Name: X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin, X-ray kristalografi kullanarak Thermotoga maritima M42 aminopeptidaz TmPep1050'un dimer-dodekamer geçişini nasıl incelersiniz. Bu yöntem, oligomerizasyona bağlı aktiviteleri olan proteinleri çalışmak için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Martine Roovers'a bu yazıyı doğruldurda ve yapıcı yorumlar da yaptığı için teşekkür ederiz. Proxima 2 beamline 'a (SOLEIL senkrotron) erişim Blok Ayırma Grupları 20151139 içinde ydi.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan protokol, TmPep1050'nin yapısal düzeydeki dimer-dodecamer geçişini anlamanızı sağlar. Metodoloji daha önce hem TmPep1050 oligomers11yapısını belirlemek için deneyimli oldu. En zorlu adım, dodecamer'ların istikrarlı dimers'a dönüşmesini teşvik eden koşulları bulmaktı. Bu tür koşullar metal iyon kofaktör eklendiğinde dimers dodecamers içine yeniden birliğini izin vermek için yeterince hafif olması gerekiyordu. Yapısal çalışmaları ve daha fazla biyokimyasal karakterizasyonu (örneğin,...

Oligomerizasyon birçok proteinin biyolojik fonksiyonlarını belirleyen baskın bir süreçtir. Escherichia coli'deproteinlerin sadece %35'inin monomerik1olduğu tahmin edilmektedir. Morfin adı verilen bazı proteinler, her oligomerik durumda farklı bir yapıya sahip alt birimlere sahip birkaç oligomerik durumu bile benimseyebilir2. Onların oligomerik durumları arasındaki geçiş genellikle her oligomerik devlet farklı bir özel aktivite veya fonksiyon olabilir gibi protein aktivitesini düzenlemek için bir ortalamadır. Çeşitli morfin örnekleri literatürde iyi belgelenmiştir, özellikle porfobilinojen synthase3, HPr kiazaz /fosfataz4, Lon proteaz5, laktat dehidrogenaz6, gliserindehit-3-fosfat dehidrogenaz7, piruvat kiaz8, sitrat synthase9, veribonu10. Son zamanlarda, m42 aminopeptidaz TmPep1050, olan aktivitesi oligomerik devletlere bağlıdır morfin benzeri davranış, enzim başka bir örnek açıklanan11. Oligomerik durumları arasındaki geçiş, alt birimlerin çeşitli yapısal değişikliklerine neden olan metalik kofaktörleri tarafından aracılık edilir.
M42 aminopeptidaz ailesi MH klan12aittir ,13, ve yaygın Bakteri ve Archaea arasında dağıtılır14. M42 aminopeptidazlar, peptidleri 35 amino asit kalıntısına kadar bozan gerçek dinükleer enzimlerdir15. Aktif alanları bir iç kaviteye doğru yönlendirilmiş 12 alt birimden oluşan, tetrahedron şeklinde tuhaf bir yapı benimserler. Böyle bir düzenleme genellikle kontrolsüz proteoziz önlemek için aktivitenin nano-bölümleme olarak tanımlanır. M42 aminopeptidazların fizyolojik fonksiyonu proteozom ile ilişkili olabilir, protein yıkımı sonucu peptidler hidrolize16,17. Pyrococcus horikoshii dört M42 aminopeptidaz, her farklı ama tamamlayıcı özellikleri18sunan sahip,19,20,21. Tekil olarak, alt birimlerin iki farklı türde yapılan heterokompleksler P. horikoshiitarif edilmiştir , peptidasome kompleksleri varlığını düşündüren22,23.
M42 aminopeptidazların çeşitli yapıları literatürde tanımlanmıştır11,16,18,19,20,24,25,26. Alt birim iki farklı etki alanı, bir katalitik etki alanı ve bir dimerization etki alanından oluşur. Katalitik etki alanı tüm MH klan korunmuş ortak bir α / β kat benimser, archetypal katalitik etki Vibrio proteolyticus aminopeptidaz Ap1 vibrio proteolyticus27olmak. Dimerization etki alanı bir PDZ benzeri kat16 benimser ve olabilir, oliomerizasyon rolüne ek olarak, substrat erişim kontrol ve iç boşluğunda bağlama bir rol11. Temel yapı taşı bir dimer olduğu için, dodecamer genellikle altı dimer ilişkisi olarak tanımlanır, her dimer tetrahedron16her kenarında konumlandırılmış olmak. M42 aminopeptidazlarının oliomerizasyonu metal kofaktörlerinin bulunabilirliğine dayanır. Divalent metal iyonları, genellikle Zn2 + ve Co2+,katalitik peptit bağlama ve hidroliz katılır. Onlar iki ayrı bağlama siteleri, yani M1 ve M2 siteleri bulunur. İki metal iyonları da sürücü ve ince PhTET2, PhTET3, PfTET3 ve TmPep105011,24,28,29için gösterildiği gibi oligomerizasyon ayarlayın. Metal kofaktörtü tükendiğinde, dodecamer PhTET2, PhTET3 ve TmPep105011,16,28,hatta monomerler gibi dimers içine demonte, PhTET2 ve PfTET324,29gibi .
Burada sunulan TmPep1050 oligomerlerin yapılarını incelemek için kullanılan bir protokoldür. Bu protokol protein saflaştırma, proteolitik aktivite taraması, kristalizasyon, X-ışını kırınımı ve moleküler replasman gibi ortak yöntemler kümesidir. Metalloenzimlerle başa çıkmanın getirdiği incelikler, protein oligomerizasyonu, protein kristalizasyonu ve moleküler replasman vurgulanır. TmPep1050 dodecamers daha monomerler içine ayrıştırmak ya da olmadığını göstermek için bir çalışma olgusu da sunulmaktadır. Bu soruyu gidermek için, bir TmPep1050 varyantı, TmPep1050H60A H307A, olan metal bağlama siteleri Ala kalıntılar His-60 (M2 site) ve His-307 (M1 site) mutasyona uğratarak bozulur çalışılmıştır. Bu protokol, morfin benzeri davranışlı diğer M42 aminopeptidazları veya metalloenzimleri incelemek için uygun olabilir.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml Santrifüj Filtreler Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 Santrifüj Filtreler Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz Nükleaz</td><td>Merck Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>N/A</td><td></td><td>ziyaret et http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr> <tr><td>cOmplete EDTA içermez</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>N/A</td><td></td><td>ziyaret https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>Kristal Ekran I</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Ekran II</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Yeşil PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal 15 kuyulu alet</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli PPY suşu</td><td>N/A</td><td></td><td>referansa bakın</td></tr><tr><td>31 Escherichia coli XL1 mavi suş</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Jel Filtrasyon Kalibrasyon Kiti HMW</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>Jel Filtrasyon Kalibrasyon Kiti LMW</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>Jel Filtrasyon Standardı</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plazmid Miniprep Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Endeksi</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-lösin-p-nitroanilid</td><td>Bachem AG</td><td></td><td></td>40010720025</tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Neggia eklentisi</td><td>Dectris</td><td>Yok</td><td>ziyareti https://www.dectris.com/</td></tr> <tr><td>NeXtal Tüpler JCSG Çekirdek Süit I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tüpler JCSG Çekirdek Süit II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tüpler JCSG Çekirdek Süit III</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tüpler JCSG Çekirdek Süit IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>N/A</td><td></td><td>ziyareti https://www.phenix-online.org/</td></tr> <tr><td>Phusion Yüksek Kaliteli DNA polimeraz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Tuz RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Tuz RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Diyaliz Tüpü, 3.5K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Kaynak 15Phe</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>Kaynak 15Q</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 hazırlık sınıfı</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8 suşu</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>DNASU Plazmid Deposu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XDS</td><td>N/A</td><td></td><td>ziyareti http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr> <tr><td>xdsme</td><td>N/A</td><td></td><td>ziyareti https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

x-ray kristalografi thermotoga maritima m42 aminopeptidaz tmpep1050 oligomerik devlet geçiş Çalışma

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

M42 aminopeptidazlar 12 alt birimden oluşan fonksiyonel olarak aktif kompleksler oluştururlar. Montaj süreci, dimer-dodecamer geçişini tetikleyen metal iyon kofaktörleri tarafından düzenleniyor gibi görünüyor. Metal iyon bağlama üzerine, aktif sitede ve etkileşim arabiriminde çeşitli yapısal değişiklikler meydana gelir ve dimerleri kendi kendini birleştirmeyi teşvik etmek için şekillendirir. Bu tür değişiklikleri gözlemlemek için, kararlı oligomerler yapısal çalışma dan önce izole edilmelidir. Burada bildirilen tmPep1050 kararlı dodecamers ve dimers arınma sağlayan bir yöntemdir, T. maritimabir M42 aminopeptidaz , ve X-ışını kristalografisi ile yapı tayini. Dimers bir şelat ajanı ile metal iyonları kaldırarak dodecamers hazırlanmıştır. Onların cofactor olmadan, dodecamers daha az kararlı oldu ve tamamen ısıtma üzerine ayrıştı. Oligomerik yapılar basit moleküler değiştirme yaklaşımı ile çözüldü. Metodolojiyi göstermek için, metal iyon bağlama da tamamen bozulmuş bir TmPep1050 varyantının yapısı, monomerler için dimerlerin daha fazla dökümünü göstermeden sunulmuştur.

TmPep1050 monomerler içine olası bir dodecamer dissociation çalışma için, His-60 ve His-307 kodonlar sentetik bir gen kullanılarak alanin kodon ile değiştirildi. Bu gen daha sonra ifade ve daha sonra TmPep1050H60A H307Aadlı ilgili TmPep1050 varyantı saflaştırma için pBAD vektörklonlandı. Boyut dışlama kromatografisi(Şekil 3B)saflaştırılmış proteinin 56 kDa (monomerin molekül ağırlığı 36.0 kDa) belirgin bir molekül ağırlığına sahip olduğunu göstermiştir. Benzer bir görünür molekül ...

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Bu protokol, aminopeptidazların farklı oligomerik durumları ve inaktif dimers ve aktif dodecamers arasında dengeli oligomerizasyona bağımlı aktivitelerile incelenmesini kolaylaştırır. Bu geleneksel teknik herhangi bir laboratuvarda kolayca yapılabilir. Ve bir ışın hattı veya x-ışını kristalografi sağlama tesisi gerektiren bir yana, özel cihazlar gerektirmez.Bazı adaptasyon ile, bu yöntem oliomerizasyon derecesine bağlı bir aktivite veya fonksiyon ile başka bir protein uygulanabilir. X-ışını verilerini işlemek için, kullanıcıların kristalografi konusunda en az bilgiye sahip olması gerekir. Kullanıcıları eğitimleri takip etmeye, XDS Wiki'yi ziyaret etmeye ve Phenix eğitimlerini izlemeye davet ediyoruz.Bir aktivite tahlil yapmak için, 50 milimolar MOPS 965 mikrolitre 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide 25 mikrolitre ekleyin, 250 mikromolar kobalt iki klorür ve 10%metanol Pre ek MOPS ile bir mikromolar konsantrasyonu son enzim seyreltmeden önce, 75 santigrat derece kuru banyo reaksiyon karışımı inkümed. Daha sonra, reaksiyon karışımına bir mikromolar enzimin 10 mikrolitresini ekleyin ve reaksiyonu bir saatten fazla süreyle 75 santigrat derecekuru banyoya geri döndürmeden önce ortaya çıkan

x-ray-crystallography-to-study-oligomeric-state-transition-thermotoga

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Bu makalede, protein ifade, arıtma, kristalizasyon ve yapı tayini N-terminal etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve (Plutella xylostella) üzerinden iletişim kuralları açıklar.

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Burada, EMBL Grenoble'daki HTX Laboratuvarı'nda KristalDirekt teknolojisine dayalı proteinden yapıya, hızlı ligand-protein kompleksi analizi ve büyük ölçekli parça taraması için otomatik makromoleküler kristalografi boru hatlarının nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Öğrenin, X-ray kristalografi kullanarak Thermotoga maritima M42 aminopeptidaz TmPep1050'un dimer-dodekamer geçişini nasıl incelersiniz. Bu yöntem, oligomerizasyona bağlı aktiviteleri olan proteinleri çalışmak için uyarlanabilir.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Daha fazla video keşfet