Name: Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Gangliadan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: Öğrenin, embriyonik sıçan üst servikal ganglionlarından sempatik nöronların izolasyonu ve kültürü için detaylı protokolleri. Bu yöntem morfolojik ve proteomik analizlerde sinir gelişimi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Saint Mary's College of California'daki Fakülte Geliştirme Fonu ve Yaz Araştırma Programı hibesi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Davis California Üniversitesi'nden Dr. Pamela Lein'e ve UC Berkeley Kütle spektrometresi tesisinden Dr. Anthony Iavarone'ye bu protokollerin geliştirilmesi sırasında ki tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Yazarlar ayrıca Video prodüksiyonu ve kurgusu ndaki yardımları için Saint Mary's College of California'daki College Communications OfisindeHaley Nelson'a teşekkür etmek istiyor.

Hayvanlarla ilgili çalışmalarda yapılan tüm prosedürler, Saint Mary's College of California'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Saint Mary's College'daki hayvan bakımı ve kullanım kılavuzları, Ulusal Sağlık Enstitüsü'ndeki (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf ve https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf) Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi tarafından sağlanan yönergelere göre geliştirilmiştir.
1. Kültür medyasının hazırlanması (kontrol aracı olarak da adlandırılır)
<ol><li>Aşağıdaki maddeleri, aşağıda listelenen sırayla, steril 500 mL şişeye ekleyin: 190 mL 1x düşük glikozlu DMEM, 10 mL 20 mg/mL yağ asidi serbest büyükbaş serum albumini (FAF-BSA) DMEM'de, 2.8 mL 200 mM L-glutamin, 4 mL 100x insülin-selenyum-transferrin karışımı, 0.4 mL 125 μg/mL sinir büyüme faktörü (DMEM'de %0.2 inert protein stabilizatörü) ve 200 mL Ham F-12 ortamı.</li>
	<li>Pipetin pipete yapışmasını önlemek için insülin-selenyum transferrin ve NGF gibi protein içeren çözeltilerin eklenmesinden önce pipeti FAF-BSA içeren ortamla kapladığından emin olun.</li>
	<li>Her eklemeden sonra malzemeyi karıştırmak için şişe girdap. F-12 ilave edildikten sonra 25 mL'lik pipetle iyice karıştırın.</li>
	<li>Aliquot kültür medya 10 mL aliquots ve saklamak -80 °C. Aliquots faaliyet kaybı olmadan altı ay saklanabilir.</li>
</ol>2. Kültür nöronları için plakahazırlanması
<ol><li>1 mg/mL poli-D-lizin stoğunu (0,5 M Tris tampon, pH 8'de yapılan) 100 μg/mL'ye kadar steril distile su ile seyreltin.</li>
	<li>Proteomik veya genomik analiz için, diseksiyondan bir ila iki gün önce, yaklaşık 2 mL steril 100 g/mL poli-D-lizin (PDL) içeren 6 kuyulu plakalar kaplanır. Bu kuyuya hücre yapışmasını sağlamak için gereklidir. Plakaları yapışkan filmle sarın ve plakaları gece boyunca 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Morfolojik analiz ve mikroskopi için, 12 mm2 önceden işlenmiş Alman cam kapakları (daha önce18 veya satın alınan nitrik asit tedavisi ile temizlenebilir) 24 kuyuluk bir tabak kuyularının her birine yerleştirin.<ol>
<li>0,3 mL steril 100 g/mL poli-D-lizin (PDL) ile kaplama kapakları. Plakaları gece boyunca 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseksiyon günü, diseksiyon başlamadan önce, kuyulardan poli-D-lizin çözeltisini çıkarın ve kuyuları steril distile suyla beş kez durulayın ve ardından düşük glikozlu DMEM ile bir kez durulayın.</li>
	<li>Gangliyonun enzimatik sindirimi sırasında (hücreleri kaplamadan yaklaşık bir saat önce), DMEM'i plakalardan aspire edin ve 0,3 mL kontrol ortamı ile değiştirin. Plakaları 35,5 °C'de %5 CO2 altında nemli bir odada saklayın.</li>
</ol>3. Diseksiyon kurulumu
<ol><li>Diseksiyon için 200 mL'lik ortam hazırlanması (Diseksiyon media olarak adlandırılır)<ol>
<li>Düşük glukozLu DMEM'de (1 mg/mL glukozlu) 20 mg/mL yağ asidi içermeyen büyükbaş serum albumini (FAF-BSA) ve 193 mL steril Leibovitz'in L-15 orta (veya herhangi bir hava tamponlu orta) 100x penisilin-streptomisin 2 mL ekleyin</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaputta, diseksiyon için aşağıdaki öğeleri ayarlayın: her tüpte yaklaşık 20 mL diseksiyon media ile dört adet 50 mL steril konik tüp, 1,5 mL diseksiyon media ile dört steril 35 mm çanak, santrifüj için 20 mL diseksiyon media ile bir steril 50 mL konik tüp, santrifüj için bir steril 15 mL konik tüp , ve ayrıştırılmış hücreleri toplamak için bir steril 10 mL tüp.</li>
	<li>En az bir dakika boyunca ince forseps (no.4 veya no. 5 forseps) sterilize etmek için kuru boncuk sterilizatör kullanın.</li>
</ol>4. Embriyonik sıçan yavrularından superior servikal gangliyonun izolasyonu
<ol><li>Hamile sıçandan E21 embriyolarının çıkarılması NOT: Çevredeki alan iyice sterilize edilirse rahim boynuzunun çıkarılması kaputun dışına yapılabilir.<ol>
<li>CO2 inhalasyon kullanarak hamile sıçan ötenazi. Karın bölgesinden kürk yamak ve sterilize etmek için% 70 alkol ile bölgede cilt silin.</li>
		<li>Steril makas ve forceps taze bir set kullanarak, deri ve daha sonra embriyoiçeren rahim boynuzları ortaya çıkarmak için kas tabakası ile kesti. Bu süreçte bağırsaklara zarar vermemeye özen tayarak yeni bir makas ve çalgılar seti kullanarak embriyolarla rahim boynuzlarını çıkarın.</li>
		<li>Embriyolarla birlikte rahim boynuzlarını 150 mm2 steril Petri kabına aktarın ve kaputa aktarın.</li>
		<li>Forceps ve makas yeni bir dizi kullanarak, rahim boynuzu gelen embriyolar kaldırmak ve amniyotik membranlar ve plasenta embriyoları ayırın.</li>
		<li>Embriyoları ötenazi yapmak için, sağ kol altında orta çizgi boyunca embriyoların omurilik kesti. Bu da SCG çıkarılması sırasında karotis arter kanaması azaltacaktır.</li>
		<li>Bu embriyoları diseksiyon ortamı içeren hazırlanmış 50 mL konik tüplere aktarın. Embriyoların medyaya gömüldüğünü emin ol. Her tüp 3 embriyo yada kadar tutabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyodan superior servikal ganglion izolasyonu<ol>
<li>Diseksiyon medyasından bir yavruyu, substrat üzerindeki dorsal yüzeyi ile yarı katı substrat (parafin balmumu veya silikon polimer) ile dolu steril 150 mm2 Petri kabına aktarın. Üç steril 23 G iğne kullanarak, boynu dikkatlice genişletmek için yavruyu her bir kolun altından bir iğne ve ağızdan üçüncü bir iğne yle tabağa sabitleyin.</li>
		<li>Altında tükürük bezleri ortaya çıkarmak için steril ince çalgılar (no. 4 veya no. 5 forceps) kullanarak boyun bölgesinde deri ile kesin. İnce forceps kullanarak bu bezleri çıkarın.</li>
		<li>Sırasıyla köprücük kemiği ve trakea yakınında sternokleidomastoid ve omohyoid kasları bulun. Önce enine sternokleidomastoid kasları kesip sonra ince forceps kullanarak ince omohyoid kas dikkatle kesti. Bu kaslar çıkarıldıktan sonra, ön uçta karotis arter bifurkasyon trakea nın her iki tarafında görünür olacak, SCG karotis arter bu çatal altında bulunan.</li>
		<li>Kapalı forseps kullanarak, scg görselleştirmek için yavaşça karotis arter kaldırın. SCG'nin her iki tarafında bir tane forceps kullanarak karotisi çıkarın ve hazırlanan steril 35 mm2 tabaklara aktarın. Bu doku büyük olasılıkla karotis arter ile SCG içerecektir, nodose gangliyonu ile vagus siniryanı sıra bölgede kas veya yağ diğer segmentleri.</li>
		<li>Diğer taraftaki diseksiyon işlemini tekrarlayın. Aşağıda belirtilen kalan diseksiyon adımlarına devam etmeden önce tüm embriyolardan SG'leri çıkarın. Doku örneklerinin işlenmesini kolaylaştırmak için izole edilmiş dokuları 35 mm2 tabaktan ikisi arasında dağıtın.</li>
	</ol></li>
	<li>SCG'nin işlenmesi nin post-i işleme<ol>
<li>SCG'yi parçalanmış dokudan ayırmak için, önce yağ veya kas gibi herhangi bir yabancı dokuyu çıkarmak için ince kesetler kullanın, karotis bifurkasyona yakın bölgeden uzak durmaya özen.</li>
		<li>Bu dokular çıkarıldıktan sonra, iki gangliyon görünür. Nodose ganglion daha küçük ve dairesel, SCG ise badem şeklindedir. Vagus sinirini ve nodose gangliyonu karotisten ayırmak için vagus sinirini yavaşça çekin ve scg'yi karotis arterden ayırın.</li>
		<li>SCG çevreleyen kapsül kaldırmak için ince forceps kullanın. SCG'yi 35 mm'lik yeni bir kültür yemeğine aktarın. Tüm diseksiyon doku örnekleri ile işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Dokunun pipet duvarlarına yapışmasını önlemek için sterilize edilmiş, pamuklu cam pipeti diseksiyonu ile kaplayın. Diseksiyon mediasını, dokuların parçalanmasına yardımcı olmak için kalsiyum ve magnezyumsuz HBSS'de kollajenaz tip II (1 mg/mL)/dispase tip II (5 mg/mL) ile değiştirmek için pipeti kullanın. NOT: Kuluçka süresinin farklı kollajenaz/Dispase gruplarla optimize edilmesi gerekebilir ve genellikle 40 dakika ile bir saat arasında değişmektedir.</li>
		<li>Kuluçka sırasında DMEM'i plakalardan aspire edin ve 0,3 mL kontrol ortamı ile değiştirin. Plakaları 35,5 °C'de %5 CO2 altında nemli bir odada saklayın.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, kollajenaz/dispase'deki SG'leri steril 15 mL konik tüpe aktarın. Plakaları durulamak ve çözeltiyi tüpe aktarmak için diseksiyon ortamını kullanın. Ses düzeyini yaklaşık 10 mL'ye çıkaracak kadar diseksiyon ortamı ekleyin.</li>
		<li>200 x g (1000 - 1200 rpm) oda sıcaklığında 5 dakika boyunca numuneyi peletlemek için santrifüj. Supernatant aspire, pelet yerinden değil dikkat. 10 mL diseksiyon media ile peleti yeniden askıya alın. Santrifüjtekrar layın ve supernatant atın.</li>
		<li>1 - 2 mL kültür ortamı ile değiştirin. Dar delikli, bükülmüş uçlu steril pastör pipet (kültür ortamı ile önceden kaplanmış) kullanarak, 5-6 kez hafifçe triturating tarafından mekanik kümeleri ayrıştırın. Büyük kümeler yaklaşık bir dakika razı olsun. Süpernatant hücre süspansiyonuna yeni bir 10 mL tüp aktarın.</li>
		<li>Bu işlemi 3 kez daha tekrarlayın, her seferinde artan üçleme kuvveti ile SCG'lerin neredeyse tamamen ayrışmasını sağlayın.</li>
		<li>Sesi 8 -10 mL'ye çıkarmak için yeterli kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve hücre yoğunluğunu hemositometre ile ölçün.</li>
		<li>Deneyler için uygun hücre yoğunluğunda hücre süspansiyonu kuyulara dağıtın. Hücrelerin kuyulara eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için kaplama işlemi sırasında hücre süspansiyonuna sürekli olarak karıştırın. NOT: Morfolojik analiz için, hücreleri 24 kuyu plakasında 8.000 hücre/kuyu etrafında ve genomik ve proteomik protokoller için, hücreleri 30.000 hücre/kuyuya kadar plakalayın.</li>
		<li>Bir nemli oda oluşturmak için alt steril su ile bir cam kurutucu plakaları aktarın. Sızdırmazlıktan önce kurutucuda %5 CO2 ortamı elde etmek için yeterli CO2 (yaklaşık 120 mL) enjekte edin. Plakaları 35,5 °C'de saklayabilirsiniz. Bu, protokolde Gün 0 olarak adlandırılır. NOT: Bu plakalar düzenli olarak %5 CO2 inkübatörde de muhafaza edilebilir. Yukarıda açıklanan yöntem sıcaklık ve pH değişikliklerini en aza indirir ve çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Kültürdeki SCG nöronların bakımı ve tedavileri
<ol><li>1. Günde (kaplamadan 24 saat sonra), kültür ortamının yarısını dikkatlice çıkarın ve 2 μM Ara-C (sitozin β-D-arabinofuranoside, anti-mitotik ajan) ile değiştirin. Tedaviyi 48 saat boyunca hücrelerde bırakın. Genellikle, tedavi bu uzunluğu kültürde olmayan nöronal hücreleri ortadan kaldırmak için yeterlidir.</li>
	<li>3. Günde, orta ortamın yarısını hafifçe aspire edin ve kontrol ortamıyla değiştirin.</li>
	<li>4. günde hücreler deneysel tedaviler ehazırdır. Her gün kültürleri uygun ortamla besleyin, kuyudaki ortamın yarısını taze ortamla nazikçe değiştirin.</li>
	<li>Serumsuz ortamda kültürlü SCG nöronlar sadece aksonları genişletir. Deneyler dendritlerin varlığını gerektiriyorsa, hücreleri %10 fetal baldır serumu, 75-100 μg/mL bazal membran matris ekstresi veya 50 ng/mL kemik morfogenetik protein-7 ile tedavi edin. Dendritik büyüme tedaviden sonraki bir hafta içinde ayrıntılı dendritik arbor ile tedaviden sonraki 48 saat içinde gözlenir.</li>
</ol>6. Immunostaining kültürlü SCG nöronlar
<ol><li>Yavaş yavaş 0,1 M fosfat tampon% 4 paraformaldehit ile kuyuda hücre kültürü ortamı yerine, bir duman kaputunda pH 7.2.<ol>
<li>Kuyudaki kültür ortamının yarısını çıkarın ve %4 paraformaldehit le nazikçe değiştirin. Daha sonra işlemi en az iki kez daha tekrarlayın, her seferinde kuyudaki medyanın üçte ikisini kaldırın ve %4 paraformaldehit yerine. Bu işlemin sonunda, kuyudaki ortamın rengi pembeden renksize doğru değişmeliydi.</li>
		<li>Tüm ortam %4 paraformaldehit ile değiştirildikten sonra, kuyuları oda sıcaklığında 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi benzer bir işlemle, %4'lük paraformaldehit çözeltisini yavaş yavaş fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 ile değiştirin. 5 dakika bekletin. PBS ile 5 dakika her biri için iki kez daha kuyuları durulayın.<ol>
<li>%4 paraformaldehit çıkarıldıktan sonra, daha fazla işlem için plakaları tezgahın tepesine taşıyın. Bu adım, plakaların bir gecede 4 °C'de saklanabileceği iyi bir durma noktasıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm PBS kaldırın. Hücreleri kapsayacak şekilde PBS%0.1 Triton X-100 hacmi ni ekleyin. Nöronları permeabilize etmek için 5 dakika kültürlerüzerinde bırakın. Bu adımın zamanlaması hücrelerin bütünlüğünü korurken iyi boyama sağlamak için önemlidir.</li>
	<li>Triton X-100 çözeltisini dikkatlice çıkarın ve PBS ile her seferinde 5 dakika boyunca kuyuları üç kez durulayın. PBS çözümlerini çıkarın.</li>
	<li>PBS'de hücreleri kapsayacak kadar %5 BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Engelleme çözeltisini çıkarın ve PBS'de %5 BSA'da seyreltilmiş MAP-2 proteinine karşı fare monoklonal antikor ile değiştirin. Birincil antikorları bir gecede 4 °C'de hücrelere bırakın.</li>
	<li>Birincil antikor'u yeniden kullanmak için çıkarın ve kaydedin. Primer antikor algılama yoğunluğu kaybı olmadan en az iki kez yeniden kullanılabilir.</li>
	<li>Hücreleri kapsayacak kadar PBS ile üç kez durulayın. PBS'yi durulama başına 10 dakika boyunca hücrelerde bırakın.</li>
	<li>PBS çözeltisini çıkarın ve PBS'de %5 BSA'da 1:1000 seyreltmede floresan etiket konjuge Keçi anti-Mouse IgG ikincil antikor ile değiştirin. Oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat kuluçka.</li>
	<li>İkincil antikor çıkarın ve PBS ile değiştirin. Kuyuları PBS ile üç kez durulayın ve 10 dakika yıkın. Herhangi bir tuzları kaldırmak için su ile bir kez kuyuları durulayın.</li>
	<li>Kapakları, floresan olarak etiketlenmiş numuneler için uygun olan bir damla sulu montaj antanını içeren cam kaydıraklara monte edin. Slaytları görüntülemeye hazır olana kadar slayt klasöründe 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>7. Kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi silikatografi kullanılarak proteom analizi için numune hazırlama
<ol><li>Kültürlü nöronların lysis<ol>
<li>Kuyudaki tüm kültür ortamını nazikçe kaldırın. Soğuk, steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 ile değiştirin. Hızlı bir şekilde çıkarın ve PBS ile değiştirin ve 5 dakika boyunca oturup sağlar. Bu adım kültür medyasında bulunan proteinleri uzaklaştırmak için yapılır.</li>
		<li>Dikkatle belirli bir tedavi için tüm kuyulardan tüm PBS kaldırın. İşlemi bir kez daha tekrarlayın. Nöronal hasarı ve proteozisi en aza indirmek için hücreleri lysing yaparken buz üzerinde plakaları koruyun.</li>
		<li>Kuyulardan birine 50 mM amonyum bikarbonat, pH 7,5 (NH4HCO3)100 - 150 μL ekleyin ve steril bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın. Bir mikropipet kullanarak, sıvı transferi ve belirli bir tedavi için tüm kuyular ile kazıma işlemi tekrarlayın. Hücrelerin çoğunun çıkarıldığından emin olmak için kazıma sonra mikroskop altında kuyuları inceleyin.<ol>
<li>Nöron sayısının düşük olmasıyla, proteomik analiz için yeterli konsantrasyonu sağlamak için hücreleri lyse sınırlı bir hacim kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hücre lisi ile yardımcı olmak için çözeltiyi bir gecede -80 °C'de dondurun. Lysates daha fazla işleme hazır olana kadar bu aşamada saklanabilir.</li>
		<li>Çözüldükten sonra, hücreleri mekanik olarak eritmek için numuneleri 26 G veya 28 G iğnesi ile bir şırınga dan fışkırtın.</li>
		<li>10 dakika boyunca iki kez sonicating su banyosuörnekleri sonicate. Proteinlerin aşırı ısınmasını ve denatürasyonunu önlemek için su banyosuna buz ekleyin. 12.000 x g4 °C'de 5 dakika santrifüj .</li>
		<li>Protein konsantrasyonu ölçün. Tipik protein konsantrasyonları 0,4 - 1 μg/μL arasında değişmektedir</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteom analizi için numune hazırlama ve tripsin sindirimi<ol>
<li>En fazla 60 μL lysate veya 50 μg proteini DNase-, RNase ve proteease-free-free 1.5 mL tüpe aktarın. Lysat'ın hacmi 60 μL'den azsa, hacmi oluşturacak kadar 50 mM amonyum bikarbonat ekleyin.</li>
		<li>% 0.2 asit labile yüzey aktif madde ve girdap 25 μL ekleyin. Tüpü 80 °C'de bir blok ısıtıcıda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü 12.000 x g'de 30 s için santrifüj edin.</li>
		<li>100 mM dithiothreitol ve girdap 2.5 μL ekleyin. Bu protein daha alkilyasyon ve sindirim için erişilebilir hale getirir. Tüpü 60 °C'de bir blok ısıtıcıda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığına ve santrifüje kadar serin.</li>
		<li>Numune ve girdaba 2,5 μL 300 mM iodoacetamide ekleyin. Bu adım sisteinallate yardımcı olur ve disülfit bağları reform onları engeller. Tüpleri 30 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bir tripsinde tüpe kütle spektrometresi dereceli tripsin (0.5 g/μL) ekleyin: protein oranı 1:10. Numuneleri bir gecede 37 °C'de sindirin.</li>
		<li>% 5 trifloroasetik asit (TFA) ve girdap 10 μL ekleyin. Örnekleri 37 °C'de 90 dakika kuluçkaya yatırın. Bu adım, kütle spektrometresi sırasında paraziti önlemek için asit labile yüzey aktif hidrolize etmek için gereklidir.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 12.000 x g'da 30 dakika santrifüj edin ve ön yarık Teflon/Silikon septum kapaklı kromatografi sertifikalı berrak cam şişeye aktarın. Numuneler kütle spektrometresi analizi öncesinde -20 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Örnek şişeleri yüksek tanımlı kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografiye tabi talın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li>
<li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li>
<li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li>
<li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li>
<li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li>
<li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li>
<li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li>
<li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li>
<li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li>
<li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).</li>
<li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li>
<li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatera-Naranjo%2C+O+%22RNA+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">RNA (New York, N.Y.)</a>. 16 (8), 1516-1529 (2010).</li>
<li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+%CE%B2-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li>
<li>Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li>
<li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+version+11%3A+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways%2C+and+data+analysis+tool+enhancements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li>
<li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li>
<li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li>
<li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture%3A+Autonomic+and+Enteric+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%2C+EMBS%22%5BJournal%5D)">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+31st+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%3A+Engineering+the+Future+of+Biomedicine%2C+EMBC+2009%22%5BJournal%5D)">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li>
<li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+Primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).</li>
<li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clujul+Medical%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).</li>
<li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazı, embriyonik sıçan yavrularının üstün servikal gangliyonundan sempatik nöronların kültürlendirilmesi için protokolleri açıklamaktadır. Bu model sistemi kullanmanın avantajları, büyüme faktörlerine benzer bir yanıt veren nöronların homojen bir popülasyon elde etmek mümkün olmasıdır, ve bu nöronlar için büyüme faktörü gereksinimleri iyi karakterize olduğundan, serumsuz koşullar altında, tanımlanmış ortamda vitro bu nöronlar büyümek mümkündür10. Protokol E21 sıçan yavrularından SCG izole sürec...

Embriyonik superior servikal gangliyondan (SCG) elde edilen sempatik nöronlar, büyüme faktörü bağımlılığı da dahil olmak üzere nöronal gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak birincil nöronal kültür sistemi olarak kullanılmaktadır. nöron hedef etkileşimleri, nörotransmitter sinyalizasyon, aksonal büyüme, dendrite gelişimi ve plastisite, sinaptogenez ve sinir-hedef /nöron-glia etkileşimleri altında yatan sinyal mekanizmaları1,2,3,4,5,6,7,8,9. Onların küçük boyutuna rağmen (yaklaşık 10000 nöronlar / ganglia), gelişimi ve bu kültür sisteminin yaygın kullanımı için üç ana nedeni vardır i) sempatik zincirinde ilk ganglia olmak, onlar daha büyük, ve bu nedenle izole etmek daha kolay, sempatik ganglia geri kalanından daha10; ii) merkezi nöronlar aksine, SCG nöronlar oldukça nöral ibik türetilen tüm nöronlar ile homojen, benzer bir boyuta sahip, sinir büyüme faktörü bağımlılığı ve ne adrenerjik olmak. Bu onları morfolojik ve genomik çalışmalar için değerli bir model yapar10,11 ve iii) Bu nöronlar bir ay boyunca sinir büyüme faktörü içeren tanımlanmış bir serum içermeyen ortamda muhafaza edilebilir10,12. Perinatal SCG nöronlar yoğun olarak dendritlerin başlatılması ve bakımı altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır2. Bunun başlıca nedeni, SCG nöronlar in vivo geniş bir dendritik arbor olmasına rağmen, onlar serum yokluğunda in vitro dendritler uzatmak yok ama kemik morfogenetik proteinler 2 gibi bazı büyüme faktörlerinin varlığında dendritler büyümeye indüklenebilir2,12,13.
Bu yazıda embriyonik sıçan SCG nöronların izole ve culturing için protokol açıklanmaktadır. Son 50 yıl içinde, SCG birincil nöronal kültürler ağırlıklı olarak büyük ölçekli genomik veya proteomik değişiklikleri inceleyen çalışmalar sınırlı sayıda morfolojik çalışmalar için kullanılmıştır. Bunun başlıca nedeni düşük miktarda DNA veya proteinin izole edilmesiyle sonuçlanan küçük doku boyutudur, bu da bu nöronlar üzerinde genomik ve proteomik analizlerin gerçekleştirilmesini zorlaştırır. Ancak, son yıllarda, artan algılama duyarlılığı dendritik büyüme gelişimi sırasında SCG nöronlarda genom, miRNom ve proteom incelemek için yöntemlerin geliştirilmesini sağlamıştır14,15,16,17. Bu yazı da immünositokimya ve kütle spektrometrik analizi için nöronal protein özleri elde etmek için bir protokol kullanarak bu nöronların morfolojik analizi için yöntem açıklayacağız.

<table><tbody><tr><td>2D nanoACQUITY</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>354-BP</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Alümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kazıyıcı</td><td>Corning</td><td>CLS-3010</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar veya Nunc Düz tabanlı Hücre kültürü plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200, 140675, 142475</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin- &beta;- D-arabinofuranosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>D-fosfat tamponlu salin (Kalsiyum ve magnezyum içermez)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış Su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Düşük glikoz + Glutamin, + sodyum piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Asidi İçermeyen BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126609</td><td>Düşük glikozlu DMEM İnce forsepslerde 20 mg / mL stok</td></tr><tr><td>Dumont no.4 ve no.5</td><td>Ted Pella Inc</td><td>5621, 5622</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon için Forseps ve Makas</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1328, 1329, 5002</td><td></td></tr><tr><td>Cam kapaklar - 12mm</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>Keçi-Anti Fare IgG Alexa 488 konjuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Jambonun F-12 Besin Karışımı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözümü (Kalsiyum ve Magnezyum içermez)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Selenyum-Transferrin (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 orta Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller için montaj ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931, P36934</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-MAP2 antikoru (SMI-52)</td><td>BioLegend</td><td>SMI 52</td><td></td></tr><tr><td>Sinir büyüme faktörü</td><td>Envigo Bioproducts (eski adıyla Harlan Bioproducts)</td><td>BT5017</td><td>Stok 125 &mu; DMEM'de %0.2 Prionex içinde g / mL</td></tr><tr><td>Paraformaldehye</td><td>Spektrum Kimyasalları</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (100X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Prionex</td><td>Millipore</td><td>529600</td>% <td>10 çözelti, 100 mL</td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters Corporation</td><td>186001861</td><td>5 X 1 mg</td></tr><tr><td>Synapt G2 Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometresi</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trifloro asetik asit - Sıralama sınıfı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>10 X 1 mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Promega veya NEB</td><td>V511A, P8101S</td><td>100 &; g veya 5 X 20 mg</td></tr><tr><td>Waters Toplam geri kazanım şişeleri</td><td>Waters Corporation</td><td>186000385c</td><td></td></tr></tbody></table>

morfolojik ve proteomik analiz için embriyonik superior servikal ganglia'dan sıçan sempatik nöronlarının culturing

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Embriyonik sıçan üstün servikal gangliyonunsempatik nöronlar (SCG) aksonal büyüme, aksonal kaçakçılık, sinaptogenez, dendritik büyüme, dendritik plastitik plastisite ve eş-kültür sistemlerinde sinir hedef etkileşimleri incelemek için periferik nöronlar için bir in vitro model sistemi olarak kullanılmıştır. Bu protokol, E21 sıçan embriyolarının üstün servikal ganglinden nöronların izolasyonunu ve ayrıştırMalarını, ardından serumsuz ortamda saf nöronal kültürlerin hazırlanması nı ve bakımını açıklar. Nöronlar kaplamasız plastik yapışmaz olduğundan, nöronlar ya 12 mm cam kapakları veya poli-D-lizin ile kaplı 6-iyi plakalar kültürlü olacaktır. Bir antimitotik ajan (Ara-C, sitozin β-D-arabinofuranoside) ile yapılan tedavinin ardından, bu protokol% 5'ten az nöronal olmayan hücrelerile sağlıklı nöronal kültürler oluşturur, hangi in vitro bir ay boyunca muhafaza edilebilir. Embriyonik sıçan SCG nöronlar in vivo 5-8 dendritler ile multipolar olmasına rağmen; serumsuz koşullar altında, bu nöronlar kültürde sadece tek bir akson genişletmek ve kültür süresince tek kutuplu olmaya devam. Ancak, bu nöronlar bazal membran ekstresi varlığında dendritler uzatmak için indüklenebilir, kemik morfogenetik proteinler (BP), veya 10% fetal buzağı serum. Bu homojen nöronal kültürler immünositokimyasal boyama ve biyokimyasal çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda ayrıca bu nöronlarda mikrotübül ilişkili protein-2 (MAP-2) için immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometresi için nöronal ekstrelerin hazırlanması için optimize edilmiş protokol açıklanmaktadır.

Embriyonik SCG nöronların nöronal kültürleri izole etmek ve sürdürmek Sıçan embriyonik SCG'sinden ayrıştırılan hücreler poli-D-lizin kaplı plaka veya coverslip ile kaplandı ve b-sinir büyüme faktörü içeren serumsuz kültür ortamlarında muhafaza edildi. Nöronlar ve glial hücrelerin karışımını içeren ayrışmış hücreler kaplama üzerine dairesel görünürler (Şekil 1A). Kaplamadan sonraki 24 saat içinde nöronlar glial hücrelerin düzeşme ve faz kontrastlı mikroskopi altında faz-ko...

Bu yazı, embriyonik sıçan sempatik nöronların superior servikal gangliyondan izole ve kültürlenmesini açıklamaktadır. Ayrıca immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometrik analizi için nöronal özler hazırlamak için ayrıntılı protokoller sağlar.

Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Bu videoda, morfolojik ve proteomik analiz için embriyonik sıçanların superior servikal gangliyonunun culturing'ini göstereceğiz. Diseksiyona başlamadan önce kontrol ve diseksiyon ortamı nı hazırlayın. Kontrol ortamı F-12 ve düşük glukoz Lum içeren bir insülin-selenyum-transferrin karışımı ile takviye, glutamin, sinir büyüme faktörü, ve BSA.Diseksiyon ortamı, kalem-strep ve BSA ile birlikte L-15 içerir. Medya hazırlığı için ayrıntılı protokoller için el yazmasına bakın. Nöronların kültüre için plakahazırlanması.Steril distile su ile mililitre başına 100 mikrogram poli-D-lizin stoğu başına bir miligram seyreltin. Proteomik veya genomik analiz için, diseksiyondan bir ila iki gün önce, altı kuyulu plakaları yaklaşık iki mililitre steril 100 gram lık poli-D-lizin mililitresine katedin. Bu kuyuya hücre yapışmasını sağlamak için gereklidir.Plakaları yapışkan filmle sarın ve tabakları bir gecede dört derece saklayın. Diseksiyon günü, diseksiyon başlamadan önce, kuyulardan poli-D-lizin çözeltisini çıkarın ve kuyuları steril distile suyla beş kez durulayın, ardından düşük glikozlu DMEM ile bir kez durulayın. Gangliyonun enzimatik sindirimi sırasında, hücreleri kaplamadan yaklaşık bir saat önce, DMEM'i plakalardan aspire edin ve 0.3 mililitre kontrol ortamı ile değiştirin.Plakaları 35 derecede nemlendirilmiş bir odada %5 CO2 altında saklayın. Başlık, diseksiyon için aşağıdaki öğeleri ayarlayın. Her tüpte yaklaşık 20 mililitre diseksiyon media ile dört 50 mililitre steril konik tüpler.Dört steril 35 milimetrelik tabak ve 1.5 mililitre diseksiyon ortamı. Santrifüj için 20 mililitre diseksiyon media ile bir steril 50 mililitre konik tüp. Bir 15 mililitre steril konik tüp gangliyonu santrifüj için, bir steril 10 mililitre tüp ayrıştırılmış hücreleri toplamak için.En az bir dakika boyunca ince forseps bir çift sterilize etmek için kuru boncuk sterilizatör kullanın. Hayvanlarla ilgili çalışmalarda yapılan tüm prosedürler, Saint Mary's College of California'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Saint Mary's College of California'daki hayvan bakımı ve kullanım kılavuzları, Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi tarafından sağlanan yönergelere göre geliştirilmiştir.Hamile sıçandan E21 embriyolarının alınması. Çevredeki alan iyice sterilize edilirse rahim boynuzunun çıkarılmasının kaputun dışında yapIlebilmektedir. Co2 soluma ile hamile bir sıçan ötenazi.Karın bölgesinden kürk yamak ve sterilize etmek için% 70 alkol ile bölgede cilt silin. Steril makas ve forceps taze bir set kullanarak, deri ve daha sonra embriyolar içeren rahim boynuzları ortaya çıkarmak için kas ile kesti. Bu süreçte bağırsaklara zarar vermemeye özen görerek yeni bir makas ve çalgılar seti kullanarak, embriyolarla rahim boynuzunu çıkarın.150 milimetre steril Petri çanak içine embriyolar ile rahim boynuzu transfer ve kaputiçine aktarın. Forceps ve makas yeni bir dizi kullanarak, rahim boynuzu gelen embriyolar kaldırmak ve amniyotik membranlar ve plasenta embriyoları ayırın. Embriyoları ötenazi yapmak için, sağ kol altında orta çizgi boyunca embriyoların omurilik kesti.Bu SCG çıkarılması sırasında karotis arter kanaması azaltacaktır. Bu embriyoları diseksiyon ortamı içeren hazırlanmış 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Embriyoların medyaya gömüldüğünü emin ol.Her tüp üç embriyo tutabilir. Embriyodan superior servikal ganglion izolasyonu. Diseksiyon medyasından bir yavruyu, substrat üzerindeki dorsal yüzeyi ile yarı katı substratla dolu steril 150 milimetrelik Petri kabına aktarın.Üç steril 23 gauge iğnekullanarak, dikkatle boyun hiperextend ağız yoluyla her kol altında bir iğne ve ağız yoluyla üçüncü bir iğne ile çanak pub pin. Altında tükürük bezleri ortaya çıkarmak için steril ince çalgılar kullanarak boyun bölgesinde deri ile kesin. İnce forceps kullanarak bu bezleri çıkarın.Sırasıyla köprücük kemiği ve trakea yakın sternokleidomastoid ve omohyoid kasları bulun. İlk olarak, enine sternokleidomastoid kasları kesin. Ve sonra dikkatle ince forceps kullanarak ince omohyoid kas kesti.Bu kaslar çıkarıldıktan sonra, ön uçta karotis arter bifurkasyon, karotis arter bu çatal altında bulunan SCG ile trakea nın her iki tarafında görünür olacaktır. Kapalı forseps kullanarak, scg görselleştirmek için yavaşça karotis arter kaldırın. SCG'nin her iki tarafında bir tane forceps kullanarak karotisi çıkarın ve hazırlanan steril 35 milimetrelik yemeklere aktarın.Bu doku büyük olasılıkla karotis arter ile SCG içerecektir, nodose gangliyonu ile vagus sinir, yanı sıra bölgede kas veya yağ diğer segmentleri. Diğer taraftaki diseksiyon işlemini tekrarlayın. Özetlenen kalan diseksiyon adımlarına devam etmeden önce tüm embriyolardan SG'leri çıkarın.Doku örneklerinin işlenmesini kolaylaştırmak için izole edilmiş dokuları 35 milimetrelik tabakların ikisi arasında dağıtın. SCG'nin işlenmesinden sonra. SCG'yi parçalanmış dokudan ayırmak için, önce karotis bifurkasyona yakın bölgeden uzak durmaya özen görerek kas veya yağ gibi yabancı olmayan dokuları çıkarmak için ince kesetler kullanın.Bu dokular çıkarıldıktan sonra, iki gangliyon görünür. SCG badem şeklinde iken nodose ganglion küçük ve dairesel. Vagus sinirini ve nodose ganglionu karotisten ayırmak için vagus sinirini yavaşça çekin ve scg'yi karotis arterden ayırın.SCG çevreleyen kapsül kaldırmak için ince forceps kullanın. SCG'yi 35 milimetrelik yeni bir kültür yemeğine aktarın. Bu işlemi tüm diseksiyonlu doku örnekleri ile tekrarlayın.Dokunun pipet duvarlarına yapışmasını önlemek için sterilize edilmiş, pamukla tıkanmış cam pipeti diseksiyonu ile kaplayın. Dokuların parçalanmasına yardımcı olmak için diseksiyon ortamını steril iki mililitre kollajenaz tip II, kalsiyum ve magnezyumiçermeyen HBSS'de dispase tip II ve 37 santigrat derecede 50 dakika kuluçkaya yatırmak için pipetkullanın. Kuluçka sürelerinin farklı kollajenaz/dispase gruplarla optimize edilmesi gerekebileceğini ve genellikle 40 dakika ile bir saat arasında değişeceğini unutmayın.Kuluçkadan sonra, SG'leri ve kollajenaz/dispase'yi steril 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Plakaları durulamak ve çözeltiyi tüpe aktarmak için diseksiyon ortamını kullanın. Yaklaşık 10 mililitre ses getirmek için yeterli diseksiyon ortamı ekleyin.200 x g, 1, 000-1, 200 rpm oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüj numune pelet. Supernatant aspire, pelet yerinden değil dikkat. 10 mililitre diseksiyon media ile peleti yeniden askıya alın, santrifüjü tekrarlayın ve süpernatantı atın.Kültür ortamının bir ila iki mililitre ile değiştirin. Dar delikli, bükülmüş uçlu steril Pasteur pipetini kullanarak, kültür ortamıyla ön katlayın, beş ila altı kez hafifçe triturating ederek kümeleri mekanik olarak ayrıştırın. Büyük kümeler yaklaşık bir dakika razı olsun ve yeni bir 10 mililitrelik tüp için supernatant hücre süspansiyon aktarın.SG'lerin neredeyse tamamen ayrışmasını sağlamak için her seferinde artan üç triturasyon kuvveti ile bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Hacmi sekiz ila 10 mililitreye çıkaracak kadar kültür ortamı ekleyin.Bir hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve hücre yoğunluğunu hemositometre ile ölçün. Deneyler için uygun hücre yoğunluğunda hücre süspansiyonu kuyulara dağıtın. Hücrelerin kuyulara eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için kaplama işlemi sırasında hücre süspansiyonuna sürekli olarak karıştırın.Morfolojik analiz için, 24 kuyulu bir plaka da kuyu başına 8.000 hücre etrafında hücreleri plaka. Ve genomik ve proteomik protokoller için, hücreleri kuyu başına 30.000 hücreye kadar çık. Bir nemli oda oluşturmak için alt steril su ile bir cam kurutucu plakaları aktarın.Sızdırmazlıktan önce kurutucuda %5 CO2 ortamı elde etmek için yeterli CO2 enjekte edin, yaklaşık 120 mililitre. Plakaları 35.5 santigrat derecede koruyun. Bu, protokolde sıfır günü olarak adlandırılır.Bu plakalar aynı zamanda düzenli olarak %5 CO2 inkübatörde muhafaza edilebilir. Yukarıda açıklanan yöntem sıcaklık ve pH değişikliklerini en aza indirir ve çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur. Kültürdeki SCG nöronların ve tedavilerin bakımı.Bu resimler, birinci gün, birinci gün ve beşinci gün, parçalanmış superior servikal gangliyon hücrelerini gösteriyor. Gün sıfır görüntü kaplama üzerine hücreleri gösterir. Sıfır.İlk gün, kaplamadan 24 saat sonra, kültür medyasının yarısını dikkatlice çıkarın ve iki mikromolar Ara-C, sitozin D-arabinofuranoside, bir anti-mitotik ajan ile değiştirin. Tedaviyi 48 saat boyunca hücrelerde bırakın. Genellikle tedavi nin bu uzunluğu kültürde olmayan nöronal hücreleri ortadan kaldırmak için yeterlidir.Üçüncü gün, yavaşça yarım orta aspire ve kontrol ortamı ile değiştirin. Dördüncü günde, hücreler deneysel tedaviler için hazır. Kültürleri her gün uygun ortamla besleyin.Kuyudaki ortamın yarısını taze orta ile hafifçe değiştirin. Beşinci gündeki resimde dendritik büyüme gözlenmeden geniş aksonal büyüme görülmektedir. Dendritik büyümeyi sağlamak için, nöronlar Matrigel'de yetiştirilebilir veya kemik morfogenetik protein-7 mililitrebaşına %10 serum veya 50 nanogram ile tedavi edilebilir.Şekil 2, BMP-7 ile tedavi den sonra E21 sıçan SCG nöronlarının nöronal morfolojisinde değişiklikler göstermektedir. 10 X büyütmede temsili faz kontrast mikrografları, a panelindeki kontrol nöronlarında aksonlu dairesel nöronal hücre gövdesini ve uygun tedavileri takiben B.Kültür dönemli SCG nöronlarında oklarla gösterilen BMP-7 ile tedavi edildiğinde birden fazla kısa dendrite benzeri prosese sahip nöronların genomik analiz ve biyokimyasal çalışmalar için immünositokimyasal boyama kullanılarak morfolojik analiz için kullanılabileceğini göstermektedir. proteomik analizler gibi. İmmünboyama ve proteomik analiz için numune hazırlama için ayrıntılı protokoller için el yazmasına bakın.Şekil 3 kültürlü embriyonik sıçanlarda MAP-2 proteininden immünboylama gösterir sempatik nöronlar. Paneller A d göstermek kültürlü SCG nöronlar kontrol ortamı ve paneller E H ile tedavi göstermek nöronlar BMP-7 ile tedavi 50 mililitre başına nanogram beş gün boyunca. C ve G'de mikrotübül ilişkili protein-2 ile nöronların immünositokimyasal boyanmasını gösteren temsili mikrograflar, B ve F faz kontrast mikrograflar ile D ve H bir nükleer leke, ve Mikrotübile ilişkili protein-2 gelen A ve D.Immunocytochemical boyama üç kanal ortaya hücre vücudunda ve panel C kontrol nöronların proksimal aksonları mevcut.Ve hücre vücudunda MAP-2 protein boyama , ve BMP-7 tedavi nöronlarda dendritler panel G.Here kontrol ortamı ile tedavi üstün servikal ganglia bir örnek çalışma, tespit 1, 100 protein.Panther veritabanını kullanan gen ontolojisi proteinlerin çoğunun sitoplazmik olduğunu buldu. Ancak, örnekte hücresel kavşaklarda membrana bağlı proteinler ve proteinler vardı. Bu analiz ayrıca, örneklemde çok çeşitli nöronal sinyal yollarında yer alan proteinlerin tespit edildiğini ortaya koymuştur.Sonuç olarak, bu videoyu izledikten sonra, morfolojik ve proteomik analiz için sıçan embriyonik üstün servikal ganglion nöronlar izole etmek ve kültür gerekir. Bu çalışma, Saint Mary's College of California'daki fakülte geliştirme fonu ve yaz araştırma programı tarafından finanse edilmiştir.

culturing-rat-sympathetic-neurons-from-embryonic-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu, yeni doğmuş sıçan yavruların üstün servikal ganglion (SCG) birincil sempatik nöronlar izole ve kültür nasıl açıklayan bir protokoldür.

Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Bu seçici perinatal sıçan üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış primer sempatik nöronlar, dendritik büyümesini teşvik etmek için kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya Matrigel kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Bu video, sıçan embriyolarından dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarını izole etmek ve olgun Schwann hücreleri oluşturmak için bunları Schwann hücre öncüleri ile birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. İzole edilen DRG'ler, nöronları ve glial hücreleri izole etmek için işlenir. İzole edilen hücreler, nöronları saflaştırmak için kültürlenir ve daha sonra bir ko-kültür ortamında Schwann hücre benzeri hücreler (SCLC'ler) ile birlikte kültürlenir. DRG nöronları ile etkileşim,...

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Bu videoda, sıçan omurgasından dorsal kök gangliyon (DRG) hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Omurgadan eksize edilen DRG'ler enzimlerle muamele edilir ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Hücreler, sırasıyla glial hücre proliferasyonunu sınırlayan ve nöronal büyümeyi destekleyen inhibitörler ve büyüme faktörleri içeren bir ortamda kültürlenir.

Bir Sıçan Omurgasından Primer Dorsal Kök Gangliyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Büyük pelvik gangliyonlar pelvik organları innerve parasempatik ve sempatik nöronlar içerir. Burada bir diseksiyon yöntemi tanımlamak ve bu gangliyonlar ve ilişkili sinirlerin belirlenmesi için şemalar sağlar. Bu yöntemler daha fazla çalışma için in vivo veya removal post-mortem bu ganglia deneysel manipülasyon uygulanabilir.

Erkek ve Dişi Sıçanlarda Pelvik Otonom Ganglia ve İlişkili Sinirlerin Diseksiyonu

Kardiyak otonom sinir sistemindeki patofizyolojik değişiklikler, özellikle sempatik branşında, ventriküler aritmilerin başlamasına ve korunmasına katkıda bulunur. Mevcut protokolde, alttaki moleküler ve hücresel süreçlerin anlaşılmasını geliştirmek için murine stellat gangliyonunun nasıl karakterize edilir olduğunu gösteriyoruz.

Murine Stellate Ganglion'un Yeri, Diseksiyonu ve Analizi

Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.

Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

Bu protokol, superior servikal ganglionu tanımlayarak ve rezeke ederek adrenerjik innervasyonun ablasyonunun bir fare modelini tanımlamaktadır.

Bir Murin Modelinde Superior Servikal Ganglionektomi için Cerrahi Teknik

Öğrenin, embriyonik sıçan üst servikal ganglionlarından sempatik nöronların izolasyonu ve kültürü için detaylı protokolleri. Bu yöntem morfolojik ve proteomik analizlerde sinir gelişimi araştırmalarına katkı sağlar.

Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing

Daha fazla video keşfet