Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Bitkisellerde bu protokol, E.coli'deki genetik devrelerin sürekli ölçümü ve devre performansını değerlendirmek için bireysel bakteri hücresinde sinyal değişkenliği ve sinyal-gürültü oranının hesaplanması. Bu tekniğin ana avantajları, farklı suşlara ve laboratuvarlara kolayca adapte edilebilen, minimum eğitim gerektiren ve özel ekipman gerektirmeyen ve nispeten ucuz olmasıdır. Gürültü, biyolojik sistemlerin işlevselliğinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar.

Şu anda, büyük ölçekli gen devreleri inşa etmek için bir ilgi vardır. Bu sistemler gürültü ile engellenebilir Numuneleri iyice kurutacağından, bu soğuk pedleri mümkün olduğunca dört santigrat derecede tuttuğundan ve parçaları sabırla ve nazikçe kesip böldüğünden emin olun. Bakterileri analize hazırlamak için transfected E.coli kültüründen tek bir koloniyi aşılar.

Örneğin, GFP muhabiri olan bir devre. Beş mililitre LB suyu içeren bir cam tüpte ilgili antibiyotiklerle takviye edin. Et suyu bulanık olana kadar iki saat boyunca titreyen bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde büyütün.

Kuluçkanın sonunda, iki mililitrelik bir mini mikro santrifüjde bir mililitre seyreltme çözeltisini aşağı çevirin ve 30 mikrolitre bakteriyi ve tüm seyreltme çözeltisini yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, bu süspansiyonun 40 ila 60 mikrolitresini M9 kültür plakalarına tohumlamadan önce sallama ile kültürü bir saat kuluçkaya yatırın. Bakterileri analize hazırlamak için, transfected E.Coli kültüründen tek bir koloni aşıla.

Örneğin, ilgili antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB suyu içeren bir cam tüpte GFP muhabiri olan bir devre. Et suyu bulanık olana kadar iki saat boyunca titreyen bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde büyütün. Kuluçkanın sonunda, iki mililitrelik bir mini mikro santrifüj tüpünde bir mililitre seyreltme çözeltisini aşağı çevirin ve 30 mikrolitre bakteri ve tüm seyreltme çözeltisi hacmini yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın.

Sonra kültürü sallanarak bir saat kuluçkaya yatırın. Mikroskop plakaları hazırlamak için, 112,5 miligram düşük erimeli agar ile 40 miligram agar ve 25 mililitre Erlenmeyer şişesinde bir mililitre% 2 casamino asit karıştırın. Daha sonra, 25 mililitrelik bir Errlenmeye şişesinin iç dudaklarına 8,92 mililitre minimum ortam ekleyin ve elde eden çözeltiyi kısaca, iki ila üç saniyelik patlamalarla mikrodalgaya koyun.

Sonra su banyoyu 55 santigrat dereceye ayarlayın. Çözelti açık olduğunda, 25 mililitre Erlenmeyer şişesini 60 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin ve agar çözeltisinin sıcaklığı yaklaşık 45 ila 50 santigrat dereceye düşene kadar soğumasını bekleyin. Agar soğurken, laboratuvar tezgahını% 70 etanol ile temizleyin ve temizlenen tezgaha bir laboratuvar bandı parçası pürüzsüzleştirin.

Bant üzerine bir cam kapak kayması yerleştirin ve yakınına ikinci bir kapak kayması yerleştirin. Uygun antibiyotiklere ve çözeltiye soğutulmuş agar çözeltisi ekleyin. Bant üzerine yerleştirilen kapak kaymasına 1,5 mililitre taze hazırlanmış jel çözeltisi dökün ve kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek ikinci kapak kaymasını jel üzerine yerleştirin.

Erlenmeyer'i sıcak su banyosuna geri verin ve kapak kaymalarını 20 dakika örtün. Kapak kaymalarını dört santigrat derecede bir saatlik kuluçka için çevirin. Kuluçkanın sonunda, kapak kaymalarını kuru jelden çıkarın ve agarosedan küçük bir ped kesin.

Kuluçka sırasında, hazırlanan bakteri süspansiyonunun altı mikrolitre damlasını 35 milimetrelik bir kabın içine ekleyin ve damlaların en az 15 ila 30 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra pedi bir seferde bir bakteri damlasına dikkatlice yerleştirin ve numunelerin oda sıcaklığında 20 dakika ayarlamasına izin verin. Agar yatağını numuneyi bulaştırmadan yerleştirmek için, soğuk pedi hafifçe dokunarak damlacık üzerine dikkatlice yerleştirin.

Numuneleri görüntülemek için şişeyi sudan çıkarın ve jel çözeltisinin vücut sıcaklığına soğumasını bekleyin. Jelin üç milimetresini numune plakasının çevresine dökün. Agarose katılaştırıldığında, plakayı bantla kapatın ve bant içine birkaç delik açmak için 25 kalibrelik bir iğne kullanın.

Daha sonra, hücre mitozını önlerken agaroseun tamamen katılaşmasını sağlamak için plakayı en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede baş aşağı yerleştirin. 24 saat içinde, numuneyi en düşük büyütmede bulmak ve mikroskobun otomatik odak sistemini meşgul etmek için floresan konfokal mikroskop kullanın. Uygun hedefe yağ uygulayın ve yağı dikkatlice yaymak için plakayı hareket ettirmek için platform denetleyicisini kullanın.

Ardından otomatik odağı yeniden devreye sokun ve örneği görüntülemek için Z adım kesitleri için varsayılan öneriyi izleyin. E.coli, beyaz bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekiller olarak görünmelidir. Ve parlaklığın dinamik aralığı merkezinde bir artış göstermelidir.

Mitoz olayları ilk olarak 30 dakika sonra floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Tek tek hücrelerin düşük büyütmede tespit edilmesi zor olsa da. Yanlış seyreltme oranında hazırlanan bakteri hücre kültürleri değişmeyen hücre sayısını gösterebilir ve plaka sızdırmazlık olmadan hazırlanan numuneler aşırı büzülme gösterebilir ve bu da odaklanma kaybına neden olabilir.

Hücreler ayrıca besin arayışlarında jeli girintileyebilir, bu da bakteri hücrelerinin üst üste istiflenmesine ve hücre monolayerinin tehlikeye atarak hücre algılamasını ve güvenilir floresan sinyal ölçümünü etkili bir şekilde önleyebilir. Bu veriler tarafından önerildikçe, farklı alan aralıkları aynı eğilimi gösterdiğinden, bölme döngüsündeki hücre aşaması gürültü düzeyini etkilemez. Ayrıca, bu temsili verilerle gösterildiği gibi, GFP ve süper kat GFP arasında sinyal-gürültü oranında önemli bir değişiklik gözlenmez.

Bu işlemi gerçekleştirirken, deney için kullanılan bakteri suşu için doğru seyreltme oranını belirlemeye özen gösterin. Düzenlenmiş her devrenin sinyal-gürültü oranını bu taban hattıyla karşılaştırmak, en iyi performans devresinin seçilmesini sağlar ve ilginç fenomenleri ortaya çıkarır