyükseltici kafa aşaması bir seri çevresel arabirim kablosuyla kayıt denetleyicisine bağlayın ve kayıt denetleyicisi bağlantı noktalarındaki LED renkli ışıkları kontrol edin.

Yeşil ve sarı LED'ler, bağlı amplifikatör kartındaki uygun voltajı gösterir ve kırmızı led, çalışan bir yazılım kafası aşama kontrolünü gösterir. Yazılımı başlattıktan sonra, veri dosyası biçimini seçin ve dosya adını değiştirin. Bağlı kafa aşaması için bağlantı noktasına geçin ve elektrotun baş aşamasından daha az kanalı varsa, tümü bağlantı noktasını devre dışı bırak'a tıklayın.

Ekranda görüntülenecek uygun kanal sayısını seçin. Senkronize nöral kayıt ve ışık darbesiyle tetiklenen zaman damgası için TTL zaman damgasını yakalamak için dijital içe aktarmalara tıklayın ve dijitali sıfır birde etkinleştirin. Bu, amplifikatör dijital ithalatındaki BNC bağlantısına karşılık gelmelidir.

Uygun dalga biçimi ekranı için zaman ölçeğini ve voltaj ölçeğini ayarlayın ve örnekleme hızını seçin, daha yüksek bir örnekleme hızının ve kanal sayısının dosya boyutunu artıracağını unutmayın. Ardından, tek ünite kaydı için amplifikatör bant genişliğini ayarlayın. Burada 300 ila 5.000 Hertz'lik bir kesme frekansı kullanıldı.

Spike ses için analog çıkış sesine tıklayın ve analog bağlantı noktasını etkinleştirin. Ardından optimum ses için kazancı ve susturucuyu ayarlayın. Amplifikatör kaydını ve ışık nabız trenini senkronize etmek için ekran sekmesine tıklayın ve işaretçiyi göster'i etkinleştirin.

BNC bağlantısına karşılık gelen uygun kanala geçin ve kayıt kanallarının ve dijital giriş kanalının nöral ani yükselmeleri ve ışık darbesi zaman damgalarını yakalayacak şekilde etkinleştirildiğinden emin olmak için bağlantı noktalarını yeniden inceleyin. Sürekli kaydedilen ani yükseliş trenini oluşturan dalga formlarını görüntülemek için sivri uç kapsamına tıklayın. Görüntülenecek dalga formlarının eşiğini ayarlamak için fareyi kullanın.

Ardından, kaydınızdaki gürültü seviyesini belirlemek için RMS'yi inceleyin. Adeno ilişkili virüs ekspresyonu, enjeksiyondan 21 gün sonra farelerin ventral tegmental bölgesinde EYFP'nin immünofloresan görüntülemesi ile doğrulandı. Floresan görüntüleme ayrıca hipokampus katmanları DG, CA3 ve CA1'deki pre-sinaptik VTA glutamat projeksiyonlarını tespit etmek için kullanıldı.

Hücre dışı voltaj aktivitesi tespit edildiğinde, istenen frekansta ışık darbesini tetiklemeden önce temel aktivite yaklaşık 10 dakika boyunca kaydedildi. Bu, VTA glutamat fotostimülasyonundan önce ve sonra CA1 varsayılan nöronlarının ateşleme veya patlama oranlarını karşılaştırmayı mümkün kılmıştır. Bu sonucu desteklemek için, fotostimülasyondan önce ve sonra CA1 ağı ateşleme oranlarının istatistiksel olarak karşılaştırılması, stimülasyon sonrası dönem için önemli bir artış olduğunu ortaya koydu.

Patlamaları tespit etmek için raster treninin müteakip analizi, fotostimülasyondan sonra CA1 varsayılan piramidal nöronları için artan bir patlama hızı gösterdi. Fotosimülasyona yanıt, uyaran bölgelerindeki AAV raportör ifadelerinin floresan ile tanımlandı. Ayrıca, açıklaması, duyarlı varsayılan birimler için kayıt yeri ile ilişkilendirilmelidir.

Bu yöntem, davranışsal görevler üstlenen uyanık farelerde de uygulanabilir. Bu durumda kronik implante edilebilir problar ve fiber optik kanül kullanılmalıdır. Bu teknik, hedef bölgedeki presinaptik terminal dağılımı ve hedef bölge yanıtını in vivo olarak tespit etmek için presinaptik terminallerin modülasyonunun bir kombinasyonu yoluyla nörodevrelerin sağlam bir şekilde izlenmesine izin verecektir.