Name: Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Öğrenin, XO Pad kullanarak mikrovezikül ve ekzozomları kağıt bazlı preconcentration ve izolasyon yöntemiyle nasıl zenginleştireceğinizi. Bu kimyasalsız teknik, geleneksel yöntemlere göre daha yüksek kurtarma oranları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı Grant NRF-2018R1D1A1A09084044 tarafından desteklenmiştir. J. H. Lee, 2019 yılında Kwangwoon Üniversitesi'nden bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Hyerin Kim, Kore Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı'nın (MOTIE) Kore Teknoloji Geliştirme Enstitüsü (KIAT) tarafından işletilen "Endüstri Uzmanları için Yetkinlik Geliştirme Programı" tarafından desteklendi. P0002397, Giyilebilir Akıllı Cihazların Endüstriyel Yakınsaması için HRD programı).

1. Cihaz imalatı
<ol><li>Yazıcı yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak kağıda basılacak bölgeyi tanımlayın. NOT: Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak 5 mm'den 2 mm'ye kadar daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahiptir(Şekil 1A).</li>
	<li>Selüloz kağıdın her iki tarafına belirlenen bölgelere hidrofobik balmumu yazdırın(Malzeme Tablosu) ticari balmumu yazıcı(Malzeme Tablosu)(Şekil 1B)kullanarak.</li>
	<li>Balmumu baskılı kağıdı 120 °C'de 80 s'lik bir laboratuvar fırınına yerleştirin. NOT: Bu adım, basılı balmumu termal bir yeniden akış elde ederek kağıdın içine ulaşmak için balmumu sağlar. Bu kuluçka protokolü ile desenin çözünürlüğü ~2 mm'dir. Böylece, 2 mm'den daha az desenler yazdırmamaya dikkat edin aksi takdirde desenler balmumu tarafından engellenir.</li>
	<li>Tek tek cihazlar yapmak için balmumu baskılı kağıdı bir kesici ile kesin(Şekil 1C).</li>
	<li>Damla 5 μL ve 2 μL permektif membran (örneğin, Nafion; Malzeme Tablosu) sırasıyla en sol ve en sağ katmanlarda örnek alanlara (Şekil 1D).</li>
	<li>Permselective membran çözücübuharlaştırmak için 30 dakika için 70 °C sıcak bir plaka üzerinde permselmembran membran ile kaplanmış katmanları yerleştirin.</li>
	<li>Tampon çözeltiye bakan kaplamalı tabakanın en dış yüzeyini basınca duyarlı bantla kapatın ve küçük bir delik bırakın.</li>
	<li>Yazdırılan tek tek cihazı (örn. Exo-PAD) beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlayın. NOT: Cihazı katlayarak, tüm örnek alanlar yakınsamayla bağlanır (Şekil 1E). Bu yakınsak tasarım, Voltaj ICP için uygulandığında elektrik alan çizgilerini odaklayarak mikroveziküllerin ve ekzozomların daha yoğun bir ön konsantrasyonuna ulaşır.</li>
</ol>2. Iyon konsantrasyonu polarizasyonu ile mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleştirilmesi ve mekansal odaklanması
<ol><li>Mikrovezikül ve ekzozom numunesinin 15 μL'sini yükleyin (~3 x 1011 partikül/mL 0,1x fosfat tamponlu tuzlu tuzlu [PBS] ile %0,05 Ara 20) yakınsak numune alanlarına boru lama ile ve tüm numune alanlarının tam Olarak ıslatılmasını sağlamak için birkaç saniye bekleyin(Şekil 1F).</li>
	<li>Exo-PAD'in her iki ucuna iki akrilik oda yerleştirin ve exo-PAD'i küçük bağlayıcı klipslerle güvenli bir şekilde kenetleyin (Şekil 1G).</li>
	<li>Odaları 0,1x PBS'nin 110 μL'si ile doldurun ve iki Ag/AgCl elektrot takın(Şekil 1H).</li>
	<li>Akım gerilimi kaynak ölçüm sistemi(Malzeme Tablosu)kullanarak elektrotlara 20 dk için 30 V uygulayın. NOT: Uygulanan gerilim ICP fenomenini oluşturur ve bu nedenle Exo-PAD'in 8 ve 9.</li>
</ol>3. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların izolasyonu
<ol><li>Katlanmış Exo-PAD'i akrilik bölmelerden ayırın ve zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları diğer katmanlardan izole etmek için cihazı açın(Şekil 1I).</li>
	<li>Mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleştiği 8 ve9.</li>
</ol>4. Taramalı elektron mikroskobu analizi
<ol><li>Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları, delikli alanları 0,1 M sodyum kacodylate tamponuna 0,1 M sodyum kacodylate tamponuna ve 0,1 M sodyum kacodylate de %1'de 1 saat eve batırarak düzeltin. DİkKAT: Osmiyum tetroksit son derece zehirli ve tehlikeli bir kimyasaldır. Osmiyum tetroksit plastiklere nüfuz edebileceği nden, camda saklanmalıdır. Osmiyum tetroksitin herhangi bir şekilde taşınması, çift nitril eldivenli kimyasal bir duman kaputunda yapılmalıdır.</li>
	<li>Sabit mikrovezikülleri ve ekzozomları 200 reis etanol (yani%50, %70, %90 ve %100) artan derecelerle susuz laştırın her biri 30 dakika.</li>
	<li>Kimyasal 30 dakika boyunca bir kurutucu içinde hexamethyldisilazane daldırma tarafından örnek kuru. DİkKAT: Hexamethyldisilazane yanıcı ve neme duyarlı bir kimyasaldır. Ateşleme kaynaklarından uzakta kuru ve iyi havalandırılan bir alanda saklanmalıdır.</li>
	<li>Tamamen kurutulmuş mikrovezikülleri ve ekzozomları altın/paladyum (~20 nm) ile kaplayın ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerini yakalayın.</li>
</ol>5. Nanopartikül izleme analizi
<ol><li>20 dk cihaz çalışmasından sonra biyopsi yumruğu kullanarak 6, 8 ve 10 katmanlarındaki numune alanlarını delin.</li>
	<li>Her delikli alanı tampon çözeltiye daldırın (0,1x PBS %0,01 Ara 20 ile).</li>
	<li>Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları yeniden askıya almak için 6.000 rpm'de 30 s'lik 10 dakika ve santrifüj için girdap.</li>
	<li>Çözeltiden delikli alanları çıkarın ve mikroveziküllerin ve ekzozomların konsantrasyonunun bir nanopartikül izleme analizi (NTA) cihazı(Malzeme Tablosu)ile ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Exo-PAD mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleşmesi ve izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılmasına rağmen, birkaç kritik nokta dikkatle düşünülmelidir: 1) cihaz hazırlama sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı, 2) işlem süresi, 3) değişen katman numaraları ve örnek alan çapları ile gerilim uygulaması ve 4) klinik numunelere uygulanabilirlik.
Protokolde verilen kuluçka süresi ve sıcaklığı, güvenilir bir cihaz imal etmek için optimize edilmiş koşullardır. Daha uzun kuluçka sürel...

Mikroveziküller ve ekzozomlar sırasıyla 0.2−1 μm ve 30−200 nm ölçülerinde küçük membran veziküllerdir. Onlar birkaç farklı hücre tipleri 1 tarafından hücre dışı ortama salgılanır1,2,3,4,5. Onlar DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler alt kümeleri şeklinde ebeveyn hücre bilgileri içerir ve serum, plazma, idrar, beyin-omurilik sıvısı, amniyotik sıvı ve tükürük gibi çeşitli vücut sıvıları ile vücutta dolaşan6,7,8,9. Bu nedenle, mikroveziküllerin ve ekzozomların biyolojik sıvılardan verimli bir şekilde izole edilmesi ne kadar iyi olursa odalabilmek için, hastalığın tanı, prognoz ve gerçek zamanlı izleme ve yeni tedavi alanlarının geliştirilmesi alanlarında geniş fırsatlar sunabilmektedir.
Ancak, ultrasantrifüje dayalı mikroveziküller ve ekzozomlar için geleneksel izolasyon yöntemi son derece zaman alıcıdır ve numunenin önemli ölçüde kaybolmasına ve kirlenmesine neden olur. Birkaç hantal pipetleme ve yükleme adımları ve tekrarlanan ultracentrifugation,5,6,10,11,12ile çeşitli reaktiflerin atılması içerir olmasıdır.12 Ayrıca, ultracentrifugation tarafından indüklenen yüksek kesme stresi (~ 100.000 x g)mikrovezikülve ekzozomların fiziksel lysis neden olabilir, kötü iyileşme oranları verim (%5−23%)6,13,14. Bu nedenle, mikroveziküller ve ekzozomlar için son derece verimli, göze batmaz bir izolasyon tekniği geliştirilmeli, böylece daha yüksek iyileşme oranları elde edilmelidir.
Bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) mikroveziles ve ekzozomlar6basit, nazik ve yüksek verimli izolasyon için geliştirilmiştir. Exo-PAD'in tasarımı, seri olarak bağlı numune alanlarına sahip ve çapı giderek azalan çok katlı bir kağıttır. Yüklü biyomolekülleri önceden yoğunlaştıran nano-elektrokinetik bir fenomen olan iyon konsantrasyonu polarizasyon (ICP) tekniği bu eşsiz tasarımla bütünleşmiştir. Exo-PAD'in kullanılması, mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleşmesine ve cihazın sadece açığa çıkarılarak izolasyonuna yol açtı. Bu makalede, exo-PAD ayrıntılı olarak açıklanır, genel cihaz imalatı ve operasyon kullanımının analizi, yöntemi göstermek ve temsili sonuçları göstermekiçin 6.

<table><tbody><tr><td>Ag / AgCl elektrotları</td><td>A-M Sistemleri, Inc.</td><td>531500</td><td>0.15 "çapında</td></tr><tr><td>Sığır Serumu (BSA) Albümini, Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA, Alexa Fluor 594 ile konjuge (Ex / Em: 590/617 nm)</td></tr> <tr><td>Karbonat-Bikarbonat Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Karbonat tamponu</td></tr><tr><td>CorelDraw yazılımı (Coral Co., Kanada)</td><td>Corel Corporation</td><td></td><td>Balmumu baskısını tanımlamak için yazıcı yazılımı bölge</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Balmumu yazıcı</td></tr><tr><td>Kromatografi kağıdı sınıf 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Selüloz kağıt, boyut: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Floresan etiketli eksozom standartları</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>FITC ile etiketlenmiş eksozom (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 akım/gerilim kaynak ölçer</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Akım&ndash; Gerilim Kaynağı Ölçüm Sistemi</td></tr><tr><td>Nafion perflorlu reçine çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Permselective membran, düşük alifatik alkoller ve su karışımında ağırlıkça %20; %34 su içerir</td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Teknolojisi</td><td></td><td>Nanopartikül izleme analizi (NTA) makinesi</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS, pH7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrovezikül ve ekzozomların kağıt bazlı preconcentration ve İzolasyonları

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Mikroveziküller ve ekzozomlar hücre dışı ortama salınan ve vücutta dolaşan küçük membranöz veziküllerdir. DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler gibi çeşitli ebeveyn hücre kaynaklı biyomoleküller içerdikleri için, bunların zenginleşmesi ve izolasyonu klinik uygulamalar için potansiyel biyobelirteçler olarak sömürülmeleri için kritik adımlardır. Ancak, konvansiyonel izolasyon yöntemleri (örn. ultrasantrifüj) mikrovezikülve ekzozomlarda önemli kayıp ve hasara neden olur. Bu yöntemler aynı zamanda aşırı santrifüj, yükleme ve reaktiflerin israfı birden çok tekrarlayan adımlar gerektirir. Bu makalede, basit bir şekilde mikroveziküllerin ve ekzozomların etkili bir şekilde zenginleştirilmesi ve izole edilmesi için tasarlanmış bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Yakınsak örnek alana sahip akordeon benzeri çok katlı katmanlardan oluşan Exo-PAD'in benzersiz tasarımı, iyon konsantrasyonu polarizasyon tekniği ile entegre edilerek mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, zenginleştirilmiş mikroveziküller ve ekzozomlar sadece Exo-PAD açArak izole edilir.

İşlem süresi zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum geri kazanım verimini elde etmek için optimize edilmelidir. Yetersiz zaman mikroveziküllerin ve ekzozomların yeterli göçetmesine izin vermez, bu da zenginleştirmeyi azaltır, aşırı zaman ise uzamsal odaklamayı bozar ve dolayısıyla mikrovezikülleri ve ekzozomları dağıtır. Böylece, zaman optimizasyonu adımı ile mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum ön konsantrasyon faktörü ve mikroveziküllerin ve ekzozomların en zengin olduğu son yer tespit edile...

Sunulan mikroveziküller ve ekzozomların etkili zenginleşmesi ve izolasyonu için kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için bir protokoldür.

Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Bu protokolde, hücre dışı veziküllerin izole edilmesinde etkili zenginleşme için tasarlanmış XO Pad adı verilen kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. XO Pad, geleneksel yöntemlere göre daha yüksek geri kazanım oranları gösterirken, herhangi bir kimyasal veya iş makinesi kullanmadan hücre dışı vezikülü önceden konsantre ve izole edebilen basit bir cihazdır. Yazıcı yazılımı ile yazdırılacak bölgeyi tanımlayarak başlayın.Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak beş ila iki milimetre arasında daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahip olmalıdır. Daha sonra, selüloz kağıdın her iki tarafında belirlenen bölgelerüzerinde hidrofobik balmumu yazdırın. 120 santigrat derece 80 saniye boyunca bir laboratuvar fırınında balmumu baskılı kağıt yerleştirin, sonra bireysel XO Pad cihazlar yapmak için bir kesici ile balmumu baskılı kağıt kesti.Perma seçici membran beş ve iki mikrolitre sol en ve sağ en katmanları, sırasıyla örnek alanlar üzerine bırakın. Perma seçici membran ile kodlanmış katmanları, çözücünün buharlaşması için 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerine yerleştirin. Daha sonra, tampon çözeltisi ile karşı karşıya kalan kaplamalı tabakanın en dış yüzeyini basınca duyarlı bantla kapatArak küçük bir delik bırakın.Tüm örnek alanları yakınsak bağlamak için XO Pad cihazını beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlayın. Pipet 15 mikrolitre mikrolitre mikrovezi ve ekzozom numunesi yakınsak numune alanlarında ve tam ıslatma sağlamak için birkaç saniye bekleyin. XO Pad'in her iki ucuna iki akrilik oda yerleştirin ve açılmayı önlemek için küçük bağlayıcı klipslerle güvenli bir şekilde kenetleyin.Odaları 0,1X PBS'nin 110 mikrolitresi ile doldurun ve iki gümüş elektrot takın. Daha sonra elektrotlara 20 dakika boyunca 30 volt uygulamak için bir akım gerilim kaynak ölçüm sistemi kullanın. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları izole etmek için katlanmış XO Pad'i akrilik bölmelerden ayırın ve diğer katmanlardan zenginleştirilmiş parçacıkları izole etmek için cihazı açın.Mikroveziküllerin ve ekzozomların aşağı analiz için zenginleştiği 8 ve 9. Zenginleştirilmiş partiküllerin maksimum geri kazanımı için çalışma süresini optimize etmek için floresan etiketli mikroveziküllerin ve ekzozomların hızlandırılmış geçiş tayini yapıldı. Tüm örnek lem alanlarındaki floresan yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü.Zenginleştirme sürecinden önce mikroveziküller ve ekzozomlar tüm numune alanlarına dağıldı ve yoğunluk giderek azaldı. İşlemden 10 dakika sonra parçacıklar elektro-kinetically göç etti ve anında bir ön konsantrasyon fişi katman yedi çıktı. Zaman 20 dakika ulaştığında, mikroveziküller ve ekzozomlar güçlü katmansekiz ve dokuz üzerinde duruldu ve floresan yoğunlukları dayalı beş kat zenginleştirilmiştir.8. tabakadaki zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların bütünlüğü SEM ile araştırıldı. zenginleştirme işleminden sonra önemli ölçüde daha fazla hasarsız partikül gözlendi. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların boyut dağılımı da analiz edildi.Daha sonra, zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların örnek alanlar üzerindeki gerçek konsantrasyonu altı, sekiz ve 10'daki katmanlarda analiz edildi. Sekizinci tabakada mikroveziküller ve ekzozomlar 5.58 faktörüyle önceden konsantre edildi, ancak diğer katmanlarda gözle görülür bir ön konsantrasyon gözlenmedi. Bu yordamın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, cihaz doğrulaması ve cihaz çalışma süresi sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı için protokolü tam olarak takip edin, çünkü bunlar optimize edilmiş koşullardır.XO Pad ayrıca hücre dışı vezikülü serum veya plazma gibi protein açısından zengin örneklerden karbonat tamponu kullanarak ayırmak ve izole etmek için de kullanılabilir. Bu protokol, tanı, ilaç dağıtımı, immünoterapi ve diğer terapötikler gibi klinik araştırmalar için gerekli olan ön konsantre ve izole yetenekleriyle etkin ve basit bir hazırlık aracı sağlayabilir.

paper-based-preconcentration-isolation-microvesicles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, 10 kadar ul serum örneklerinden, hücre dışı veziküller (EVS), hücrelerden salınan küçük zar parçacıkları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu yaklaşım, ultra-santrifüj ihtiyacını önlediği deney süresi sadece birkaç dakika sürer ve sınırlı hacim örneklerinden EV'lerin izolasyonunu sağlar.

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.

Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Öğrenin, XO Pad kullanarak mikrovezikül ve ekzozomları kağıt bazlı preconcentration ve izolasyon yöntemiyle nasıl zenginleştireceğinizi. Bu kimyasalsız teknik, geleneksel yöntemlere göre daha yüksek kurtarma oranları sağlar.

Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları

Daha fazla video keşfet