Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları
29 Nisan 2020
Sunulan mikroveziküller ve ekzozomların etkili zenginleşmesi ve izolasyonu için kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için bir protokoldür.
Bu protokolde, hücre dışı veziküllerin izole edilmesinde etkili zenginleşme için tasarlanmış XO Pad adı verilen kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. XO Pad, geleneksel yöntemlere göre daha yüksek geri kazanım oranları gösterirken, herhangi bir kimyasal veya iş makinesi kullanmadan hücre dışı vezikülü önceden konsantre ve izole edebilen basit bir cihazdır. Yazıcı yazılımı ile yazdırılacak bölgeyi tanımlayarak başlayın.
Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak beş ila iki milimetre arasında daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahip olmalıdır. Daha sonra, selüloz kağıdın her iki tarafında belirlenen bölgelerüzerinde hidrofobik balmumu yazdırın. 120 santigrat derece 80 saniye boyunca bir laboratuvar fırınında balmumu baskılı kağıt yerleştirin, sonra bireysel XO Pad cihazlar yapmak için bir kesici ile balmumu baskılı kağıt kesti.
Perma seçici membran beş ve iki mikrolitre sol en ve sağ en katmanları, sırasıyla örnek alanlar üzerine bırakın. Perma seçici membran ile kodlanmış katmanları, çözücünün buharlaşması için 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerine yerleştirin. Daha sonra, tampon çözeltisi ile karşı karşıya kalan kaplamalı tabakanın en dış yüzeyini basınca duyarlı bantla kapatArak küçük bir delik bırakın.
Tüm örnek alanları yakınsak bağlamak için XO Pad cihazını beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlayın. Pipet 15 mikrolitre mikrolitre mikrovezi ve ekzozom numunesi yakınsak numune alanlarında ve tam ıslatma sağlamak için birkaç saniye bekleyin. XO Pad'in her iki ucuna iki akrilik oda yerleştirin ve açılmayı önlemek için küçük bağlayıcı klipslerle güvenli bir şekilde kenetleyin.
Odaları 0,1X PBS'nin 110 mikrolitresi ile doldurun ve iki gümüş elektrot takın. Daha sonra elektrotlara 20 dakika boyunca 30 volt uygulamak için bir akım gerilim kaynak ölçüm sistemi kullanın. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları izole etmek için katlanmış XO Pad'i akrilik bölmelerden ayırın ve diğer katmanlardan zenginleştirilmiş parçacıkları izole etmek için cihazı açın.
Mikroveziküllerin ve ekzozomların aşağı analiz için zenginleştiği 8 ve 9. Zenginleştirilmiş partiküllerin maksimum geri kazanımı için çalışma süresini optimize etmek için floresan etiketli mikroveziküllerin ve ekzozomların hızlandırılmış geçiş tayini yapıldı. Tüm örnek lem alanlarındaki floresan yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü.
Zenginleştirme sürecinden önce mikroveziküller ve ekzozomlar tüm numune alanlarına dağıldı ve yoğunluk giderek azaldı. İşlemden 10 dakika sonra parçacıklar elektro-kinetically göç etti ve anında bir ön konsantrasyon fişi katman yedi çıktı. Zaman 20 dakika ulaştığında, mikroveziküller ve ekzozomlar güçlü katmansekiz ve dokuz üzerinde duruldu ve floresan yoğunlukları dayalı beş kat zenginleştirilmiştir.
8. tabakadaki zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların bütünlüğü SEM ile araştırıldı. zenginleştirme işleminden sonra önemli ölçüde daha fazla hasarsız partikül gözlendi. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların boyut dağılımı da analiz edildi.
Daha sonra, zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların örnek alanlar üzerindeki gerçek konsantrasyonu altı, sekiz ve 10'daki katmanlarda analiz edildi. Sekizinci tabakada mikroveziküller ve ekzozomlar 5.58 faktörüyle önceden konsantre edildi, ancak diğer katmanlarda gözle görülür bir ön konsantrasyon gözlenmedi. Bu yordamın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, cihaz doğrulaması ve cihaz çalışma süresi sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı için protokolü tam olarak takip edin, çünkü bunlar optimize edilmiş koşullardır.
XO Pad ayrıca hücre dışı vezikülü serum veya plazma gibi protein açısından zengin örneklerden karbonat tamponu kullanarak ayırmak ve izole etmek için de kullanılabilir. Bu protokol, tanı, ilaç dağıtımı, immünoterapi ve diğer terapötikler gibi klinik araştırmalar için gerekli olan ön konsantre ve izole yetenekleriyle etkin ve basit bir hazırlık aracı sağlayabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hücre dışı veziküllerin etkili bir şekilde zenginleştirilmesi ve izolasyonu için tasarlanmış olan XO Pad adı verilen kağıt tabanlı bir cihazı imal etmek için bir protokol sunmaktadır. XO Pad, kimyasallar veya makineler kullanmadan ön konsantrasyon ve izolasyona olanak tanır ve geleneksel yöntemlere göre daha yüksek geri kazanım oranları gösterir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoteknoloji
- Hücre dışı veziküller
Arka Plan
- Hücre dışı veziküller hücre iletişiminde önemli bir rol oynar.
- Bu vezikülleri izole etmek için kullanılan geleneksel yöntemler genellikle karmaşık işlemleri içerir.
- XO Pad, araştırmacılar için daha basit bir alternatif sunar.
- Daha yüksek geri kazanım oranları, hücre dışı vezikül çalışmalarını geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Mikrovezikuller ve ekzosomları izole etmek için basit bir yöntem sunmak.
- Mevcut tekniklere kıyasla daha iyi geri kazanım oranları sağlamak.
- Hücre dışı vezikül biyolojisinde araştırmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 12 balmumu desenli katmanlı XO Pad tasarlama.
- Selüloz kağıdı üzerine hidrofobik balmumu baskı.
- Baskı yapılan kağıdın laboratuvar fırınında ısıtılması.
- Balmumu baskılı kağıdın ayrı XO Pad cihazlarına kesilmesi.
Ana Sonuçlar
- XO Pad, hücre dışı vezikülleri etkili bir şekilde zenginleştirir ve izole eder.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla daha yüksek geri kazanım oranları gösterilmiştir.
- Kimyasallara ihtiyaç duymadan basit üretim süreci.
- Araştırmalarda yaygın kullanım potansiyeli.
Sonuçlar
- XO Pad, hücre dışı vezikülleri inceleyen araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- İzolasyon sürecini basitleştirirken verimliliği artırır.
- Bu yöntem, hücre dışı vezikül fonksiyonlarının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolation of extracellular vesicles remains a bottleneck in biomarker discovery due to low yield and sample damage from conventional methods. The paper-based Exo-PAD enables chemical-free, fivefold enrichment of microvesicles and exosomes, improving recovery while preserving vesicle integrity. This supports early-stage target validation and assay development by providing a scalable, reproducible workflow for downstream omics and functional analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through enriched vesicle cargo analysis.
- Operational Value: Reduces sample loss and damage compared to ultracentrifugation, increasing usable material for target de-risking.
- Predictive Value: Fivefold enrichment improves signal detection in low-abundance biomarkers, supporting portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, concentrated vesicle preparations suitable for assay standardization.
- Operational Value: Eliminates need for centrifuges or chemicals, simplifying workflow and reducing operational complexity.
- Scalability: Paper-based design allows parallel processing and platform reuse across multiple sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enriched vesicles maintain integrity for downstream functional assays and biomarker profiling.
- Disease-Relevant Systems: Compatible with biofluids like serum or plasma when used with carbonate buffer, supporting clinical relevance.
- Mechanistic De-risking: Reliable isolation enables consistent evaluation of vesicle-mediated mechanisms in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The Exo-PAD fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling reliable vesicle preparation for analytical and functional downstream applications.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by providing intact vesicles for cargo analysis and pathway interrogation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs essential for assay readiness and compound screening campaigns.
- Analytics: Enables fluorescence-based quantification and size distribution analysis for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through preserved vesicle structure and function.
- Enterprise Reuse: Simple fabrication and operation allow adoption as a reusable platform across teams and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through higher recovery and intact vesicle isolation.
- Operational Value: Standardizes enrichment process, reduces reagent waste, and eliminates equipment dependency.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by reducing false negatives in biomarker detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through reliable, scalable vesicle preparation for diagnostic and therapeutic applications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in wax patterning and ion concentration polarization principles for device fabrication.
- Needs access to laboratory oven, hot plate, cutter, and voltage source for operation.
- Demands standardization of sample volume, buffer composition, and processing time across users.
- Adaptation to viscous biofluids may require buffer optimization, such as carbonate serum/plasma compatibility.
- Practical limitation: Enrichment is layer-specific (layers 8–9), requiring precise puning for downstream analysis.
