Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Kök hücrelerin fonksiyonel böbrek hücrelerine farklılaşması için protokoller hala belirsizliğini korumaktadır. Bu yöntem, böbrek hastalığı mekanizmalarını incelemek için yeni araçlar sağlayarak, özgüllük ve verimlilikle olgun podositler üretir. Bu yöntem, alt popülasyon seçimi veya genetik manipülasyon kullanmadan yüksek saflıkta insan iPS hücresinden türetilmiş podositler üretmek için kimyasal olarak tanımlanmış bir bileşime sahip hücre kültürü ortamı ve hücre dışı matris proteinlerini kullanır.

Böbrek hastalığı olan hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Bu yöntemin, yeni biyobelirteçlerin ve terapötiklerin geliştirilmesini kolaylaştırabilecek hastalık mekanizmalarının modellenmesi ve anlaşılması için etkileri vardır. Besleyici içermeyen bir insan iPSC kültürü oluşturmak için, önceden kaplanmış plakalardan bazal membran matrisi 1'in kalıntı çözeltisini aspire edin ve kuyucukları, ısıtılmış bazal ortamın kuyusu başına bir ila iki mililitre ile üç kez yıkayın.

Harcanan hücre kültürü ortamını bir insan iPSC kültüründen aspire edin ve hücreleri ısıtılmış ortamla üç kez durulayın. 37 santigrat derecede bir dakikalık inkübasyon için her oyuğa bir mililitre ılık hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Yuvarlak hücre koloni kenarlarını bir doku kültürü mikroskobu altında onayladıktan sonra, hücre ayırma solüsyonunu hızlı bir şekilde aspire edin ve hücreleri hücre kültürü ortamı ile nazikçe durulayın.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelere üç mililitre insan iPSC kültür ortamı ekleyin ve kolonileri kazımak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Gevşek bir şekilde yapışmış hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyin ve tüm hücrelerin toplanmasını sağlamak için plakayı iyice yıkayın. Kuyu başına iki mililitre insan kaynaklı pluripotent kök hücre içeren yeni bir bazal membran matris 1 kaplı altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre aktarın ve hücre kolonilerini kuyucuklar içinde eşit olarak dağıtmak için plakayı sekiz şeklinde hareket ettirin.

Plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreler yaklaşık% 70 birleşmeye ulaşana kadar ortamı günlük olarak yenileyin. Gerekirse, süpernatanı kuyulardan aspire etmeden önce farklılaşma alanlarını aseptik olarak kazıyın. Kuyucukları üç kez yıkadıktan sonra, hücreleri gösterildiği gibi ayırın ve elde edilen hücre süspansiyonlarını 15 mililitrelik konik bir tüpte çekin.

Pipetleme ile karıştırdıktan sonra, tüpteki son hacmi ılık ortamda 15 mililitreye getirin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri ikinci bir santrifüjleme için taze ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri saymak için bir mililitre mezoderm indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, hücreleri mililitre mezoderm indüksiyon orta konsantrasyonu başına bir kez 10 ila beşinci hücreye yeniden süspanse edin ve hücre dışı matris çözeltisini bazal membran matrisi 2 kaplı plakalardan aspire edin.

Plakaları ılık ortamla iki kez durulayın ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre süspansiyonunu nazik pipetleme ile karıştırın. Bazal membran matris 2 kaplı 12 oyuklu plakaların her bir oyuğuna bir mililitre hücre ekleyin ve hücreleri daha eşit bir şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın. Ardından plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Farklılaşmanın 2-15. günlerinde, mezoderm indüksiyon ortamını oyuk başına bir mililitre ara mezoderm indüksiyon ortamı ile değiştirin. Ortamın sararması ile belirtildiği gibi önemli hücre büyümesi ve besin maddelerinin hızlı bir şekilde tükenmesi gözlenirse, ara mezoderm farklılaşma ortamının hacmi kuyu başına 1.3 mililitreye çıkarılabilir. Kültürün 16. gününde, ara mezoderm hücrelerini ılık ortamla durulayın ve hücreleri 37 santigrat derecede üç dakika boyunca oyuk başına 500 mikrolitre% 0.05 Tripsin EDTA ile inkübe edin.

Hücreler ayrışmaya başladığında, hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın ve hücreleri pipetleyerek nazikçe karıştırın. Oyuk başına yaklaşık iki mililitre Tripsin nötralize edici çözelti ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hacmi orta ile 50 mililitreye getirin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Pelet, podosit indüksiyon ortamında, mililitre orta konsantrasyonda bir kez 10 ila beşinci hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri bazal membran matrisi 2 kaplı plakalara ekleyin. Ardından, hücrelerin daha eşit bir şekilde dağılmasına yardımcı olmak için plakayı hafifçe sallayın ve hücreleri beş güne kadar inkübatöre yerleştirin. Gösterildiği gibi kültür stratejisi kullanılarak, kök hücreler önce Brachyury'yi eksprese eden mezoderm hücrelerine, ardından PAX2 pozitif ara mezoderm hücrelerine ve sonunda olgun böbrek glomerüler podositlerine farklılaştırılabilir.

Kök hücreden türetilen podositler, WT1 için ve ayrıca soy tanımlama belirteci nefrin için pozitif boyanır. Şaşırtıcı bir şekilde, nefrinin hücre altı lokalizasyonu, olgun bir podosit fenotipi ile tutarlı olarak, ağırlıklı olarak podosit ayak süreçleri ve hücre sitoplazması içindedir. 12 oyuklu bir plakanın oyuk başına 10 ila beşinci hücre olan önerilen yoğunluğu önemli ölçüde aşan yoğunluklarda ekilen hücreler, protokolün standart zaman çizelgesi içinde olgun podositlerin beklenen morfolojik fenotipinden yoksun büyük hücre kümeleri ile sonuçlanır.

Bununla birlikte, bu protokolde önerilen yoğunluklarda tohumlama, istenen morfolojiye sahip hücre kültürleri ile sonuçlanır. Hücre ayrılması için uygun bazal membran proteininin kullanılmasını ve mezoderm ve podosit indüksiyonu için doğru hücre tohumlama yoğunluğunun korunmasını öneririz. Bu podosit farklılaştırma yöntemi, ilaç taraması ve nefrotoksisite testi için insan böbreğinin fonksiyonel modellerini geliştirmek için çip üzerinde organlar, mikroakışkan sistemler veya 3D biyo-baskı teknolojileri ile entegre edilebilir.

Uygun hücre kültürü modellerinin eksikliği, böbrek hastalığı mekanizmalarının anlaşılmasında ilerlemeyi engellemiştir. Bu protokol, araştırmacılara hastalık modellemesi için tükenmez bir hasta kaynaklı podosit kaynağı sağlar.