Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi
16 Temmuz 2020
Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.
Bu protokol, araştırmacıların elektron mikroskobu ile birlikte doğal hücre zarı nanoparçacık sistemini kullanarak zar proteinlerinin doğal oligomerik durumunu daha doğru bir şekilde belirlemelerine yardımcı olacaktır. Bu tekniğin avantajı, doğal hücre zarı benzeri bir ortamda zar proteinlerinin doğru yapısal verilerini sağlaması ve gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kullanılabilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Kyle Kroeck olacak.
Doğal hücre zarı nanopartiküllerini hazırlamak için, ilgilenilen zar peletinin bir gramını 10 mililitre NCMN Tampon A'da yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse hücre zarı örneğini 20 santigrat derecede homojenize etmek için bir cam Dounce homojenizatör kullanın ve askıya alınmış numuneyi 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın. Numuneye %2,5 membran aktif polimerin nihai konsantrasyonuna kadar membran aktif polimer stok çözeltisi ve ilave NCMN Tampon A ekleyin ve çözeltiyi 20 santigrat derecede iki saat çalkalayın. İnkübasyonun sonunda, numuneyi ultrasantrifüj edin.
Santrifüjleme sırasında, santrifüjlemenin sonuna A.At beş mililitrelik bir nikel NTA kolonunu 25 mililitre NCMN Tamponu ile dengeleyin, süpernatanı kolona aktarın ve süpernatanı 20 santigrat derecede kolona yüklemek için dakikada 0,5 mililitre akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompası kullanın. Hızlı protein sıvı kromatografi makinesi hatlarını, sistemi tamamen yıkamak ve kolonu kromatografi makinesine bağlamak için yeterli NCMN Tampon B ile yıkayın. Kolonu 30 mililitre NCMN Tampon B ile dakikada bir mililitre akış hızında yıkayın ve akışı toplayın.
Kolonu 30 mililitre NCMN Buffer C ile dakikada bir mililitre akış hızında yıkayın ve akışı toplayın. Proteini dakikada 0,5 mililitre akış hızında 20 mililitre NCMN Tampon D ile elute edin ve numunenin bir mililitre fraksiyonunu toplamak için bir fraksiyon toplayıcı kullanın, ardından protein numunelerini SDS-PAGE kullanarak dört santigrat derecede saklayın hızlı protein sıvı kromatografisi elüsyon grafiğinde gözlemlenen zirvelere karşılık gelen numuneleri kontrol etmek için. Negatif leke ızgaraları hazırlamak için, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdı ile bir cam slaytı sarın ve numune hazırlama için kullanılacak ızgaraları lamın üzerine yerleştirin.
Elektron mikroskobu ızgaralı cam slaytı iki elektrot arasındaki bir kızdırma boşaltıcısının haznesine yerleştirin ve kapağın ortalandığından ve iyi kapatıldığından emin olarak cam kapağı yerine yerleştirin. Kızdırma boşaltma makinesini çalıştırın ve plazma tarafından üretilen mor ışığın görünür olduğundan emin olun. Makine çalışmayı bitirdiğinde, cam kapağı çıkarmadan ve sürgüyü tezgahın üzerine yerleştirmeden önce haznenin atmosfer basıncına ulaşmasını bekleyin.
Saflaştırılmış protein numunelerinin konsantrasyonunu mililitre başına yaklaşık 0.1 miligrama ayarlayın ve 3.5 mikrolitre protein numunesini 10 nanometre kalınlığındaki karbon ızgaraya yükleyin. Bir dakika sonra, sıvıyı elektron mikroskobu ızgara yüzeyinden çıkarmak için bir parça filtre kağıdı kullanın ve ızgara yüzeyini yıkama başına üç mikrolitrelik bir damla su ile üç kez yıkayın. Son suyla yıkamadan sonra, ızgara yüzeyini yıkama başına üç mikrolitrelik taze filtrelenmiş %2 uranyum asetat damlacıkları ile iki kez daha yıkayın.
Son uranyum asetat yıkamasından sonra, ızgarayı bir dakika boyunca üç mikrolitrelik taze filtrelenmiş %2 uranyum asetat damlası ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, damlacığı çıkarmak için yeni bir filtre kağıdı parçası kullanın ve ızgarayı daha sonra kullanmak üzere bir ızgara kutusunda saklamadan önce ızgarayı en az bir dakika havayla kurutun. Burada, gösterildiği gibi transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak elde edilen negatif leke görüntüleri gözlemlenebilir.
Deterjanla saflaştırılmış vahşi tip Acraflavin direnç kanalı protein B numunesi için negatif leke görüntüsü, proteinin iyi tanımlanmış bir trimerik kuaterner yapı sergilediği homojen bir monodispers partikül çözeltisini ortaya koymaktadır. Bu trimerik yapılar, saflaştırmadan sonra gözlemlenen boyut dışlama kromatogramına karşılık gelir. Buna karşılık, yine deterjanla saflaştırılmış P223G mutantı için negatif leke görüntüsünde, agregasyona eğilimi olan ancak gözlemlenebilir doğal trimerlere sahip heterojen bir polidispers nanopartikül çözeltisi gözlemlenemez.
Bu sonuçlar ayrıca boyut dışlama kromatografisi ile de desteklenmektedir. Membran aktif polimer NCMNP11 ile saflaştırıldıktan sonra vahşi tip ve mutant proteinler için benzer sonuçlar gözlenmiştir. NCMNP52 polimerin kullanımı, çok daha büyük boyutlarda doğal hücre zarı nanopartiküllerinin üretilmesini kolaylaştırır ve çoklu Acraflavin direnç kanalı protein B trimerinin tek bir doğal hücre zarı partikülünde görüntülenmesine izin verir.
Bununla birlikte, mutant numunede, büyük doğal hücre zarı çift katmanlı yamalara bakıldığında bile hiçbir trimer parçacığı gözlenmez. Saflaştırılmış protein numunelerinin SDS-PAGE analizi, proteinin tahmin edilen moleküler ağırlığında %95'ten daha büyük bir saflık ile tüm numunelerde Acraflavin direnci B'nin varlığını doğrular. Bu protokolü diğer proteinler için değiştirirken, çözündürme işlemi için uygun zar fraksiyonu miktarını ve uzunluğu, zamanı ve sıcaklığı deneysel olarak belirlemek önemlidir.
Numunenizin görüntüleri, iyi tanımlanmış yapısal birimlere sahip homojen bir monodispers parçacık çözeltisini ortaya koyuyorsa, numune kriyo-elektron mikroskobu ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, araştırmacıların membran proteinlerinin doğal oligomerik durumunu daha doğru bir şekilde belirlemelerine yardımcı olacak ve elektron mikroskobu ile birlikte doğal hücre zar nanocüce sistemini kullanarak sağlanmaktadır. Bu teknik, membran proteinlerinin yapısal verilerini doğal hücre zar benzeri bir ortamda sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Yapısal Biyoloji
Arka Plan
- Membran proteinlerinin oligomerik durumunu anlamak, işlevlerini açıklamak için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler, bu proteinlerin doğal ortamını doğru bir şekilde yansıtmayabilir.
- Elektron mikroskobu, yüksek çözünürlüklü görüntüleme olanakları sunar.
- Doğal hücre zar nanocüceleri, membran proteinlerini incelemek için daha gerçekçi bir bağlam sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Membran proteinlerinin oligomerik durumunu belirlemek için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Yapısal analiz için doğal hücre zar nanocücelerini kullanmak.
- Membran proteinlerinden elde edilen yapısal verilerin doğruluğunu artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Membran peletlerinden doğal hücre zar nanocücelerinin hazırlanması.
- Cam Dounce homojenizatör kullanılarak hücre zar örneklerinin homojenizasyonu.
- Nanocücelerin izole edilmesi için ultrasantrifüjlemesi.
- Membran protein yapılarının görselleştirilmesi için elektron mikroskobu.
Ana Sonuçlar
- Doğal hücre zar nanocücelerin başarılı bir şekilde hazırlanması.
- Membran proteinlerinin oligomerik durumlarının doğru bir şekilde belirlenmesi.
- Elektron mikroskobu ile elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntüler.
- Gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapı tayini potansiyeli.
Sonuçlar
- Bu protokol, membran proteinlerini incelemek için sağlam bir yöntem sunar.
- Doğal bir ortamın kullanılması, yapısal verilerin doğruluğunu artırır.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli membran proteinlerinin detaylı yapısal analizini içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate determination of membrane protein oligomeric states is critical for target validation in drug discovery, as misinterpretation can lead to failed mechanistic hypotheses. The native cell membrane nanoparticle system preserves native lipid bilayer context, reducing artefactual dissociation or denaturation seen in detergent-based methods. This enables more reliable structural data for de-risking early-stage targets and informing lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving native oligomeric states of membrane protein targets like AcrB.
- Operational Value: Provides structural clarity in a native-like environment, reducing false negatives in target validation assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming functional quaternary structures prior to downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates stable, monodisperse nanoparticles suitable for reproducible biophysical assays.
- Operational Value: Enables standardization of membrane protein preparations across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large bilayer patches for imaging multiple protein complexes per particle.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural insights with preclinical validation by maintaining native membrane context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from native oligomeric states rather than detergent-induced artifacts.
- Biomarker Alignment: Supports target engagement studies where oligomeric state correlates with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural inputs that inform hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing native quaternary arrangements of membrane protein complexes.
- Screening: Delivers assay-ready, homogeneous protein nanoparticles for consistent compound screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of oligomeric state via electron microscopy and size exclusion chromatography.
- Translational Research: Ensures structural findings are translatable to native physiology, improving predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for membrane protein structural analysis across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by preserving native protein-lipid interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces variability in structural data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein isolation and nanoparticle formation.
- Depends on access to ultracentrifugation, FPLC, and electron microscopy instrumentation.
- Necessitates standardization of buffer conditions and polymer concentrations across teams.
- Involves optimization of solubilization time, temperature, and membrane fraction for each target.
- Limited by the need for empirical determination of solubilization parameters per membrane source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:54
Native Cell Membrane Nanoparticle (NCMN) Preparation
3:04
Negative Stain Grid Preparation
4:55
Results: Representative Negative Stain and Electrophoresis Gel images of Purified Acriflavine Resistance B (AcrB) Constructs
6:52
Conclusion
