Name: Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Öğrenin, tek bir kemirgen beyin örneğinde inme sonrası serebral ödem, enfarktüs bölgesi ve kan-beyin bariyeri kırılımını ölçme yöntemini. Bu teknik, iskemik inme patofizyolojisini kapsamlı şekilde araştırırken etik ve ekonomik verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ve Fizyoloji Bölümü, Biyoloji, Ekoloji ve Tıp Fakültesi Evgenia Goncharyk, Oles Honchar, Dnipro Üniversitesi, Dnipro, Ukrayna'ya görüşmelerimize destekleri ve yararlı katkıları için teşekkür ederiz. Elde edilen veriler Ruslan Kuts'un doktora tezinin bir parçasıdır.

Aşağıdaki prosedürler Helsinki ve Tokyo Bildirgesi'nin önerilerine ve Avrupa Topluluğu Deney Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergelere göre gerçek yapılmıştır. Deneyler, Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından da onaylandı.
1. Sıçanların deneysel prosedüre hazırlanması
<ol><li>Her biri 300 ila 350 g ağırlığında, açık patolojisi olmayan yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarını seçin.</li>
	<li>Deneyden önce 12 saatlik açık ve karanlık döngülerle tüm sıçanları oda sıcaklığında 22 °C'de koruyun.</li>
	<li>Yiyecek ve suyun mevcut reklam libitum olduğundan emin olun.</li>
	<li>Tüm işlemleri 06:00.m ile 14:00 .m arasında gerçekleştirin.</li>
</ol>2. Sıçanların ameliyata hazırlanması
<ol><li>Sıçanları izofluran (indüksiyon için% 4 ve bakım için% 2) ve% 24 oksijen (1.5 L / dk) ile 30 dakika uyuşturun.<ol>
<li>Pedal çekme refleksine sahip olmadıklarından emin olarak sıçanlardaki anestezi seviyesini test edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 kalibrelik kateteri kuyruk damarına yerleştirin. NOT: Vazodilasyon için kuyruk ısıtma işlemi yapılmaz.<ol>
<li>Sıçanları masaya bir supine pozisyonunda yerleştirin. Farelerin dört uzuvlarını yapıştırmak için tıbbi bant kullan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıcaklık ölçümü için probu ameliyattan önce sıçan rektumuna yerleştirin.</li>
	<li>İşlem sırasında, 37 °C çekirdek vücut sıcaklığını desteklemek için bir ısıtma plakası muhafaza edin.</li>
	<li>Koruma için sıçanın her iki gözüne de merhem ekleyin.</li>
	<li>Cerrahi bölgeyi tıraş edin ve % 10 povidon-iyot ve ardından% 70 izopropil alkol ile üç uygulama ile dezenfekte edin.</li>
</ol>3. Sağ taraf orta serebral arter tıkanma
NOT: MCAO, daha önce16,22,23olarak tanımlandığı gibi, McGarry ve ark.24ve Uluç ve ark.25 tarafından açıklanan enstrümanların kullanımı ile değiştirilmiş bir tekniklegerçekleştirilir.
<ol><li>Boynun ventral orta hattındaki deriyi ve yüzeysel fasyayı cerrahi cımbız ve kavisli bıçaklarla makasla parçalara ayrıştırın.</li>
	<li>ICA, harici karotis arter (ECA) ve ortak şahdamardan (CCA) oluşan kas üçgenini tanımlayın.</li>
	<li>Damar cerrahisi için doğru CCA ve ICA'yı mikroforceps ile vagus sinirinden dikkatlice ayırın.</li>
	<li>Doğru CCA ve ICA'yı açığa çıkar. CCA'dan ICA'ya gelen kan akışını mikro klipsler veya damar cerrahisi için özel turnikeler kullanarak engelleyin. Vasküler cerrahi için mikros makas kullanarak ICA üzerinde bir kesi (yaklaşık 1 mm) yapın.</li>
	<li>McA 26'yı tıkamak için, sağ CCA'nın çatallanma noktasından Willis çemberine hafif bir dirence ulaşana kadar yaklaşık 18,5-19 mm uzaklıkta, doğrudan ICA'dan bir monofilament kateter(4-0naylon) yerleştirin.</li>
	<li>CCA'nın çatallanmasının üzerinde ICA'nın etrafında ligat.</li>
	<li>Sham tarafından çalıştırılan denetim grubu için, adım 3.5 ve 3.616,22yerine naylon iplik ekleme gerçekleştirin.</li>
	<li>intraperitoneal enjeksiyon ile% 0.9 sodyum klorürün 5 mL'sini uygulayın.</li>
	<li>Yarayı dikişle kapatın ve sıçanı bir iyileşme alanına götürün. NOT: Anestezinin bitiminden birkaç dakika sonra, sıçan uyanacak ve kafesin etrafında bağımsız olarak hareket edecektir.</li>
	<li>MCAO'dan sonra 23 saat sonra, salin (4 mL / kg)23,26% 2 Evans mavisini bir kanonül27aracılığıyla her iki ameliyat grubu için kuyruk damarına enjekte edin. NOT: Bu, kan-beyin geçirgenlik izleyicisi olarak kullanılır. 60 dakika boyunca dolaşmasına izin verin.</li>
</ol>4. Enfarktüs bölgesinin belirlenmesi
<ol><li>IZ'yi MCAO'dan sonra 24 saat olarakölçün,daha önce açıklandığı gibi9,15,18,19,26. NOT: Kilolarının % 20'sinden fazlasını kaybeden veya nöbet veya hemipleji gelişen sıçanlar deneyden çıkarılır.</li>
	<li>Fare kendiliğinden nefes almaya son verene kadar ilham alan gaz karışımını% 20 oksijen ve% 80 karbondioksit ile değiştirerek sıçanı ötenazi edin.</li>
	<li>Makas ve cerrahi dikiz kullanarak göğüs kafesinin altındaki karın duvarından 5-6 cm yanal kesi ile göğsü açın.</li>
	<li>Makas ve cerrahi önps ile göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframlı bir kesi gerçekleştirin.</li>
	<li>Akciğerleri dikkatlice yerinden çıkarmak, göğüs kafesini sağ ve sol taraftaki köprücük kemiğine kadar kesin28.</li>
	<li>Kalbin sol ventrikülünden 200 mL normal salin ile perfuse.</li>
	<li>Kalbin sağ kulakçıkını makasla delin veya kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Giyotin kullanarak kafa kesme işlemi gerçekleştirin ve beyin dokusunu toplayın.</li>
	<li>İris makası kullanarak, foramen magnum'dan her iki taraftaki arka kafatası yüzeyinin distal kenarına kesin.</li>
	<li>Koku ampullerini, ventral yüzey boyunca sinir bağlantılarını ve kafatasının dorsal yüzeyini beyinden ayırın.</li>
	<li>Beyni kafasından çıkar.</li>
	<li>.009" paslanmaz çelik, kaplamasız, tek kenarlı jilet ile 2 mm kalınlığında yatay bölümler oluşturarak 6 beyin dilimi üretin.</li>
	<li>%0,05 TTC'de 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Beyin dokusunu mikroskop slaytlarına yerleştirin ve bu 6 beyin diliminin 1600x1600 dpi çözünürlüğe sahip optik taramasını gerçekleştirin (örneğin, ek 1'e bakın).</li>
	<li>Kanal Karıştırıcı işlevini(Görüntü &gt; Ayarlamalar &gt;Kanal Karıştırıcısı) kullanarak fotoğraf düzenleyicisi (örneğin, Adobe Photoshop CS2) içeren mavi bir filtre ekleyin ve görüntüyü JPEG dosya biçimi olarak kaydedin. NOT: Mavi filtre uygulandıktan sonra görüntü gri tonlamalı görünecektir.</li>
	<li>Kaydedilen görüntüyü ImageJ 1.37v29,30'da açın. NOT: Bu bilgisayar programı, siyah veya beyaz pikselleri yalıtmak ve hesaplamak için bir eşik işlevi kullanır (bkz. Şekil 1).</li>
	<li>Görüntünün 6 beyin diliminin her biri için, ana menüden "çokgen seçim" aracını kullanarak her yarımküreyi (sağ yaralı ipsilateral ve sol yaralanmamış kontralatör) ayrı bir görüntü dosyası olarak seçin ve kaydedin.</li>
	<li>Görüntü &gt; Ayarla &gt; Eşik'i seçerek ImageJ yazılımının ana menüsünden otomatik eşik işlevini kullanarak IZ'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın ve tek bir beyin kümesinin her yarımküreslerindeki piksel sayısını ölçün. NOT: ImageJ yazılımında bu adım için makrolar kullanılabilir (bkz. kod için Ek 2). Kesme, hangi piksellerin beyaza dönüştürüleceklerini ve grinin gölgesine bağlı olarak hangilerinin siyaha dönüştürüleceklerini belirlemek için kritik bir parametredir (örnek olarak Ek 3 ve Ek 4'e bakın). ImageJ daha sonra IZ'yi belirlemek için beyaz ve siyah pikselleri karşılaştırır. Boyama protokolü ve tarayıcı ayarlarına dayanarak, 0.220 sabit bir kesme değeri kullandık.</li>
	<li>Ipsilateral ve Kontrallateral Serebral Yarımküre Oranları (RICH) yöntemi13,23 kullanarak doku şişmesi için IZ düzeltme ölçümünü gerçekleştirin (Ek 5'tekiörneğe bakın). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg"> NOT: Enfarktüs boyutu kontrallateral yarımkürenin bir yüzdesi olarak değerlendirilir.</li>
</ol>5. Beyin ödeminin belirlenmesi31
NOT: BE 32 , 33 ölçümü için ImageJ1.37vkullanın.
<ol><li>MCAO'dan sonra 24 saat ölçün. BE'nin hesaplanması için, sol ve sağ yarımküre hacmindeki verileri (birimler halinde) kullanın.</li>
	<li>1600x1600 dpi çözünürlükte optik tarama gerçekleştirin (örneğin, Ek 1'e bakın).</li>
	<li>Beyin yarımkürelerini seçin ve yukarıda 4.17-4.19 bölümlerinde açıklandığı gibi ImageJ 1.37v ile BE'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın.</li>
	<li>BE alanını, aşağıdaki denklem kullanılarak RICH yöntemiyle hesaplanan etkilenmemiş kontrallateral yarımkürenin standart alanlarının yüzdesi olarak ifade edin (Ek 5'tekiörneğe bakınız)23,34. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg"> NOT: BE kapsamı kontrallateral yarımkürenin bir yüzdesi olarak değerlendirilir.</li>
</ol>6. BBB kesintisinin belirlenmesi
<ol><li>MCAO'dan sonra BBB kesintisini 24 saat ölçün.</li>
	<li>Sağ ve sol yarımküreleri altı dilime bölün ve her birini bir mikrosantrifüj tüpüne koyun.</li>
	<li>Beyin dokusunun her dilimini trikloroasetik asitte homojenize edin, P trikloroasetik asidin 4 mL'sinde 1 g beyin dokusunun hesaplanmasına dayanarak.</li>
	<li>20 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj.</li>
	<li><li> </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mevcut protokolün temel amacı, iskemik yaralanmanın üç ana parametresinin tutarlı ölçümlerini göstermekti: IZ, BE ve BBB geçirgenliği. Bu alanda daha önce yapılan çalışmalar, bu parametrelerden bir veya ikisinin aynı örnekte birlikte gerçekleştirilme olasılığını ortaya koymuştur. Bu üç parçalı yöntemin sunduğu maliyet azaltmanın yanı sıra, ameliyat edilmesi ve daha sonra ötenazi yapılması gereken hayvan sayısını sınırlayan daha arzu edilen bir biyoetik model de sağlar. Tüm histolojik tekniklerde olduğu gibi iskemik yaral...

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri inmedir. Küresel olarak, iskemik inme tüm inme vakalarının% 68'ini temsil ederken, Amerika Birleşik Devletleri'nde iskemik inme, inme vakalarının% 87'sini oluşturur1,2. İnmenin ekonomik yükünün Amerika Birleşik Devletleri'nde2 ve Avrupa Birliği'nde 45 milyar Euro'ya ulaştığı tahmin edilmektedir3. İnmenin hayvan modelleri patofizyolojisini incelemek, değerlendirme için yeni yöntemler geliştirmek ve yeni terapötik seçenekler önermek için gereklidir4.
İskemik inme, genellikle orta serebral arter veya dallarından biri olan majör bir serebral arterin tıkanması ile ortaya çıkar5. Bu nedenle, iskemik inme modelleri tarihsel olarak orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO)6, 7,8,9,10,11,12'yikapsamıştır. MCAO'yu takip ederek, nörolojik yaralanma en sık 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama yöntemi13, beyin ödemi (BE) kullanılarak enfarktüs bölgesi (IZ) ölçülerek değerlendirilir. ) Evans mavi boyama17 , 18,19kullanarak bir spektrometre tekniği ile kurutma veya hesaplama hemisferik hacimleri 14 , 15,16vekan beyin bariyeri (BBB) geçirgenliği kullanarak.
Geleneksel MCAO yöntemi, üç beyin ölçümünün her biri için ayrı beyin kümeleri kullanır. Büyük bir örneklem boyutu için, bu, ek etik ve finansal hususlarla birlikte önemli sayıda ötenaziye tabi hayvanla sonuçlanır. Bu maliyetleri hafifletmek için alternatif bir yöntem, MCAO sonrası kemirgen beyinlerinin tek bir kümesindeki üç parametrenin de ölçümünü içerecektir.
Aynı beyin örneğindeki parametrelerin kombinasyonlarını ölçmek için önceki girişimler yapılmıştır. Aynı beyin örneğinde TTC lekelemeden sonra eşzamanlı immünoresan boyama yöntemleri20 ve diğer moleküler ve biyokimyasal analizler21 tanımlanmıştır. Daha önce beyin ödemini değerlendirmek için beyin yarımküre hacimlerini hesapladık ve aynı beyin setinde enfarktüs bölgesini hesaplamak için TTC boyama yaptık15.
Mevcut protokolde, aynı kemirgen beyin kümesinde IZ, BE ve BBB geçirgenliğini belirleyerek iskemik beyin hasarını ölçen değiştirilmiş bir MCAO tekniği sunuyoruz. IZ TTC boyama ile ölçülür, BE yarım küre hacmi hesaplanarak belirlenir ve BBB geçirgenliği spektrometre yöntemleri ile elde edilir19. Bu protokolde, monofilament kateterin iç karotid artere (ICA) doğrudan yerleştirilmesine ve sabitlenmesine ve orta serebral artere (MCA) kan akışının daha fazla engellenmesine dayanan modifiye bir MCAO modeli kullandık22. Bu değiştirilmiş yöntem, geleneksel MCAO yöntemi16,22'yekıyasla ölüm ve morbidite oranının azaldığını göstermektedir.
Bu yeni yaklaşım, MCAO'dan sonra nörolojik hasarı ölçmek için finansal açıdan sağlam ve etik bir model sunmaktadır. İskemik beyin hasarının ana parametrelerinin bu değerlendirmesi, patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>2 mL Şırınga</td><td>Braun</td><td>4606027V%</td><td></td></tr><tr><td>70 alkol çözeltisi içinde% 2 klorheksidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>500 cc</td><td>Ameliyat alanında cildin genel antisepsisini sağlar</td></tr><tr><td>27 G Şırıngalı İğne</td><td>Braun</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>3-0 İpek sütürler</td><td>Henry Schein</td><td>1007842</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Naylon sütür</td><td>4-00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beyin & Doku Matrisleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15013</td><td></td></tr><tr><td>Kanül Venflon 22 G</td><td>KD-FIX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>183603985447 Santrifüj Sigma 2-16P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma 2-16P</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Analitik Teraziler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HR-AZ/HR-A</td><td></td></tr><tr><td>Dijital tartı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rs 4.000</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipeti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030119460</td><td></td></tr><tr><td>Floresan dedektörü</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf İsviçre</td><td>Model: Infinite 200 PRO çok modlu okuyucu</td><td>İsteğe bağlı.</td></tr><tr><td>Floresan dedektörü</td><td>Moleküler Cihazlar LLC</td><td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigma Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu Taban</td><td>Aleti İsteğe Bağlı.</td></tr><tr><td>Gazlı bez süngerler</td><td>Fisher</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>Termometreli ısıtıcı</td><td>Isıtma pedi-1</td><td>Model: HEATINGPAD-1/2</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatik mikroklipsler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizon-XL</td><td>Mennen Medical Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnfüzyon manşet</td><td>ABN</td><td>IC-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikro forseps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro makas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiset</td><td>Teva Medical</td><td>998702</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX 40 mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ameliyat forseps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ameliyat makası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optik tarayıcı</td><td>Canon</td><td>Cano Scan 4200F</td><td>Çözünürlük 3200 x 6400 dpi</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Purina Chow</td><td>Purina</td><td>5001</td><td>Sıçanlara, farelere ve hamsterlara verilen kemirgen laboratuvar yemeği, 5 yılı aşkın bir süredir biyomedikal araştırmalarda kullanılan bir yaşam döngüsü besindir. Bu deneyde sıçanlara ad libitum sağlanmıştır.</td></tr><tr><td>Sıçan kafesleri</td><td>Techniplast</td><td>2000P</td><td>Kemirgenler için geleneksel muhafaza. Deney boyunca fareleri barındırmak için kafesler kullanıldı</td></tr><tr><td>Neşter bıçakları #11</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.37v</td><td>NIH</td><td></td><td>Kaynak kodu ücretsiz olarak kullanılabilir. Yazar, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü, Bethesda, Maryland, ABD Araştırma Hizmetleri Şubesi'nde</td></tr><tr><td>SPSS İstatistikleri 22</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Office 365 ProPlus</td><td></td> <td>Microsoft-Microsoft</td> <td>Office Excel</td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>%50 trikloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %96</td> <td>Romical</td><td></td><td>Yanıcı sıvı</td></tr><tr><td>Evans mavisi %2</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran, USP %100</td> <td>Piramamal Yoğun Bakım, Inc</td><td>NDC 66794-017</td><td></td></tr></tbody></table>

tek bir kemirgen beyin Örneklerinde İnme sonrası serebral Ödem, enfarktüs bölgesi ve kan-beyin bariyeri kırılımının Ölçülmesi

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri iskemik inmedir. Tarihsel olarak, iskemik inmeyi uyarmak için kullanılan bir hayvan modeli orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) içerir. Enfarktüs bölgesi, beyin ödemi ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması MCAO sonrası beyin hasarının boyutunu yansıtan parametreler olarak ölçülür. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, bu ölçümlerin normalde farklı sıçan beyin örneklerinde elde edilmesi ve uygun bir örnek boyutu için ötenazi yapılması gereken çok sayıda sıçan nedeniyle etik ve finansal yüklere yol açtır. Burada, aynı sıçan beyin kümesinde enfarktüs bölgesini, beyin ödemini ve BBB geçirgenliğini ölçerek MCAO'yu takiben beyin hasarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yeni teknik, inmenin patofizyolojisini değerlendirmek için daha verimli bir yol sağlar.

Enfarktüs bölgesi ölçümü
Bağımsız örneklemli bir t-testi, kalıcı MCAO uygulanan 19 sıçanın, 16 sahte fareye kıyasla beyin enfarktüs hacminde önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (MCAO=% 7.49 ± 3.57 vs. Sham = %0,31 ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p &lt; 0,01 (bkz. Şekil 2A)). Veriler, SD'± kontrallateral yarımkürenin ortalama bir yüzdesi olarak ifade edilir.
Beyin ödemi ölçümü
<p cla...

Bu protokol, aynı kemirgen beyin örnekleri kümesinde iskemik beyin hasarının en önemli üç parametresini ölçmenin yeni bir tekniğini açıklar. Sadece bir beyin örneği kullanmak etik ve ekonomik maliyetler açısından oldukça avantajlıdır.

Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Bu protokolde, aynı kemirgen beyin setinde enfarktüs bölgesini, beyin ödemini ve BBB geçirgenliğini belirlemek için iskemik beyin hasarını ölçen modifiye bir orta serebral arter oklüzyon tekniği sunuyoruz. Etik ve ekonomik maliyetler açısından, bu tekniğin temel avantajı, her üç ölçüm için de sadece bir beyin örneğinin gerekli olmasıdır. İskemik beyin hasarının ana parametrelerinin bu değerlendirmesi, iskemik inme patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olacaktır.Başlamak için, sıçan beynini çıkarın ve 0,009 inç paslanmaz çelik, kaplamasız, tek kenarlı tıraş bıçağıyla 2 milimetre kalınlığında yatay bölümler kesin. Kesitleri %0.005 TTC'ye yerleştirin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ardından beyin dokusunu mikroskop slaytlarına yerleştirin ve altı beyin diliminin 1600 x 1600 DPI çözünürlükte optik taramasını gerçekleştirin. Resimlere mavi bir filtre eklemek için bir fotoğraf düzenleyici kullanın.Yazılımı açtıktan sonra görüntüye, ayarlamalara ve kanal karıştırıcıya gidin. Çıkış kanalı olarak maviyi seçin ve monokromu kontrol edin, ardından Tamam'ı tıklayın. Görüntüyü JPEG dosya biçiminde kaydedin.ImageJ sürüm 1.37'deki çokgen seçim aracını kullanarak altı beyin diliminin her birinin her yarım küresini seçin ve ayrı bir görüntü dosyası olarak kaydedin. Enfarktüs hacmini ve beyin ödemini hesaplamak için, görüntüdeki pikselleri bir eşiğe göre beyaza veya siyaha dönüştürmek için bir makro kullanın. Ardından, tüm dosyaları kapatın ve enfarktüs hacmini ve beyin ödemini belirlemek için beyaz ve siyah piksellerin sayısını karşılaştırmak için ikinci bir makro kullanın.Ham verileri bir elektronik tabloya kopyalayın. Enfarktüs hacmini hesaplarken, ipsilateral ve kontralateral serebral hemisferlerin oranlarını kullanarak doku şişmesini düzeltin. Beyin ödemi alanlarını, etkilenmemiş kontralateral hemisferin standart alanlarının yüzdesi olarak ifade edin.Oklüzyondan 24 saat sonra kan beyin bariyeri bozulmasını belirleyin. Sağ ve sol yarım küreleri altı dilime bölün ve her dilimi bir mikrosantrifüj tüpüne koyun. Beyin dokusunun her bir gramı başına 4 mililitre %50 trikloroasetik asit kullanarak beyin dokusunun her dilimini trikloroasetik asit içinde homojenize edin.Numuneleri 20 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı taze bir tüpe aktarın ve% 96 etanol ile 1: 3 oranında seyreltin. Bir plaka okuyucu ile lüminesans spektrofotometrisi gerçekleştirin. Bağımsız bir örneklem t-testi, kalıcı orta serebral arter tıkanıklığı veya MCAO uygulanan 19 sıçanın, sahte olarak ameliyat edilen 16 sıçana kıyasla beyin enfarktüs hacminde önemli bir artış gösterdiğini gösterdi.Kalıcı MCAO uygulanan sıçanlar, sahte olarak ameliyat edilen hayvanlara kıyasla, 24 saat sonra beyin ödemi ve kan beyin bariyeri parçalanması derecesinde önemli bir artış gösterdi. Bu prosedürü denerken, kimyasal konsantrasyonun protokole uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Bu protokol, beynin bir örneğinde iskemik hasarın üç parametresinin de değerlendirilmesini mümkün kılar.

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, orta serebral arter tıkanıklığına maruz kalan sıçanlardan alınan beyin dilimlerinde enfarktüs bölgesi ve beyin ödeminin değerlendirmesini göstermektedir. Enfarktüslü alanlar redoks boyaması kullanılarak tanımlanırken, görüntü analiz yazılımındaki mavi filtre ve eşik fonksiyonu, etkilenen hemisferdeki enfarktüs bölgesini ve ödemi ölçer.

Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Sonrası Bir Sıçan Beyninde Enfarktüs Bölgesi ve Beyin Ödeminin Ölçülmesi

Kaynak: Zeynalov, E. et. al., Sürekli IV İnfüzyonu, İnme ile Uyarılmış Beyin Ödemini İncelemek İçin Farelerde Arginin-vazopressin Reseptör Blokeri Conivaptan için Seçim Tedavi Yoludur. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, bir fare modelinde bir arginin-vazopressin (AVP) reseptör antagonistinin intravenöz iletimini göstermektedir. Geçici orta serebral arter tıkanıklığı beyin ödemine neden olur. Bir AVP reseptör antagonisti, sol juguler vendeki bir kateter yoluyla uygulanır ve ödemi hafifletir.

Bir fare modelinde beyin ödemini azaltmak için reseptör blokerlerinin intravenöz verilmesi

Serebral perfüzyon izleme iskemik inme modelleri doğruluğunu geliştirmek için gösterilmiştir. Teknik zorluklar sıklıkla serebrovasküler araştırma için bu önemli aracının kullanımını sınırlamak. Bu videoda, optimize edilmiş bir sistem sıçanlarda intraluminal orta serebral arter oklüzyonu sırasında tek veya çoklu-site hemodinamik izleme elde etmek gösterilmiştir.

Intraluminar Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ve Sıçan Strok Model Serebral Perfüzyon İzleme için Optimize Sistemi

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Bu protokol, farelerde geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben enfarktüs hacimlerini ve kan-beyin bariyeri bozulmasını azaltan tekrarlayan hipoksik ön koşullandırmayı veya sistemik hipoksiye kısa süreli maruziyetleri tanımlar. Ayrıca, nörovasküler korumanın etkinliğini değerlendirmek için inme sonrası enfarktüs hacminin ve kan-beyin bariyeri bozulmasının ikili miktar tayinini detaylandırır.

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Silikon kaplı bir sütür kullanılarak orta serebral arterin tıkanmasıyla inen bir fare inme modelini tarif ediyoruz. Protokol, kalıcı oklüzyon veya geçici bir iskemiyi indüklemek için uygulanabilir ve ardından reperfüzyon uygulanabilir.

Enfarktüs Bölgesi Orta Arter Tıkanıklığı Tekniği ve Görselleştirme kullanma Fare İskemik İnme ve İskemi-reperfüzyon indüksiyon

Bu yordamı genel amacı fare modelleri iskemik inme kan - beyin bariyerini bozulma vivo içinde değerlendirmesi için son derece tekrarlanabilir bir teknik sağlamaktır.

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Burada iç karotis arter üzerinden orta serebral arter yuvasını kapatıp tarafından fareler sonrası felç depresyon teşvik etmek için bir protokol sunuyoruz. İndüklenen depresif ruh hali onaylamak ve değerlendirmek için Porsolt zorla yüzme testi ve sakaroz tercih testi kullanıyoruz.

Farelerde inme sonrası depresyon Inducing için orta serebral arter tıkanıklığı tekniği

Bu çalışmanın amacı, 1-90 sonrası orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) sonrası beyin enfarktüsü ve sensorimotor fonksiyonunu test ederek beyin iskemisinin iyileşme ve sekel evrelerinde araştırma için bir hayvan modeli oluşturmak ve doğrulamaktır. farelerde gün.

Sıçanlarda Akut İnme Sonrası Beyin İyileşmesini Değerlendiren Bir Preklinik Model

Burada sunulan protokol beyin hasarı bir kemirgen modeli oluşturmak için bir teknik gösterir. Burada açıklanan yöntem lazer ışınlama kullanır ve motor korteks hedefler.

Farelerin Motor Korteksinde LazerE Bağlı Beyin Hasarı

Öğrenin, tek bir kemirgen beyin örneğinde inme sonrası serebral ödem, enfarktüs bölgesi ve kan-beyin bariyeri kırılımını ölçme yöntemini. Bu teknik, iskemik inme patofizyolojisini kapsamlı şekilde araştırırken etik ve ekonomik verimliliği artırır.

Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet