Name: Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Colide Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Keşfedin, zaman atlamalı mikroskopi ile Escherichia coli hücrelerinde sentetik gen devrelerinin biyolojik gürültüsünü sürekli ölçme yöntemini. Sinyal değişkenliği ve sinyal-gürültü oranı hesaplayarak devre performansını değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Matlab koduna yardımcı olduğu için Bay Gil Gelbert'e (Elektrik Mühendisliği Fakültesi, Technion) teşekkür ederiz. Dr. Ximing Li'ye (Technion Biyo-Tıp Mühendisliği Fakültesi) bu makalenin kanıtlanmasına yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Neubauer Aile Vakfı ve İsrail Bilim Bakanlığı tarafından kısmen desteklendi, grant 2027345.

1. Medya ve kültür hazırlığı
<ol><li>1.000x Karbenisilin (50 mg/mL) veya ilgili antibiyotik stok çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>. 0,5 g karbenisilin ağırlığında. 10 mL steril H2O ekleyin.</li>
		<li>Karbenisilin stoğunu 0,22 μm şırınna filtresi ile sterilize edin. Antibiyotik çözeltisini aliquot ve -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lysogeny et suyu (LB) plakaları hazırlamak için, 5 g tripto, 5 g NaCl, 2,5 g maya özü ve 7,5 g Bacto agar'ı 0,5 L steril H2O ile karıştırın.<ol>
<li>Erimiş jel karışımını 50 °C'lik bir su banyosuna kısmen batırın. 1.000 μL karbenisilin (50 mg/mL) ekleyin.</li>
		<li>Petri yemeklerini steril bir ortamda hazırlayın. Tabakları buzdolabında saklamadan önce ayarlamak için bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>M9 minimal ortam için aşağıdakilerin ayrı stok çözümlerini hazırlayın: 5x M9 tuzları (56,4 g/L), 2 M glikoz ve% 2 biyotin içermeyen casamino asitleri. Çözümleri 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.</li>
	<li>5 Petri plakası hazırlamak için, 1125 mg düşük eriyen agar ve 400 mg agar'ı 89,2 mL minimum ortamla (1x M9) karıştırın. 250 mL Erlenmeyer şişeye %2 casamino asitlerinin 10 mL'sini (%2 [vol/vol]) ekleyin. NOT: Ortamı şişenin iç dudaklarına döktüklerinden emin olun.</li>
	<li>Çözeltiyi 3 ila 4 saniyelik kısa aralıklarla mikrodalgaya koyun. Çözüm net olana kadar tekrarlayın. NOT: Kaynama noktasına ulaşmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Difüzyonla daha fazla karıştırmak için 250 mL Erlenmeyer şişesini sıcak bir su banyosuna (60 °C) yerleştirin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar soğumaya bırakın.</li>
	<li>Plaka döken bankta alevi yak.</li>
	<li>Tüm çözümleri aşağıdaki sırayla hızla ekleyin: %50 gliserol 800 μL (%0,4 [vol/vol]) 100 μL tiamin (B1) 1100 μL Glikoz (2M) 100 μL Karbenisilin (50 mg/mL).</li>
	<li>Agar boyunca tüm bileşenlerin eşit dağılımını sağlamak için Erlenmeyer şişesini döndürün.</li>
	<li>Alevin yanında her seferinde bir tabak açın ve dökülmeye başlayın.<ol>
<li>Plakaları ilk katılaşmaya kadar birkaç dakika tezgahta bırakın.</li>
		<li>Su yoğuşmasının jel üzerine damlamasını önlemek için plakaları ters çevirin.</li>
		<li>Tabakları oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat katılaşmak üzere bırakın.</li>
		<li>Plakalar katılaştıktan ve kuruduktan sonra, yaklaşık 3 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bakteri suşları ve plazmidler yapımı
NOT: Genetik devre bir bölüm içerir; bir PtetO promotörü tarafından yönlendirilen ve constitutive ifade ile sonuçlanan bir Yeşil Floresan Protein (GFP). Bu çalışmadaki tüm plazmidler temel moleküler klonlama teknikleri kullanılarak inşa edildi ve standart bir ısı şoku protokolü 24 kullanılarak Escherichia coli 10β'yedönüştürüldü. Son yapı, test için Escherichia coli MG1655 vahşi tip suşuna dönüştürüldü.
<ol><li>Standart ısı şoku protokolü24ile istenen plazmidi Escherichia coli MG1655 hücrelerine dönüştürün.</li>
	<li>Dönüştürülmüş hücreleri 37°C'de bir LB agar plakasında bir gecede büyütün. NOT: Petri yemeklerini mikroskopi kullanımı için 2,2 adımdan 3 güne kadar saklamak mümkündür.</li>
	<li>Tek bir koloniyi cam bir tüpte ilgili antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL LB suyuna aşıla.</li>
	<li>Sıvı bulanık olana kadar 2 saat boyunca inkübatörde 250 rpm sallama hızı ile 37 °C'de hücreleri büyütün.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi 1 mL seyreltme çözeltisi hazırlayın: 892 μL minimum ortam (1x M9) %50 gliserol 8 μL (%0,4 [vol/vol]) %2 Casamino asitlerinin 100 μL'si (%0,2 [wt/vol]) 1 μL tiamin (B1) 11 μL Glikoz (2 M) 1 μL ilgili antibiyotik<ol>
<li>Karıştırın ve aşağı çevirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1000 μL seyreltme çözeltisine (adım 2.5) 30 μL Escherichia coli büyümesi ekleyerek hücre kültürünü (1:30) adım 2.4'ten 2 mL tüpe seyreltin.</li>
	<li>Tüpü 37 °C'de sallama (250 rpm) ile 1 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Adım 1.10'da hazırlanan M9 plakalarda 40 μL - 60 μL büyüyün. Plakayı gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Kaplama için Optik Yoğunluk (OD600nm)0,1 civarında olmalıdır.</li>
	<li>Tezgaha en fazla üç 35 mm cam alt plaka yerleştirin. NOT: Plakanın camının kullanılan mikroskop lensleri için doğru kalınlıkta olduğundan emin olun.</li>
	<li>Jel plakalarda tohumlama için kültürü hazırlayın, adım 2.9 mikroskop ölçümlerinde hazırlanan plakadan koloniler için 2.3 ila 2.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Üç mikroskop plakası yapmak için aşağıdaki çözümü hazırlayın.<ol>
<li>Su banyoyu önceden 60 °C'ye ısıtın.</li>
		<li>112,5 mg düşük eritme agar ve 40 mg agar'ı 8,92 mL minimum ortamla (1x M9) karıştırın ve 25 mL Erlenmeyer şişesinde% 2 casamino asitlerinin (% 0,2 [vol/vol]) 1 mL'sini ekleyin. NOT: Ortamı şişenin iç dudaklarına döktüklerinden emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözeltiyi 2 ila 3 saniyelik kısa aralıklarla mikrodalgaya koyun. Çözüm net olana kadar tekrarlayın. NOT: Kaynama noktasına ulaşmamaya dikkat edin.</li>
	<li>25 mL Erlenmeyer şişesini difüzyonla daha fazla karıştırmak için sıcak su banyosuna (60 °C) yerleştirin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar bankta soğumaya bırakın.</li>
</ol>3. Agarose pedlerinin hazırlanması
<ol><li>% 70 etanol ile temiz tezgah. Temizlenmiş bankta bant ger. Bandın pürüzsüz ve düz olduğundan emin olun.</li>
	<li>İki kapak hazırlayın: biri bantta ve ikincisi yakınlarda. Bir kapak hazırlayın.</li>
	<li>Şişeyi (adım 2.14'te hazırlanan) su banyosundan çıkarın, şişenin dışını temizleyin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar soğumaya bırakın.</li>
	<li>Jel çözümünü yapmak için, tüm çözümleri aşağıdaki sırayla hızlı bir şekilde karıştırın: %50 gliserol 80 μL (%0,4 [vol/vol]) %2 casamino asitlerinin 1 mL'si (%0,2 [wt/vol]) 10 μL tiamin (B1) 110 μL glikoz (2 M) 10 μL ilgili antibiyotik.</li>
	<li>Jelin 1,5 mL'lik kısmını kapak kapağına dökün ve ikinci parça ile "sandviç" yaparak örtün.</li>
	<li>Erlenmeyer'i sıcak su banyosuna geri verin. Sandviçi kapakla örtün ve zamanlayıcıyı 20 dakika ayarlayın.</li>
	<li>Aynı zamanda, tüpü 37 °C'de 1 saat boyunca 2.11 adımından sallanarak kuluçkaya yatırın (250 rpm)</li>
	<li>20 dakika sonra sandviçi çevirin (adım 3.5), örtün ve 1 saat dinlenmeye bırakın. NOT: Daha iyi sonuçlar için "sandviçi" adım 3.8 süresince 4 °C'de dinlenmeye bırakın.</li>
	<li>Tohum Escherichia coli kültürü adım 3.7 örnek pipetleme ile 35 mm çanak. NOT: Ayrı küçük damlalar olarak 6 μL hücre pipetleme en iyi sonuçları verir.</li>
	<li>Damlaların en az 15 dakika ve 30 dakikaya kadar kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Kapak kapağını kaydırarak sandviçin katılaşmış jelini adım 3.8'den itibaren ortaya çıkarın.</li>
	<li>Sandviçi biyopsi zımbası veya ucu ile küçük bireysel pedler halinde kesin.</li>
	<li>Numuneye hafifçe yaslayın (adım 3.9). Yemeği bankta 20 dakika bekletin.</li>
</ol>4. Numunenin mikroskopi görüntüleme için hazırlanması
<ol><li>Matarayı su banyosundan adım 3.6'dan çıkarın. Şişenin dışını temizleyin ve oda sıcaklığına (25 °C) soğumaya bırakın. NOT: Zamanlayıcı bitmeden yaklaşık 3 dakika önce 4.1.</li>
	<li>Jelin 3 mL'lik kısmını dairesel bir hareketle plaka çevresine sürekli olarak dökün. Birkaç dakika katılaşmaya bırakın.</li>
	<li>Plakaları bantla kapatın ve 25 G iğne ile birkaç delik delin. Jel üzerine su yoğuşmasını önlemek için tüm bulaşıkları çevirin.</li>
	<li>Hücre mitozini önlerken tam katılaşmaya izin vermek için tüm bulaşıkları 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Art arda ölçümler için numuneleri en fazla bir gün olmak üzere 4 °C'de bırakın.</li>
	<li>Üretici başına mikroskobu başlatın yönergeleri.</li>
	<li>En düşük amplifikasyon lensini kullanarak ilk odağı bulun ve otomatik odak sistemini (AFS) devreye sokun.</li>
	<li>Gerekirse yağ kullanın, lensi yağ ile boğun ve plakayı bir platform denetleyicisiyle (manuel olarak değil) hareket ettirerek dikkatlice yayın ve AFS tekrar devreye sokabilir.</li>
	<li>Z adım kesitleri için varsayılan öneriyi izleyerek Z yönünde göreli kesit kullanın. NOT: Her 5 dakikada bir parlak alan görüntüleri ve 20 dakikada bir floresan görüntüler çektik. Bazen odağın ilk 30 dakika boyunca ayarlanması gerekir. Mikroskop inkübatör kutusunu ve yağı önceden ısıtmak, numuneyi soğutmak ise ilk odak kaybını azaltmaya yardımcı olma eğilimindedir.</li>
</ol>5. Veri analizi
NOT: Mikroskopi verilerini işlemek için MATLAB'da bilgisayar tabanlı bir yazılım tasarladık. Bu yazılım, parlak alan tiff görüntülerinden ve segmentlerinden hücre sınırlarının tanımlanmasını kolaylaştırır ve hücreleri alana göre sıralar. Bu görüntü analizinin çıktısı, hücre yoğunluğu seviyelerini türetmek ve mikroskop çözünürlük sınırları nedeniyle hücre halesi gibi floresan etki alanındaki yapıtları iptal etmek için floresan tiff görüntülerinde maske olarak kullanılabilir. Geliştirilen yazılım benzer çalışmalardan esinlenmiştir7,25,26,27,28,29,30 ve laboratuvar için özel zarif bir çözüm sağlar.
<ol><li>İlk olarak, main_code.maşağıdaki parametreleri tanımlayın.<ol>
<li>Edinme görüntülerinin klasörünü tanımlayın.</li>
		<li>Görüntü süresi süresini tanımlayın - parlak alan kanalı zaman adımı dakika olarak.</li>
		<li>GFP sıklığını tanımlayın - GFP görüntülerinin alım oranı.</li>
		<li>Mikroskop çözünürlüğünü tanımlayın (yani, kaç pikselin 1 μm'ye eşit olduğu).</li>
		<li>Histogram kutusu aralığını tanımla - hücre alanı aralığı. NOT: Verilerin hücre alanına göre sınıflandırılması işlemi, akış sitometrisi veri analizinde gating ilkelerine benzer. Kapılar, bu ilgi popülasyonlarını izole etmek ve ölçmek için genellikle ileri dağınık ve yan dağınık ortak özelliklere sahip hücre popülasyonlarının etrafına yerleştirilir. Mikroskopi, birkaç hücre grubuna geçit, araştırma ve ölçme sağlar.</li>
		<li>Konilüs çekirdeğini tanımla (3,3) - bu parametre hücre sınırlarını genel eşik(count_cells.m)ile algılar. NOT: Bu kurulum yalnızca laboratuvar veya mikroskobu değiştirirken gereklidir. Yazılım, giriş parlak alan kanalının c1 dizini, floresan kanalı c2 olarak etiketlenmesini gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diğer tüm komut dosyalarını otomatik olarak çalıştıracak main_code.m çalıştırın (count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>Program parlak alan görüntülerini otomatik olarak segmentlere ayırır (bkz. Ek Şekil 2-4).</li>
		<li>Hücre başına yoğunluk düzeyi ayıklamak için segmentasyon görüntüsünü floresan görüntü (GFP) ile birleştirin.</li>
		<li>Hücrelerin miktarının grafiğini zamana göre hesaplayın ve üstel büyümeye göre sığdırın.</li>
		<li>Her hücre alanı aralığı için ortalama ve standart sapmayı (STD) hesaplayın.</li>
		<li>Her hücre alanı aralığı için sinyali gürültü oranına (SNR) hesaplayın.</li>
		<li>Hücre miktarının yoğunluğa göre dağılımını çizin ve sığdırın.</li>
		<li>Varyans (CV) katsayısını hesaplayın ve akış çözümleyicisi verileriyle karşılaştırın. NOT: Yazılım, "klasörünüz/Segmentli" yeni bir klasördeki conv_kernel ayarlamak için son segmentasyon görüntülerini çıktı olarak verecektir. Yazılım, yeni bir klasördeki grafikleri çıktı olarak verecektir "klasörünüz/Grafikleriniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deneyler arasında karşılaştırma yapmak için compare_experiments.mkullanın.<ol>
<li>Kaydedilen grafikler için dizinler ve \CompareResult dizininin adresini tanımlayın.</li>
		<li>Dosyayı çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+analog+computation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li>
<li>Yang, X. S. Y., L, A. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang%2C+XSY+%22Imaging+Bacterial+Molecules%2C+Structures+and+Cells%22">Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells</a>. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).</li>
<li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedcentral+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li>
<li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li>
<li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li>
<li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li>
<li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li>
<li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li>
<li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+circuit+design+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPedraza%2C+JH+%22Science%22">Science</a>. , (2005).</li>
<li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li>
<li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li>
<li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanna%2C+HA+%22Cytomorphic+Electronics+with+Memristors+for+Modeling+Fundamental+Genetic+Circuits%22">Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits</a>. 4545, (2020).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li>
<li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li>
<li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States%22%5BJournal%5D)">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li>
<li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Ziel%2C+A+%22Noise+in+Measurements%22">Noise in Measurements</a>. , Wiley & Sons Inc. (1976).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Press%22">Cold Spring Harbor Laboratory Press</a>. , (1989).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+An+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li>
<li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStylianidou%2C+S+%22SuperSegger%3A+robust+image+segmentation%2C+analysis+and+lineage+tracking+of+bacterial+cells+-+Stylianidou+-+2016+-+Molecular+Microbiology%22">SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology</a>. , Wiley Online Library. (2016).</li>
<li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedcentral+System+Biology%22%5BJournal%5D)">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li>
<li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colicoords%3A+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li>
<li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bottom-up+approach+to+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li>
<li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li>
<li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+-+Biology+Science%22%5BJournal%5D)">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+Systems+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li>
<li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoille%2C+P+%22Morphological+Image+Analysis%3A+Principles+and+Applications%2C+Second+edition%22">Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition</a>. , (2000).</li>
<li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Graphics+Tools%22%5BJournal%5D)">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+distance+and+watershed+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Processing%22%5BJournal%5D)">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li>
<li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine%22%5BJournal%5D)">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li>
<li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+by+Numbers%22%5BJournal%5D)">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada, Escherichia coli canlı hücrelerinin bilgisayar izlemesini sağlayan, bir saat boyunca bölünme ve floresan seviyelerini takip eden bir protokol geliştirdik. Bu protokol, CV ve SNR'yi gerçek zamanlı olarak ölçerek Escherichia coli'deki genetik devrelerin stokastik dinamiklerini ölçmemizi sağlar. Bu protokolde şekil 10'dagösterildiği gibi iki farklı devrenin stokastik davranışlarını karşılaştırdık. Düşük kopya numaralarına sahip plazmidlerin stokastik etkilere daha yatkın oldu...

Sentetik biyoloji, son on yılda ortaya çıkan ve mühendislik tasarım ilkelerini rasyonel biyolojik tasarım 1 , 2,3, temel bilimi anlamak için canlı hücrelerde çok sinyalli entegrasyon ve işlemeyi sağlamak amacıyla 4,5, tanısal, terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar6,7,8,9,10'a çevirmeyi amaçlayan multidisipliner bir alandır. Sentetik gen devrelerinin giriş-çıkış tepkisini ölçme yeteneğimiz, otomatik zaman atlamalı mikroskopi11kullanılarak akış analizörü ve canlı hücre görüntüleme de dahil olmak üzere tek hücreli teknolojideki son gelişmelerle devrime uğradı. Bir akış analizörü genellikle bu devrelerin tepkisini sabit durumda ölçmek için kullanılır1,12ve ters mikroskopi, sentetik gen devrelerinin dinamik tepkisini tek bir hücre düzeyinde ölçmek için kullanılır3. Örneğin, sentetik biyolojideki ilk çalışmalardan biri, gecikmeli negatif geri bildirim döngüleri kullanılarak canlı hücrelerde genetik osilatör ağlarının inşasını içeriyordu3. Daha sonra, canlı hücrelerin dinamik ortamında metabolik kontrolü anlamak için genetik osilatör devreleri uygulandı4. Otomatik zaman atlamalı mikroskopi, bu tür devreleri karakterize etmek için bir yöntemdir. Konak hücrelerin, Escherichia coli, mikro koloniler oluştururken senkronize olduğunu, tam anne-kız ilişkilerini izlemeden sinyal ölçümüne ve gürültünün hesaplanmasına izin verdiğini vardır.
Gürültü, biyolojik sistemlerin genellikle birden fazla kaynaktan kaynaklanan temel, doğal bir yönüdür. Örneğin, proteinlerin difüzyonu gibi ayrık rastgele taşıyıcıların taşınmasından kaynaklanan sinyalleri içeren biyokimyasal reaksiyonları düşünün13. Bu sinyaller rastgele dalgalanmalarla yayılır14. Diğer gürültü kaynakları kaynak kullanılabilirliği, hücre bölünmesi ve sıcaklık, nem ve basınç gibi çevresel koşullardaki farklılıklardır. Sentetik gen devrelerinde yayılan biyolojik sinyaller genellikle gürültü oranına (SNR) çok düşük bir sinyale sahiptir ve bu da bu tür devrelerin performansını bozmaktadır. Bu nedenle, genetik devre tasarımı genetik mühendisliğinin en zorlu yönlerinden biri olmaya devam etmektedir15. Örneğin, yalnızca ortalama gen ekspresyonunun hesapladığı çoğu yaklaşımın aksine (tüm hücre popülasyonu üzerinden ölçülür), sentetik gen ağları aracılığıyla öngörülebilir davranışı tasarlamak için ölçülen sinyalin varyansı dikkate alınır12. Bu nedenle, protein ifadesindeki değişkenlik veya gürültü seviyeleri, analog ve dijital gen devrelerinin tasarımında ve performansında baskın bir rol oynar1,16,17.
Escherichia coli3,7,18dahil olmak üzere hücreden hücreye değişkenliği ölçmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle gen aktivasyonunu ve metabolik yolları incelemek için kullanılır, ancak özellikle bunun temel bir zorluk olduğu canlı hücrelerdeki genetik devreler için belirli gürültü kaynaklarını ölçmek ve dağıtmak gibi stokastik gürültü dinamiklerinin incelenmesine daha az odaklanarak19,20,21. Hem devrenin kendisine miras kalan (içsel) hem de konak hücrelerden (dışsal) türetilen çeşitli faktörler genetik devrelerin sürekli performansını bozabilir. Bu yazıda, içsel ve dışsal gürültü kaynakları da dahil olmak üzere Escherichia coli hücrelerindeki toplam gürültüyü ölçmeyi amaçlayan bir protokol geliştirdik6,22. Toplam gürültüyü ölçerek ve daha sonra SNR23'ü değerlendirerek gen devrelerinin tasarımı geliştirilebilir. Bu yöntem, birkaç floresanproteiniizleyerek bağımsız gürültü kaynaklarını ayrı ayrı ölçmek için değiştirilebilir 6,20. Burada açıklanan protokol için çevre koşullarını iyi kontrol altında tutuyor ve dış faktörlerin etkisi olmadan hücrelerin aktivitesini sürekli ölçüyoruz. Floresan proteinlerden gelen sinyali zaman içinde tek hücrelerde ölçtük ve aynı anda bir agarose substratı altında görüntüleyeceğiz. Elde edilen görüntüler laboratuvarın özel MATLAB'ı kullanılarak analiz edilir.
İdeal olarak, bir hücre içindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı aktivitesinin sürekli ölçümü, hücrelerin büyümesi ve bölünmesi yoluyla doğru veriler üretecektir. Ancak, bu tür verileri elde etmek zordur. Bunun nedeni, foto-ağartma7olarak bilinen floresan proteinlerin, heyecanlanma sürecinde radyasyona maruz kaldıklarında bozulmasıdır. Ayrıca, Escherichia coli hücreleri de fototoksiteye yol açabilecek heyecan için hassastır7. Her iki sorun da elde edilebilen fotoğraf karelerinin miktarını ve satın almalar arasındaki süreyi sınırlar. Görüntüleme sırasında hücreleri büyütmek için kullanılan substrat ve orta tipler (örneğin, lysogeny et suyu) da kritik bir role sahiptir. Floresan olmayan arka planı en aza indiren ve hücre bölünme süresini uzatan minimum ortam kullanmanızı öneririz.
Ayrıca, numunenin aşağıdaki gereksinimler göz önünde bulundurularak hazırlanması gerekir (1) Düşük hücre bölünme oranı, bölme döngüsünü yakından görüntülemek ve fototoksiklik ve fotobleaching olasılığını azaltmak için daha az sıklık pozlama sağlar. Edinme süresini öngörülen mitoz süresinin yaklaşık yarısına ayarladık (2) Deneyin başındaki düşük hücre yoğunluğu, bölünmenin daha iyi homojenliğini ve izlenebilirliğini sağlar. Hücre yoğunluğu, bu protokolün başarısı için önemli bir parametre olan ve her laboratuvar için belirlenmesi gereken Escherichia coli hücrelerinin seyreltme oranından etkilenir. Oranı belirlemek için, kullanılan her yeni Escherichia coli suşu veya ortamı büyüme hızı grafikleri ile donatılmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1). Hücreler yaklaşık600nm = 0.1 başlangıç yoğunluğundan kısa bir inkübasyondan sonra ek titreme olmadan büyüyebiliyorsa uygun bir oran elde edilmiştir. Bu aşamadaki hücreler sadece ortam sıcaklığına göre bölünür (3) Hücre hareketinin kısıtlanması: hücre hareketi güçlü bir şekilde substrat (agarose pad) sıkılığına bağlıdır. Substrat sıkılığı toplam agarose miktarına ve jel katılaşma süresine bağlıdır. Escherichia coli mitoz geçireceğinden, jeller oda sıcaklığında bir gecede katılaşmaya bırakılamaz. Substrat stabilitesini etkileyen diğer faktörler arasında numunedeki su miktarı ve nem sayar. Ek konular Temsilci Sonuçları 'nda ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Bu protokol birçok ayrıntı sağlar ve yavaş yavaş bir adımdan diğerine geçer. Protokol, görüntüleme deneyleri için uzun kararlılık sunar ve temel bir görüntü işleme aracı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop merceğine karşılık gelen</td> <td>35mm cam tabak</td><td>mattek</td><td>P35G-0.170-14-C</td> kalınlığı.</tr><tr><td>Agaroz&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>5004</td><td>LB hazırlama</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td>indükleyici</td></tr><tr><td>Bacto tripton&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson ve Şirketi&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB hazırlama</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>antibiyotik</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>antibiyotik</td></tr><tr><td>Casamino asitler&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson ve Şirketi&nbsp;</td><td>223050</td><td>minimal medya çözümü</td></tr><tr><td>eclipse Ti</td><td>nikon</td><td></td><td>ters mikroskop</td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>minimal medya çözümü</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>minimal medya substratı</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>4449600000000</td><td>daldırma yağı</td></tr><tr><td>M9 tuz çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>minimal medya çözümü</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB hazırlama</td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>minimal medya substratı</td></tr><tr><td>parafilm bant</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>metinde bant olarak anılır</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>minimal medya substratı</td></tr><tr><td>taymine B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376&nbsp;</td><td>MİNİMUM MEDYA ÇÖZÜMÜ</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>212750</td><td>LB hazırlık</td></tr></tbody></table>

zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak escherichia coli'de biyolojik gürültünün sürekli Ölçümü

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Burada geliştirilen protokol, Escherichia coli bölümünün ve floresan seviyelerinin birkaç saat boyunca bilgisayar takibini sağlamak için bir araç sunmaktadır. Süreç, sadece doğru plazmidi barındıran Escherichia coli'nin belirli koşullarda gelişebileceğini varsayarak, minimum medyada hayatta kalan kolonileri tarayarak başlar. Birçok DNA parçasının montajını gerektiren büyük genetik devreler oluşturma süreci zor olduğundan, devre bileşenleri genellikle birkaç antibiyotik kullanılmasını gerektiren farklı kopya numaralarında birden fazla plazmid arasında dağıtılır. Plazmiddeki mutasyonlar antibiyotik direnci genlerinin transkripsiyonunu yok edebilir ve nekroza yol açan hücredeki kaynak yönetimi ile kesişebilir. Seçilen koloni cam tabanlı bir Petri kabına ayarlanır ve hem parlak alanda hem de floresan etki alanlarında mikroskopi takibi için birkaç odak düzlemi seçilir. Protokol, düzenlenemeyen ilk koşullar altında görüntü odağını 12 saatten fazla tutar ve birkaç zorluk yaratır. Örneğin, ölü hücreler birkaç saatlik görüntülemeden sonra lenslerin odak alanında birikmeye başlar, bu da toksinlerin birikmesine ve sinyalin bulanıklaşmasına ve çürümesine neden olur. Besinlerin tükenmesi yeni metabolik süreçleri tanıtır ve devrenin istenen yanıtını engeller. Deneyin sıcaklığı indükleyicilerin ve antibiyotiklerin etkisini düşürür ve bu da sinyalin güvenilirliğine daha fazla zarar verebilir. Minimum ortam jeli küçülür ve kurur ve sonuç olarak optik odak zamanla değişir. Bu yöntemi geliştirdik Escherichia coliDiğer mikro organizmalar için benzer yöntemler geliştiren önceki çalışmalara benzer. Buna ek olarak, bu yöntem değişmemiş ve değiştirilmiş hücrelerdeki toplam stokastik gürültüyü ölçmek için bir algoritma sunar ve sonuçların benzer bir değişim katsayısı (CV) ile gösterildiği gibi akış analizörü tahminleri ile tutarlı olduğunu bulur.

Yazılım, beyaz ve siyah olmayan parlak alan adı görüntülerini analiz eder. Escherichia coli, beyaz olmayan bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekillere benzeyecek ve dinamik parlaklık aralığı merkezinde bir artış göstermelidir (Şekil 1). Floresan görüntülerde hücreler küçük bir haleye sahip olabilir, ancak dikdörtgen şekillere sahip bireysel hücreler hala çözülebilir. Bir mitoz olayı ilk olarak 30 dakika sonra tespit edilmelidir. Mikroskop odağı zaman içinde sabit kalmalıdır ve...

Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Bitkisellerde bu protokol, E.coli'deki genetik devrelerin sürekli ölçümü ve devre performansını değerlendirmek için bireysel bakteri hücresinde sinyal değişkenliği ve sinyal-gürültü oranının hesaplanması. Bu tekniğin ana avantajları, farklı suşlara ve laboratuvarlara kolayca adapte edilebilen, minimum eğitim gerektiren ve özel ekipman gerektirmeyen ve nispeten ucuz olmasıdır. Gürültü, biyolojik sistemlerin işlevselliğinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar.Şu anda, büyük ölçekli gen devreleri inşa etmek için bir ilgi vardır. Bu sistemler gürültü ile engellenebilir Numuneleri iyice kurutacağından, bu soğuk pedleri mümkün olduğunca dört santigrat derecede tuttuğundan ve parçaları sabırla ve nazikçe kesip böldüğünden emin olun. Bakterileri analize hazırlamak için transfected E.coli kültüründen tek bir koloniyi aşılar.Örneğin, GFP muhabiri olan bir devre. Beş mililitre LB suyu içeren bir cam tüpte ilgili antibiyotiklerle takviye edin. Et suyu bulanık olana kadar iki saat boyunca titreyen bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde büyütün.Kuluçkanın sonunda, iki mililitrelik bir mini mikro santrifüjde bir mililitre seyreltme çözeltisini aşağı çevirin ve 30 mikrolitre bakteriyi ve tüm seyreltme çözeltisini yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, bu süspansiyonun 40 ila 60 mikrolitresini M9 kültür plakalarına tohumlamadan önce sallama ile kültürü bir saat kuluçkaya yatırın. Bakterileri analize hazırlamak için, transfected E.Coli kültüründen tek bir koloni aşıla.Örneğin, ilgili antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB suyu içeren bir cam tüpte GFP muhabiri olan bir devre. Et suyu bulanık olana kadar iki saat boyunca titreyen bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde büyütün. Kuluçkanın sonunda, iki mililitrelik bir mini mikro santrifüj tüpünde bir mililitre seyreltme çözeltisini aşağı çevirin ve 30 mikrolitre bakteri ve tüm seyreltme çözeltisi hacmini yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın.Sonra kültürü sallanarak bir saat kuluçkaya yatırın. Mikroskop plakaları hazırlamak için, 112,5 miligram düşük erimeli agar ile 40 miligram agar ve 25 mililitre Erlenmeyer şişesinde bir mililitre% 2 casamino asit karıştırın. Daha sonra, 25 mililitrelik bir Errlenmeye şişesinin iç dudaklarına 8,92 mililitre minimum ortam ekleyin ve elde eden çözeltiyi kısaca, iki ila üç saniyelik patlamalarla mikrodalgaya koyun.Sonra su banyoyu 55 santigrat dereceye ayarlayın. Çözelti açık olduğunda, 25 mililitre Erlenmeyer şişesini 60 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin ve agar çözeltisinin sıcaklığı yaklaşık 45 ila 50 santigrat dereceye düşene kadar soğumasını bekleyin. Agar soğurken, laboratuvar tezgahını% 70 etanol ile temizleyin ve temizlenen tezgaha bir laboratuvar bandı parçası pürüzsüzleştirin.Bant üzerine bir cam kapak kayması yerleştirin ve yakınına ikinci bir kapak kayması yerleştirin. Uygun antibiyotiklere ve çözeltiye soğutulmuş agar çözeltisi ekleyin. Bant üzerine yerleştirilen kapak kaymasına 1,5 mililitre taze hazırlanmış jel çözeltisi dökün ve kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek ikinci kapak kaymasını jel üzerine yerleştirin.Erlenmeyer'i sıcak su banyosuna geri verin ve kapak kaymalarını 20 dakika örtün. Kapak kaymalarını dört santigrat derecede bir saatlik kuluçka için çevirin. Kuluçkanın sonunda, kapak kaymalarını kuru jelden çıkarın ve agarosedan küçük bir ped kesin.Kuluçka sırasında, hazırlanan bakteri süspansiyonunun altı mikrolitre damlasını 35 milimetrelik bir kabın içine ekleyin ve damlaların en az 15 ila 30 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra pedi bir seferde bir bakteri damlasına dikkatlice yerleştirin ve numunelerin oda sıcaklığında 20 dakika ayarlamasına izin verin. Agar yatağını numuneyi bulaştırmadan yerleştirmek için, soğuk pedi hafifçe dokunarak damlacık üzerine dikkatlice yerleştirin.Numuneleri görüntülemek için şişeyi sudan çıkarın ve jel çözeltisinin vücut sıcaklığına soğumasını bekleyin. Jelin üç milimetresini numune plakasının çevresine dökün. Agarose katılaştırıldığında, plakayı bantla kapatın ve bant içine birkaç delik açmak için 25 kalibrelik bir iğne kullanın.Daha sonra, hücre mitozını önlerken agaroseun tamamen katılaşmasını sağlamak için plakayı en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede baş aşağı yerleştirin. 24 saat içinde, numuneyi en düşük büyütmede bulmak ve mikroskobun otomatik odak sistemini meşgul etmek için floresan konfokal mikroskop kullanın. Uygun hedefe yağ uygulayın ve yağı dikkatlice yaymak için plakayı hareket ettirmek için platform denetleyicisini kullanın.Ardından otomatik odağı yeniden devreye sokun ve örneği görüntülemek için Z adım kesitleri için varsayılan öneriyi izleyin. E.coli, beyaz bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekiller olarak görünmelidir. Ve parlaklığın dinamik aralığı merkezinde bir artış göstermelidir.Mitoz olayları ilk olarak 30 dakika sonra floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Tek tek hücrelerin düşük büyütmede tespit edilmesi zor olsa da. Yanlış seyreltme oranında hazırlanan bakteri hücre kültürleri değişmeyen hücre sayısını gösterebilir ve plaka sızdırmazlık olmadan hazırlanan numuneler aşırı büzülme gösterebilir ve bu da odaklanma kaybına neden olabilir.Hücreler ayrıca besin arayışlarında jeli girintileyebilir, bu da bakteri hücrelerinin üst üste istiflenmesine ve hücre monolayerinin tehlikeye atarak hücre algılamasını ve güvenilir floresan sinyal ölçümünü etkili bir şekilde önleyebilir. Bu veriler tarafından önerildikçe, farklı alan aralıkları aynı eğilimi gösterdiğinden, bölme döngüsündeki hücre aşaması gürültü düzeyini etkilemez. Ayrıca, bu temsili verilerle gösterildiği gibi, GFP ve süper kat GFP arasında sinyal-gürültü oranında önemli bir değişiklik gözlenmez.Bu işlemi gerçekleştirirken, deney için kullanılan bakteri suşu için doğru seyreltme oranını belirlemeye özen gösterin. Düzenlenmiş her devrenin sinyal-gürültü oranını bu taban hattıyla karşılaştırmak, en iyi performans devresinin seçilmesini sağlar ve ilginç fenomenleri ortaya çıkarır

continuous-measurement-biological-noise-escherichia-coli-using-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus</emZaman atlamalı Microcinematography kullanarak> Biyofilmler

Kaynak: Valentine, M. E., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silme Mutantlarının Üretilmesi ve Basit Bir Fare Enfeksiyon Modelinde Virülans Zayıflaması Testi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, farelerde öldürücü ve zayıflatılmış bakteri suşlarının in vivo davranışını görselleştirmek ve karşılaştırmak için biyolüminesans kullanımını göstermektedir. Biyolüminesans bakteri süspansiyonlarının hazırlanmasını ve bunların farelere intraperitoneal enjeksiyonunu özetlemektedir. Öldürücü...

Biyolüminesans Kullanarak Farede Bakteriyel Enfeksiyon Dinamiklerini İzleme

Kaynak: Oms, T., ve diğerleri. Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, mikroakışkan bir sistem içinde floresan etiketli bir DNA bağlayıcı proteini eksprese eden bireysel bakteri hücrelerini izlemek için bir protokol sunar. Antibiyotiklerin çoğu hücreyi nasıl inhibe ettiğini, kalıcı hücrelerin bir alt popülasyonunun tedaviden sağ çıktığını ve antibiyotiğin çıkarılmasının ardından yeniden büyüdüğünü gösterir.

Bakterilerde Antibiyotik Kalıcılığını İncelemek için Mikroakışkan Hızlandırılmış Mikroskopi

Kaynak: Cabeen, M. T. ve diğerleri. Bacillus subtilis'in Tek Hücreli Mikrofluidik Analizi. J. Vis. Exp. (2018)Video, tek hücre düzeyinde bakteri büyümesini gözlemlemek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikro ölçekli hendeklerde hapsedilmiş hareketsiz bakteriyel hücrelerin sürekli olarak floresan mikroskobu altında nasıl görüntülendiğini ve beslendiğini gösteriyor. Bu kurulum, hücre bölünmesi ve soy takibinin birden fazla nesil boyunca gerçek zamanlı görselleştirilmesini...

Mikrofluidik bir sistemde tek hücre çözünürlüğünde bakteri büyümesini takip etmek

Kaynak: Chaimovitz, E. A. ve diğerleri. Escherichia coli'de biyolojik gürültünün zaman geçişli mikroskopiyle sürekli ölçümü. J. Vis. Exp. (2021)Bu video, bakteriyel büyüme ve bölünme sırasında GFP floresansındaki dalgalanmaları zaman geçişli mikroskopi kullanarak E. coli'de biyolojik gürültünün gerçek zamanlı görselleştirilmesini göstermektedir.

Bakterilerde Biyolojik Gürültünün Zaman Geçişli Mikroskopi Kullanılarak Sürekli İzlenmesi

Kaynak: Schumacher, D. ve Sogaard-Andersen, L. Yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus'un tam vejetatif hücre döngüsünün floresans canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, bakteriyel hücre bölünmesi sırasında floresan etiketli kromozom kökenlerini takip etmek için canlı hücre görüntüleme kullanımını göstermektedir. Kromozom ayrımcılığı dinamiklerini zaman geçişli faz kontrastı ve floresan mikroskopisi kullanarak yakalar.

Flüoresans Etiketli Bakterilerde Kromozom Ayrılmasının Zaman Kesmesi Görüntülemesi

Kaynak: Makowski, Ł. ve diğerleri. Bakteriyel Avcı Bdellovibrio bacteriovorus'un yaşam döngüsünün Zaman Geçişli Flüoresans Mikroskopisi kullanılarak canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Bdellovibrio bacteriovorus'un immobilize edilmiş E. coli'yi agaroz pedinin altında avladığı zaman geçişli floresan görüntülemeyi göstererek, bakteriyel predasyon ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için hücre içi çoğaltma ve soyut salınımının gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlıyor.

E. coli üzerinde Bdellovibrio bacteriovorus avlanmasının Canlı Hücre Zaman Geçişli Görüntülemesi

Bu makalede, biz bireysel Worms özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

Bu protokol, mRNA sentezi ve bozulmasının in vivo kinetiklerini ölçmek için yerinde hibridizasyonda (smFISH) tek moleküllü floresan uygulamasını açıklar.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Keşfedin, zaman atlamalı mikroskopi ile Escherichia coli hücrelerinde sentetik gen devrelerinin biyolojik gürültüsünü sürekli ölçme yöntemini. Sinyal değişkenliği ve sinyal-gürültü oranı hesaplayarak devre performansını değerlendirin.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Daha fazla video keşfet