Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Atomik kuvvet mikroskobu otomasyonu, teknolojinin biyomedikal uygulamalara doğru evriminde önemli bir yeniliktir. Ayrıca hücre popülasyonlarının biyomekanik özelliklerinin araştırılmasına erişim sağlar. Yöntemimiz, 10 hücreyi ölçmek için dört saat süren normal yöntemlere kıyasla, dört saat içinde 1.000 hücre için AFM ölçümlerini kaydetmeyi mümkün kılar, bu gerçekten önemli bir zaman kazancıdır.

Otomasyon, bu teknolojiyi hastane laboratuvarlarına getirmenin ön koşuluysa, bu kavram kanıtı protokolü, belirli tıbbi tanı stratejilerinin geliştirilmesinde kullanım potansiyelini göstermektedir. Bu protokol, farklı sistemlerin araştırılmasına izin veren çeşitli mikroplarla doldurulabilen çok yönlü bir PDMS gövdesi kullanır. PDMS damgasını hazırlamak için, PDM'lerde, oligomerlerde 10 ila bir kütle oranında 55 gram PDMS polimer çözeltisini karıştırın ve elde eden çözeltiyi vakum altında bir kez 10 ila bir kez negatif iki çubuk için beş ila 10 dakika boyunca negatif bir ila bir kez gazdan arındırın.

Tüm tuzak kabarcıkları çıkarıldığında, gazdan çıkarılmış çözeltinin 20 gramını silikon bir ana kalıba iki ila üç milimetre kalınlık ve tekrar gazdan arındırın. Tüm kabarcıklar çıkarıldığında, PDMS'yi bir saat boyunca 80 santigrat derecede yeniden ifade edin ve PDMS mikro yapılandırılmış damgayı görünür mikroyapı dizilerine paralel kesmek için bir neşter kullanın. Daha sonra damgayı silikon ana kalıptan soyun ve damga mikro yapı alanını, slaydın yanına hizalanmış mikro yapılarla birlikte bir cam kaydırağın üzerine yerleştirin.

Hücreleri cihaza hazırlamak için, faizin hücre süspansiyonunun 600 mikrolitresini santrifüjleyin ve damgaya 200 mikrolitre süperndant ekleyin. Süpernatant yaklaşık 40 dakika vakum altında degas. Tüm kabarcıklar çıkarıldığında, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için PDMS yüzeyindeki süpernatantı 200 mikrolitre yeniden tasarlanmış hücre çözeltisi ile değiştirin.

Hücreleri damganın mikro yapılarına yüklemek için, hücreleri damgaya her iki yönde, gerektiğinde birkaç kez yaymak için 30 ila 50 derecelik bir açıyla tutulan bir cam slayt kullanın. Mikroyapıların yüksek bir dolum oranı elde edildiğinde, hücre süspansiyonunun çıkarılması için bir pipet kullanın ve bozulmamış hücreleri çıkarmak için yıkama başına üç kez bir mililitre asetat tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, numunenin arkasını kurutmak ve damgayı bir Petri kabına yerleştirmek için azot akışını kullanın.

Daha sonra yemeğe iki mililitre taze asetat tamponu ekleyin. Hücrelerin atomik kuvvet mikroskopisi için, çanağı atomik kuvvet mikroskop aşamasına yerleştirin ve aşamayı sıfırdan sıfıra ortalayın. Sahne ortalandığında, kabı mikroskop Petri kabı tutucusuna taşıyın ve damganın kenarını Petri kabı tutucusunun y eksenine dik olacak şekilde hizalayın.

Ardından, step motorlarının ucun damgaya çarpmasını önlemek için yeterince uzatılmasına dikkat ederek atomik mikroskop kuvvet kafasını sahneye yerleştirin. Görüntüleme için mikroskop düğmelerini kullanarak atomik kuvvet mikroskop ucunu 4,5 ila 4,5 metrekarelik mikro metre kuyularının sol köşesine ortalayın ve mikroskop yazılımında kuvvet haritalama modunu seçin. 100'e 100 mikrometre alan üzerinde 64'e 64 kuvvet haritası ayarlamak için, göreli ayar noktasını üç ila beş nano Newton' a, Z uzunluğunu dört mikrometreye, Z hareketini sabit süreye, uzatma süresini 0,01 saniyeye, uzatma gecikmesini sıfıra, geri çekme gecikmesini sıfıra, sabit kuvvete gecikme modunu ayarlayın , örnek oranı 2048 Hertz.

Z kapalı döngünün işaretini kaldırın ve kare görüntüyü kontrol edin. 100 mikrometreye hızlı erişimi, yavaş ekseni 100 mikrometreye, X uzaklığını sıfır mikrometreye, Y uzaklığını sıfır mikrometreye, ızgara açısını sıfır dereceye, pikselleri 64 x 64'e ve piksel oranını bire bir olarak ayarlayın. Ardından otomasyon yazılımını açın.

Açılır pencerede, komut dosyasına giden yolu seçin. Gyfon komut dosyasının giriş kutusu bölümünün P1 değişken satırı 239'a W1 koordinatını ve P2 değişken satırı 241'deki W2 koordinat değerini girin. Pitch değerini komut dosyasının perde değişken satırı 245'e bağlayın ve kuyu desenlerinin tasarımından W-S değişken satırı 248'e belirlenebilen kuyu boyutunu girin.

Verileri istenen yere kaydetmek için kayıt dizininin yolunu satır 251'e yazın ve toplam alan değişken satırı 254'i 100 mikrometrenin birden çok sonuna kadar ayarlayın. Ardından, sayı taramaları değişken satırı 257'de kuyu başına kaydedilen kuvvet eğrileri matrisi satırını ve sütununu ayarlayın ve programı başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Verileri çözümlemek için, Python komut dosyasını açmak ve kuvvet eğrisi dosyalarını tek bir klasörde düzenlemek için python komut dosyasını kopyalama dosyalarını yürütmek için video stüdyosu kod yazılımını kullanın.

Verilerin depolanacağı genel klasörün yolunu girin. kuvvet eğrilerini analiz etmek için atomik kuvvet mikroskobu üreticisi veri işleme yazılımını açın. Dosya menüsünde spektroskopi eğrileri toplu işlemini seçin.

Daha sonra dosya ve yükleme işlemini seçin ve sertlik işlemini seçin. İşlemin son adımını seçin ve tüm kuvvet eğrilerinin aynı muameleyi alması için sakla'yı tıklatın ve hepsine uygulayın. R komut dosyasını açmak için, veri işleme yazılımıyla ayıklanan bilgileri içeren dosyaları R studio yazılımına yükleyin.

Ortam penceresinde, veri kümesini içeri aktar'ı tıklatın ve açılır pencerede metin okuyucudan, nokta TSV dosyasını bulmak için gözat'ı tıklatın. Dosya yüklendikten sonra, kod çalıştırma bölgesini seçin ve tüm kodu çalıştırmak için hepsini çalıştırın. Burada, gösterildiği gibi protokol kullanılarak elde edilen tipik histogramlar gösterilmiştir.

Bu analizde 957 yerli hücrede sertlik repartisyasyonu kaydedilirken, bu analizde 574 caspofungin tedavi edilen hücrenin sertliği ölçüldü. Yüzlerce hücre kullanmanın değerlerin iki modlu bir dağılımının gözlenmesine izin verdiğini bilin. Daha küçük örneklerde, tek bir dağılım tipik olarak gözlenir ve popülasyon heterojenliğinin gözlemlenmemesine neden olabilir.

İki koşulun karşılaştırılması, Caspofungin'in hücre sertliğini azaltma üzerindeki etkilerini vurgulamaktadır. ANOVA'nın yerli ve tedavi edilmiş hücrelerin karşılaştırılmasıyla ortaya çıkan iki durum, oldukça, önemli ölçüde farklı sertlikler sergiler. Bu değere, analiz edilen hücrelerin çokluğu nedeniyle ulaşılarak elde edilen sonuçlara daha fazla güven sağlanmıştır.

Damga dolana kadar hücreleri tekrar tekrar kuyulara yıkamadan önce pdms damgasına süpernatant eklemek, analizin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu kavram kanıtında, Candida albicans hücreleri analiz edildi, ancak protokol herhangi bir desen hücresi, molekül veya malzeme grubuna uygulanabilir.