Name: Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Keşfedin, C. albicans hücrelerinde atomik kuvvet mikroskopisi ölçümlerini otomatikleştirme yöntemini. PDMS damga kullanarak saatte binlerce hücre analiz ederek mikrobiyal biyomekanik araştırmaları hızlandırın ve tıbbi tanı stratejileri geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Conacyt (Meksika), Fransa Dışişleri Bakanlığı ve Université Paris 13'ün FONCYCYT'ini kabul etmek istiyoruz, ancak tanı için Nano palpation adlı uluslararası işbirlikçi ECOS-NORD projesinin finansal desteği, 263337 Numara (Meksika) ve MI5P02 (Fransa). AMR, 20195489 No'yla SIP-IPN'nin finansal desteğine teşekkür eder. SPC, çift doktora sertifikası (IPN-UPS) almak için cotutelle anlaşması aracılığıyla CONACYT (No. 288029) ve IPN'den bir doktora bursu ile desteklenmektedir. ED ve CFD, Centre National de la Recherche Scientifique'de (CNRS) araştırmacıdır.

1. Mikrobiyal hücre kültürü
<ol><li>Gliserol stoğundan hücreleri canlandır. NOT: C. albicans gliserol stoklarında, mermerlerde -80 °C'de saklanır.<ol>
<li>-80 °C stokta bir mermer seçin ve maya pepton dekstroz (YPD) agar üzerine sürün. Sıvı ekimden önce hücreleri 30 ° C'de 2 gün boyunca yetiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıvı kültürleri hazırlayın.<ol>
<li>Bir kültür tüpünü 5 mL steril YPD suyu ile doldurun ve YPD agar plakasında yetişen tek bir C. albicans hücresi kolonisi ekleyin.</li>
		<li>Santrifüjleme ile hasat etmeden önce 20 saat boyunca 30 °C'de statik koşullarda kültürü büyütün (4000 x g, 5 dk). Süpernatantı atın ve biyolojik tehlike atığı olarak ortadan kaldırın.</li>
		<li>Peletleri 10 mL asetat tamponu (8 mM sodyum asetat, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl 2 , pH5.2) ile 2xyıkayın. Yıkamalar arasında santrifüj (4000 x g, 5 dk).</li>
		<li>Peletin 2 mL asetat arabelleğine yeniden kullanın ve PDMS damgasında hücre hareketsizleştirme için bu çözümü kullanın. NOT: Bu süspansiyon saklanamaz ve bölüm 3 için taze olarak hazırlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PDMS damga hazırlama
<ol><li>Silikon ana kalıp hazırlama<ol>
<li>Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak istediğiniz mikro yapıları çizin. NOT: Tasarlanan kuyular, tuzaklanacak mikropla benzer boyutta olmalıdır. Tasarım, listede 100 x 100 kuyuların büyük bir matrisini sağlamalıdır. Mikrobun ortalama boyutu etrafında biraz farklı boyutlarda birkaç dizi yapmak en iyisidir.</li>
		<li>Temiz bir oda varsa, daha önce yayımlanan protokol 12'nin 2 ile12arasında olan adımlarını izleyin. Aksi takdirde, silikon ana kalıp ticari temiz oda tesislerinden edinilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS damga kalıplama<ol>
<li>PDMS oligomerleri ve kürleme maddesinin (Malzeme Masası) 10 ila 1, kütle oranı karışımını içeren 55 g PDMS prepolimerçözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Bu çözeltiyi vakum altında (10-1 -10-2 bar aralığında) pdms çözeltisinden (5−10 dk) tüm sıkışmış kabarcıklar çıkarılana kadar karıştırın ve gazdan arındırın.</li>
		<li>Gazdan arındırılmış çözeltinin 20 g'ını silikon ana kalıbına dökün ve tekrar gaz çözün (10-1 -10-2 bar aralığında). NOT: Damga kalınlığı yaklaşık 2−3 mm olmalıdır.</li>
		<li>Tüm kabarcıklar çıkarıldığında, PDMS'yi 1 saat boyunca 80 °C'de yeniden ifade edin.</li>
		<li>PDMS mikroyapılı damgayı görünür mikroyapı dizilerine paralel bir yönde neşterle(0,5 x 1,5 cm 2)kesin.</li>
		<li>Damgayı silikon ana kalıbından soyun.</li>
		<li>Üst tarafındaki mikro yapıları sergilemek için damgayı iade edin ve cam bir kaydırağa yatırın. Mikroyapıların cam kaydıraktan uzağa dönük olduğundan emin olun. Damgada görülebilen mikro yapıları, daha sonra AFM otomasyon prosedürü için referans görevi görecek olan cam slaydın yanıyla hizalayın. NOT: Bu aşamada, PDMS damgası hücre hareketsiz hale getirilmesi için hazırdır. PDMS pulları silikon ana kalıpta birkaç ay saklanabilir. Tüm PDMS ana kalıptan çıkarıldığında, ana kalıba tekrar yeni bir PDMS damgası atılabilir (ana kalıbı güvende tutmak için poliüretanda çoğaltmak mümkündür)14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Örnek hazırlama
<ol><li>Hücre hareketsizleştirme<ol>
<li>Tamponu hücrelerden ayırmak için yeniden sulanan hücre çözeltisinin santrifüjü (500 x g, 5 dk) 600 μL.</li>
		<li>3.1.1 adımından PDMS damgasına kadar süpernatantın pipet 200 μL'si ve vakum altında (10-1 -10-2 bar aralığında) yaklaşık 40 dakika boyunca gaz. NOT: Bu adım kuyuların içindeki hücre hareketsizleştirmesini iyileştirmek için önemlidir. Üst tarafta bulunan maya hücresi duvarından moleküller, muhtemelen bu ön ıslatma adımı sırasında PDMS yüzeyinde birikir. Bu moleküller, büyük olasılıkla, hücrelerin yapışmasını arttırır ve damga dolum oranındaki artışa katkıda bulunur.</li>
		<li>40 dakika sonra, bir pipetle, tamponu PDMS yüzeyinden çıkarın ve bir pipetle, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.2.4 adımdan 200 μL hücre çözeltisi biriktirin.</li>
		<li>Hücreleri konvektif/kılcal montaj ile damganın mikroyapılarına yerleştirin. Bunun için, 30 ila 50 ° arasında bir açıya sahip her iki yönde de bir cam slayt kullanarak 200 μL hücre süspansiyonunu damgaya manuel olarak yayın. Yüksek dolum oranı elde etmek için cam kaydırağı pulda birkaç kez geçirmek gerekebilir. NOT: Bu yöntemin tam açıklaması mevcuttur13.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu pipetle çıkarın. Damgayı 3x 1 mL asetat tamponu ile yıkayın, pH 5.2 sıkışmamış hücreleri çıkarmak için.</li>
		<li>Damganın kuru Petri kabına yapışmasını sağlamak için damganın arkasını azot akışı kullanarak kurutun.</li>
		<li>Son olarak, hücrelerle dolu PDMS damgasını bir Petrikabına (Malzeme Masası) yatırınve hücreleri sıvı ortamda tutmak için 2 mL asetat tamponu ile doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AFM sahnesine damgayı ayarlama<ol>
<li>AFM işlemlerine başlarken sahneyi 0:0'da ortala.</li>
		<li>Unsay ve ark.15'te açıklandığı gibi, kantilatıcının cam üzerindeki ve sudaki hassasiyetini ve yay sabitini kalibre edin.
</li>
		<li>Petri kabını damga ile birlikte alın ve AFM Petri kabı tutucusuna yerleştirin.</li>
		<li>Damga kenarını Petri kabı tutucu Y eksenine dik olarak hizalayın. NOT: Şekil 1'degösterildiği gibi kabul edilebilir bir eğim açısı 5°'nin altındadır.</li>
		<li>AFM kafasını sahneye yerleştirin ve step motorlarının ucun damgaya çarpmasını önlemek için yeterince uzatıldıklarına dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AFM programını çalıştırma
NOT: AFM programı Ek Malzeme olarak sağlanmıştır (AutomatipSoftware2019.pdf). Motorlu bir sahne ve JPK masaüstü yazılım sürümü 4.3 ile donatılmış bir JPK-Bruker AFM Nanowizard II veya III gerektirir. Program Jython altında geliştirilmiştir (python 2.7 tabanlı sürüm)
<ol><li>Veri toplama<ol><li>AFM ucunu, AFM optik mikroskobu kullanarak 4,5 x 4,5 μm2 kuyunun (hücre boyutuna karşılık gelen) sol köşesinin üzerine ortalayın. Başka bir kuyu boyutu gerekiyorsa, istediğiniz kuyuların sol üst köşesine ortalanın.</li>
		<li>100 x 100 μm² alan üzerinde 64 x 64 kuvvet haritası (Z aralığı =4μm, uç hızı = 90 μm·s -1 , uygulanan kuvvet 3 ila 5 nN) gerçekleştirin. Ölçüm modu açılan kutusundan Eşlemeyi Zorla modunu seçin. Kuvvet denetimi eşleme paneline aşağıdaki parametreler girilir: Rel. Setpoint = 3 ila 5 nN; z uzunluğu 4 μm; Z hareketi: sabit süre; uzatma süresi: 0.01s; ek gecikme:0; Retr gecikmesi: 0, Gecikme modu: Sabit Kuvvet, Örnek hızı 2048 Hz; Z kapalı döngü işaretini kaldırın; Izgara: Kare görüntüyü kontrol edin, Hızlı 100 μm, yavaş: 100μm, X ofset: 0 μm; Y ofset: 0 μm; ızgara açısı: 0 derece; Piksel: 64x64; piksel oranı: 1:1 NOT: Tipik bir sonuç Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu görüntü, iki kuyu arasındaki perdeyi ölçmeye ve doğrulamaya yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Sol üst kuyunun (W1) ve sol alt kuyunun (Şekil 2'deW2 olarak adlandırılır) merkezinin koordinatlarına dikkat edin. Bunu yapmak için kuyunun etrafına kare bir kutu yapın. Kutunun merkezinin koordinatı AFM yazılımının sol panelinde x,y koordinat kutularında görünür.</li>
		<li>Otomasyon yazılımını açmak için (Automatip_scan.py): JPK masaüstü yazılımında üst çubuk menüsünden ileriye tıklayın ve komut dosyasını açın'ı seçin. Açılan pencerede, Tamamlayıcı Veriler (Automatip_scan.py) içinde sağlanan komut dosyasına giden yolu seçin.</li>
		<li>Jython komut dosyasının Girişler kutusu bölümünde W1 ve W2 koordinat değerlerini uygulayın (Şekil 3). Komut dosyasının P1 değişken satırı 239'daki W1 koordinatlarını ve P2 değişken satırı 241'deki W2 koordinatlarını girin. NOT: İlk koordinatlar (W1 ve W2) olarak seçilen kuyular tarama alanı kenarından çok yakın olmamalıdır. Aksi takdirde, merkezi algoritma, kuyunun her iki tarafındaki PDMS yüzeyindeki yüksekliği ölçmesi gerektiğinden doğru çalışmaz. Örneğin, bkz.</li>
		<li>Pitch değerini komut dosyasının perde değişken satırı 245'e bağlayın.</li>
		<li>Kuyu boyutunu Ws değişken satırı 248'e girin. Bu kuyu desenlerinin tasarımından bilinir ve perdeyi doğrulamak için kullanılanla aynı görüntüde kontrol edilebilir (Şekil 2).</li>
		<li>Verileri istenen yere kaydetmek için kaydetme dizininin yolunu satır 251'e yazın.</li>
		<li>TotalArea değişken satırı 254'i 100 μm'lik birden fazla "n" isteğine ayarlayın (bu, kullanılan AFM'nin maksimum tarama alanıdır). Araştırılacak toplam kuyu sayısı bu değer ve perde kullanılarak hesaplanabilir: maksimum tarama alanı / perde*n2. NOT: Şekil 3örneğinde, 100 x 100 μm2'nin 9 alanı analiz edilecektir.</li>
		<li>NumScans değişken satırı 257'de kuyu başına kaydedilen kuvvet eğrileri matrisini, satır ve sütunu (3, 3 veya 4, 4) ayarlayın. NOT: Şekil 3örneğinde, her kuyu için 3 x 3 = 9 VC matrisi kaydedilecektir.</li>
		<li>Programı çalıştırın. Başlat düğmesine tıklayın. NOT: Program, W1 ve W2 kuyularının merkezini daha iyi belirlemek için önce otomatik olarak bir merkezleme algoritması yürütür (adım 1). Daha sonra ilk tarama alanının her kuyusunda (adım 2) Kuvvet Eğrileri (IC) matrisini otomatik olarak alır. Bu alanın tüm kuyuları araştırıldığında, komut dosyası AFM ucunu otomatik olarak bir sonraki tarama alanının ilk kuyusuna taşır. Uç geri çekilir, mikroskop aşaması bir sonraki alana taşınır, uç damgaya tekrar yaklaşıldı ve merkezleme algoritması, o alanın ilk kuyusunda (1') otomatik olarak yeniden ortalamak için tekrar yürütülür (adım 3). İlk alan kullanıcı tarafından tanımlanır, ikincisi, n'ye ulaşılana kadar sağda vb. n+1 alanı n'nin altında, n+1'in solunda n+2 vb. 2n+1 2n'nin altında, 2n+2 ise 2nn vb. Küresel olarak, uç toplam alandan geçer. Tarama alanlarının toplam sayısı "n 2" araştırılana kadaradım 2ve 3 otomatik olarak tekrarlanır. Şekil 5 programın akış çizelgesini sunar. Programın tamamlanması ~4 saat sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri analizi<ol>
<li>FCS dosyalarını tek bir klasörde düzenlemek için "Dosyaları kopyala" python komut dosyasını(Copy_files_L.py, Tamamlayıcı Verilerdesağlanır) yürütün. Bu komut dosyası Python 2.7 ve SciPy modülü ile geliştirilmiştir. Python komut dosyasını açmak için Visual Studio Code yazılımını kullanın. Genel klasörün giriş yolu (ek verilerde sağlanan komut dosyasının satır 67'si) ve depolanacağı yer (satır 73).</li>
		<li>Kuvvet eğrilerini analiz etmek için AFM üreticisi veri işleme yazılımını açın. Üst menüde Dosya,spektroskopi eğrileri grubuaç 'ı seçin.</li>
		<li>Toplu işleme penceresinde, Tamamlayıcı Veriler 'de (StiffnessProcess.jpk-proc-force) sağlanan işlemi seçin. İşlemin son adımını seçin ve Tüme Sakla ve Uygula 'yıtıklatın. Tüm kuvvet eğrileri aynı tedaviyi görecektir. NOT: İşlem, sapma eğrilerini Newton'da kalibre edilmiş kuvvet eğrilerine dönüştürmek için FCS dosyalarından kalibrasyonu kullanır; veri yumuşatma algoritması uygulanır (ortalama 3 ardışık nokta); taban çizgisi sıfır ekseninde duracak şekilde çevrilir; temas noktası tahmin edilir ve FC, temas noktasını koordinatlara yerleştirmek için dengelenir (0,0); yaverin bükülmesi FCS'ye çıkarılır, geri çekme eğimi takılır. Veri işlemenin sonunda, yazılım her GC için bir tablo içeren bir dosya oluşturur: adı, Genç Modül, temas noktası, yapıştırma kuvveti, eğimler, vb.</li>
		<li>Tüm denemeler için 4.2.1 ile 4.2.3 adımlarını yineleyin. Verileri farklı klasörlere kaydetmeye dikkat edin (örneğin: "...\TREATED\" ve "...\UNTREATED\")</li>
		<li>Histogramları ve kutu çizimlerini çizmek ve ANOVA istatistiksel tedavileri gerçekleştirmek için Tamamlayıcı Veriler'de sağlanan R komut dosyasını kullanın.<ol>
<li>R komut dosyasını (DataAnalisys.R) açmak için R studio yazılımını kullanın ve veri işleme yazılımı (.tsv) ile ayıklanan bilgileri içeren dosyaları yükleyin.</li>
			<li>Ortam penceresinde Veri Kümesini İçeri Aktar düğmesini kullanın, görüntülenen listeden metinden (readr) seçin ve yeni pencerede Tarayıcı düğmesini seçin ve .tsv dosyasını bulun.</li>
			<li>Dosya yüklendikten sonra, analiz için eklenecek sütunları (sertlik ve yapışkanlık) seçin. Tüm kodu çalıştırmak için Ctrl+Alt+R tuşlarınabasın. NOT: Komut dosyası 4 veri kümesiyle çalışır, hem işlenmemiş hem de tedavi edilmiş hücrelere sahip iki denemeyi göz önünde bulundurun. Komut dosyasının bloklarını yürütmek ve değişkenlerin yürütülen işlevlere göre nasıl değiştiğini görmek mümkündür.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li>
<li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Electroporation%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li>
<li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li>
<li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology%3A+From+microbiology+to+cancerology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li>
<li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li>
<li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li>
<li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li>
<li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853(2019).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li>
<li>Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM%3A+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Horizons%22%5BJournal%5D)">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li>
<li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li>
<li>Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867(2015).</li>
<li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species%2C+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li>
<li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li>
<li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu metodolojinin sağladığı temel gelişme, ölçülen hücrelerin sayısında belirlenen sürede önemli bir artıştır. Muadili, hücre başına ölçülen puan sayısının azaltılmasıdır. Bu yöntemin tek bir hücrenin ayrıntılı bir analizini sağlamak için tasarlanmadığı anlamına gelir. Yöntem yalnızca PDMS damgasının kuyularına sığabilen hücreler için geçerlidir. Damga oldukça çok yönlüdür, 1.5 x 1.5 μm 2 ila 6 x6 μm2kuyular içerir. Yine de basili veya çok daha büyük hücreleri hareketsiz hale getirmek imkansızdır. Pu...

Bu çalışma, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak yüzlerce canlı hücre üzerinde otomatik kuvvet ölçümleri yapmak için bir metodoloji sağlar. Ayrıca, sıvı bir ortamda yapılan AFM deneyleriyle uyumlu bir PDMS mikro yapılandırılmış damga üzerindeki mikropları hareketsiz hale getirmek için bir yöntem sağlar.
Bio-AFM, biyolojideki uygulamalar için tasarlanmış ve daha sonra canlı hücreleri incelemek için kullanılan son derece uzmanlaşmış bir teknolojidir. O anda bir hücreyi analiz edebilecek eğitimli bir mühendise ihtiyaç var. Bu koşullarda, analiz edilebilen farklı hücrelerin sayısı oldukça küçüktür, tipik 5 ila 10 hücre 4-5 saat içinde. Bununla birlikte, tek bir hücrede kaydedilen kuvvet ölçümlerinin miktarı genellikle çok yüksektir ve kolayca 1000'e ulaşabilir. Bu nedenle, AFM kuvvet ölçümlerinin canlı hücreler üzerindeki mevcut paradigması, yüzlerce kuvvet eğrisini (FC) ancak sınırlı sayıda hücre üzerinde kaydetmektir.
İstatistiksel olarak, bu yaklaşım şüphelidir ve örneğin temsili konusunu gündeme getirmektedir. Aslında, örneğin, bu birkaç hücreye yüzlerce ölçüm kaydedilse bile, sadece birkaç hücreyi ölçerek bir hücre popülasyonunun heterojenliğini değerlendirmek zordur. Bununla birlikte, bu paradigma temelinde biyofizik, mikrobiyoloji ve nanotıp 1 ,2,3'te büyük ilerlemeler yapılmıştır. Gerçekten de, tek hücre ölçeğinde nanometre analizi hücresel nanomekanik, transmembran proteinlerinin organizasyonu veya antimikrobiyal veya antikanser ilaçların etki mekanizması hakkında yeni bilgiler sağlamıştır4,5,6,7. Bununla birlikte, son zamanlarda, hücreler üzerinde yapılan birkaç yüksek verimli biyomekanik test ortaya çıkmıştır8Bilimsel topluluğun bu paradigmayı değiştirmeye ve hücre popülasyonu heterojenliğine erişmeye olan ilgisini gösteren. Bu testlerin tümü, hücreleri deforme etmek ve genel yüzey elastikiyetlerinin dolaylı bir ölçüsünü elde etmek için stres altındaki deformasyonlarını optik olarak ölçmek için mikroakışkan sistemlere dayanır8. Bununla birlikte, bu yöntemlerle ilgili önemli bir sorun mono-parametrik olmalarıdır: sadece hücre esnekliği araştırılabilir. Ayrıca, örneğin memeli hücrelerinin veya biyofilmlerin sirkülasyonsuz çalışmaları için sınırlayıcı olabilen yapışık hücrelerin mekanik parametrelerinin ölçülmesine izin vermezler.
AFM'yi içeren yaklaşımlar S. Scheuring9 ve M. Favre10ekipleri tarafından geliştirilmiştir. Scheuring ve ark. fibronektin desenleri üzerinde hareketsiz hücreler9, tek tek hücreleri desen şeklini almaya zorlamak9. Daha sonra bu ekip, ortalama verileri tanımlamak için birkaç hücrenin mekanik özelliklerini haritaladı, 14 ila 18 hücreyi temsil etti. AfM cantilevers10paralelleştirerek ölçümleri çoklamayı amaçlayan Farve ve ark. Bilgimize göre, çoklama yönünde yapılan bu çalışma canlı hücreler üzerinde ölçümlere yol etmemektedir.
Dujardin'in ekibi tarafından önerilen ilginç bir yaklaşım, hücreleri tanımlayabilen ve özel yapım kuyuların dibinde görüntüleyebilen otomatik bir AFM sunar. Bu yöntem büyük bir hücre popülasyonunun analizine izin vermese de, her kuyuda farklı koşulların otomatik olarak testine izin verir11.
Ortalama bir hücreye değil, aksine hücreler arasındaki heterojenliğe erişmek için en az 1000 hücreyi ölçmek istediğimiz için bu çalışmadaki hedefimiz daha iddialı. Burada AFM kullanarak hücre popülasyon heterojenliğine erişmek için geliştirdiğimiz strateji, sınırlı sayıda kuvvet eğrisinin kaydedildiği yüzlerce hücrenin analizine dayanmaktadır. Sınırlı sayıda hücre üzerinde çok sayıda kuvvet eğrisi kaydetmenin "klasik" yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, aynı bilgileri sağlamadığı için bu yaklaşım tamamlayıcı olarak düşünülmelidir. Gerçekten de, tipik yöntem, yaklaşımımızı kullanarak, bireysel hücre yüzeyi heterojenliğini araştırmamıza izin verirken, tüm hücre popülasyonu heterojenliğine erişebiliyoruz. Bu amaca ulaşmak için, mikropları (burada maya türü Candida albicans)doğrudan bir PDMS mikro yapılandırılmış damga12kuyularına indiren ve AFM ucunu otomatik olarak hücreden hücre13'e taşımak ve her hücrenin mekanik özelliklerini ölçmek için orijinal bir program geliştiren bir yöntem geliştirdik.

<table><tbody><tr><td>AFM konsol</td><td>Bruker AFM probları</td><td>MLCT</td><td>Kullanılan konsollar " C&rdquo; 7 ila 10 kHz rezonans frekansı ve k: 0.01 N/m</td></tr><tr><td>AFM veri analizi</td><td>JPK-Bruker</td><td>JPK Veri işleme sürümü minimum 5.1.8</td> Bir <td>JPK-Bruker kullanıcısından indirilebilir</td></tr><tr><td>AFM Petri kapları</td><td>WPI</td><td>FluoroDish FD35-100</td><td>Isıtıcı, deney sırasında sıcaklık değişimlerini izlemek için kullanıldı</td></tr><tr><td>Atomik kuvvet Mikroskobu (AFM)</td><td>JPK-Bruker</td><td>Nanowizard II veya III</td><td>AFM, motorlu bir kademeli ters çevrilmiş bir optik mikroskop üzerine monte edilmelidir</td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425-5MG</td><td>Caspofungin, 4 MIC (Minimum İnhibitör Konsantrasyonu) konsantrasyonu ile kullanıldıKod</td></tr> <tr><td>düzenleyici</td><td>Microsoft</td><td>Visual Studio Code sürüm 1.40.1</td><td></td></tr> <tr><td>https://code.visualstudio.com/ Cryobeads</td><td>IFU</td><td>CB12</td><td></td></tr><tr><td>Dessicatör/Gaz Giderme </td><td>oda Fisherbrand</td><td>15594635</td><td>Ekipman, PDMS damgalarını yaklaşık 50 dakika boyunca gazdan arındırmak için kullanılır, bir vakum pompası ile birleştirilmiş herhangi bir dessikatör yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Petri bulaşık ısıtıcısı</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>Bu, JPK/Bruker AFM'ye bir eklentidir. Isıtıcı, deney sırasında sıcaklık değişimlerini izlemek için kullanıldı</td></tr><tr><td>Sodyum asetat tamponu pH 5.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>Çözelti 18 mM sodyum asetat, 1 mM CaCl2 ve 1 mM MnCl2 içerir. PH'ı buzlu asetik asit ile ayarlayın. Çözelti 4 ° C'de saklanabilir; 2 ay boyunca</td></tr><tr><td>C İstatistiksel analiz dili</td><td>https://www.r-project.org</td><td>R sürüm 3.6.1</td><td>R, istatistiksel hesaplama ve grafikler için bir dil ve ortamdır. R Foundation</td></tr><tr>, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP ve diğerleri arasındaki <td>R studio sürüm 1.1.463</td> işbirliğine <td>https://rstudio.com</td> S dili ve ortamı<td>İstatistiksel analiz yazılımına</td> benzeyen bir GNU projesidir<td>. RStudio ve Shiny, Açık Erişim İstatistik Vakfı'nın bağlı projeleridir</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028</td><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) ve bir sette kürleme maddesi</td></tr><tr><td>Maya Pepton D Et Suyu</td><td>Difco</td><td>242820</td><td></td></tr><tr><td>YPD Agar</td><td>Difco</td><td>DF0427-17-6</td><td></td></tr></tbody></table>

yüzlerce c. albicans hücresinde biyo-atomik kuvvet mikroskop Ölçümlerinin otomasyonu

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Bu makalede sunulan yöntem, Bio-AFM deneylerini ve kuvvet eğrilerinin kaydedilini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, kuvvetleri 1000 hücreye otomatik olarak 4 saatte kaydetmek mümkündür. 4 saatlik analiz süresini korumak için hücre başına kuvvet eğrisi sayısı 9 veya 16'ya düşürülür. Yöntem, Jython tabanlı bir programı ve tanımlanmış desenler üzerinde hücreleri birleştirmek için bir stratejiyi birleştirir. Ticari bir Bio-AFM üzerinde uygulanan program, ucu dizinin ilk hücresine ortalayabilir ve ardından her hücrede kuvvet eğrileri kaydederken otomatik olarak hücreden hücreye hareket edebilir. Bu metodolojiyi kullanarak, hücrelerin sertlikleri, yapışkan özellikleri vb. Otomasyon ve analiz edilen çok sayıda hücre ile hücre popülasyonunun davranışına erişilebilir. Bu, biyo-AFM alanında şimdiye kadar verilerin sadece birkaç on hücreye kaydedildiği bir atılımdır.

Açıklanan protokolü, caspofungin'in maya formundaki fırsatçı insan patojeni C. albicans'ın biyofiziksel özellikleri üzerindeki etkisini analiz etmek için kullandık. Caspofungin, hücrelerin antifungallere doğru geliştirdiği direnç mekanizmaları nedeniyle diğer ilaçlar etkisiz olduğunda kullanılan son şans antifungal molekülüdür. Etki mekanizması, ß glukan sentezi sorumlu karmaşık fks1/Fks2 alt birimi Fks2'nin inhibisyonunu temel almaktadır. ß glukanlar mantar hücre duvarının önemli bir bileşeni olduğundan<sup cla...

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Atomik kuvvet mikroskobu otomasyonu, teknolojinin biyomedikal uygulamalara doğru evriminde önemli bir yeniliktir. Ayrıca hücre popülasyonlarının biyomekanik özelliklerinin araştırılmasına erişim sağlar. Yöntemimiz, 10 hücreyi ölçmek için dört saat süren normal yöntemlere kıyasla, dört saat içinde 1.000 hücre için AFM ölçümlerini kaydetmeyi mümkün kılar, bu gerçekten önemli bir zaman kazancıdır.Otomasyon, bu teknolojiyi hastane laboratuvarlarına getirmenin ön koşuluysa, bu kavram kanıtı protokolü, belirli tıbbi tanı stratejilerinin geliştirilmesinde kullanım potansiyelini göstermektedir. Bu protokol, farklı sistemlerin araştırılmasına izin veren çeşitli mikroplarla doldurulabilen çok yönlü bir PDMS gövdesi kullanır. PDMS damgasını hazırlamak için, PDM'lerde, oligomerlerde 10 ila bir kütle oranında 55 gram PDMS polimer çözeltisini karıştırın ve elde eden çözeltiyi vakum altında bir kez 10 ila bir kez negatif iki çubuk için beş ila 10 dakika boyunca negatif bir ila bir kez gazdan arındırın.Tüm tuzak kabarcıkları çıkarıldığında, gazdan çıkarılmış çözeltinin 20 gramını silikon bir ana kalıba iki ila üç milimetre kalınlık ve tekrar gazdan arındırın. Tüm kabarcıklar çıkarıldığında, PDMS'yi bir saat boyunca 80 santigrat derecede yeniden ifade edin ve PDMS mikro yapılandırılmış damgayı görünür mikroyapı dizilerine paralel kesmek için bir neşter kullanın. Daha sonra damgayı silikon ana kalıptan soyun ve damga mikro yapı alanını, slaydın yanına hizalanmış mikro yapılarla birlikte bir cam kaydırağın üzerine yerleştirin.Hücreleri cihaza hazırlamak için, faizin hücre süspansiyonunun 600 mikrolitresini santrifüjleyin ve damgaya 200 mikrolitre süperndant ekleyin. Süpernatant yaklaşık 40 dakika vakum altında degas. Tüm kabarcıklar çıkarıldığında, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için PDMS yüzeyindeki süpernatantı 200 mikrolitre yeniden tasarlanmış hücre çözeltisi ile değiştirin.Hücreleri damganın mikro yapılarına yüklemek için, hücreleri damgaya her iki yönde, gerektiğinde birkaç kez yaymak için 30 ila 50 derecelik bir açıyla tutulan bir cam slayt kullanın. Mikroyapıların yüksek bir dolum oranı elde edildiğinde, hücre süspansiyonunun çıkarılması için bir pipet kullanın ve bozulmamış hücreleri çıkarmak için yıkama başına üç kez bir mililitre asetat tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, numunenin arkasını kurutmak ve damgayı bir Petri kabına yerleştirmek için azot akışını kullanın.Daha sonra yemeğe iki mililitre taze asetat tamponu ekleyin. Hücrelerin atomik kuvvet mikroskopisi için, çanağı atomik kuvvet mikroskop aşamasına yerleştirin ve aşamayı sıfırdan sıfıra ortalayın. Sahne ortalandığında, kabı mikroskop Petri kabı tutucusuna taşıyın ve damganın kenarını Petri kabı tutucusunun y eksenine dik olacak şekilde hizalayın.Ardından, step motorlarının ucun damgaya çarpmasını önlemek için yeterince uzatılmasına dikkat ederek atomik mikroskop kuvvet kafasını sahneye yerleştirin. Görüntüleme için mikroskop düğmelerini kullanarak atomik kuvvet mikroskop ucunu 4,5 ila 4,5 metrekarelik mikro metre kuyularının sol köşesine ortalayın ve mikroskop yazılımında kuvvet haritalama modunu seçin. 100'e 100 mikrometre alan üzerinde 64'e 64 kuvvet haritası ayarlamak için, göreli ayar noktasını üç ila beş nano Newton' a, Z uzunluğunu dört mikrometreye, Z hareketini sabit süreye, uzatma süresini 0,01 saniyeye, uzatma gecikmesini sıfıra, geri çekme gecikmesini sıfıra, sabit kuvvete gecikme modunu ayarlayın , örnek oranı 2048 Hertz.Z kapalı döngünün işaretini kaldırın ve kare görüntüyü kontrol edin. 100 mikrometreye hızlı erişimi, yavaş ekseni 100 mikrometreye, X uzaklığını sıfır mikrometreye, Y uzaklığını sıfır mikrometreye, ızgara açısını sıfır dereceye, pikselleri 64 x 64'e ve piksel oranını bire bir olarak ayarlayın. Ardından otomasyon yazılımını açın.Açılır pencerede, komut dosyasına giden yolu seçin. Gyfon komut dosyasının giriş kutusu bölümünün P1 değişken satırı 239'a W1 koordinatını ve P2 değişken satırı 241'deki W2 koordinat değerini girin. Pitch değerini komut dosyasının perde değişken satırı 245'e bağlayın ve kuyu desenlerinin tasarımından W-S değişken satırı 248'e belirlenebilen kuyu boyutunu girin.Verileri istenen yere kaydetmek için kayıt dizininin yolunu satır 251'e yazın ve toplam alan değişken satırı 254'i 100 mikrometrenin birden çok sonuna kadar ayarlayın. Ardından, sayı taramaları değişken satırı 257'de kuyu başına kaydedilen kuvvet eğrileri matrisi satırını ve sütununu ayarlayın ve programı başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Verileri çözümlemek için, Python komut dosyasını açmak ve kuvvet eğrisi dosyalarını tek bir klasörde düzenlemek için python komut dosyasını kopyalama dosyalarını yürütmek için video stüdyosu kod yazılımını kullanın.Verilerin depolanacağı genel klasörün yolunu girin. kuvvet eğrilerini analiz etmek için atomik kuvvet mikroskobu üreticisi veri işleme yazılımını açın. Dosya menüsünde spektroskopi eğrileri toplu işlemini seçin.Daha sonra dosya ve yükleme işlemini seçin ve sertlik işlemini seçin. İşlemin son adımını seçin ve tüm kuvvet eğrilerinin aynı muameleyi alması için sakla'yı tıklatın ve hepsine uygulayın. R komut dosyasını açmak için, veri işleme yazılımıyla ayıklanan bilgileri içeren dosyaları R studio yazılımına yükleyin.Ortam penceresinde, veri kümesini içeri aktar'ı tıklatın ve açılır pencerede metin okuyucudan, nokta TSV dosyasını bulmak için gözat'ı tıklatın. Dosya yüklendikten sonra, kod çalıştırma bölgesini seçin ve tüm kodu çalıştırmak için hepsini çalıştırın. Burada, gösterildiği gibi protokol kullanılarak elde edilen tipik histogramlar gösterilmiştir.Bu analizde 957 yerli hücrede sertlik repartisyasyonu kaydedilirken, bu analizde 574 caspofungin tedavi edilen hücrenin sertliği ölçüldü. Yüzlerce hücre kullanmanın değerlerin iki modlu bir dağılımının gözlenmesine izin verdiğini bilin. Daha küçük örneklerde, tek bir dağılım tipik olarak gözlenir ve popülasyon heterojenliğinin gözlemlenmemesine neden olabilir.İki koşulun karşılaştırılması, Caspofungin'in hücre sertliğini azaltma üzerindeki etkilerini vurgulamaktadır. ANOVA'nın yerli ve tedavi edilmiş hücrelerin karşılaştırılmasıyla ortaya çıkan iki durum, oldukça, önemli ölçüde farklı sertlikler sergiler. Bu değere, analiz edilen hücrelerin çokluğu nedeniyle ulaşılarak elde edilen sonuçlara daha fazla güven sağlanmıştır.Damga dolana kadar hücreleri tekrar tekrar kuyulara yıkamadan önce pdms damgasına süpernatant eklemek, analizin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu kavram kanıtında, Candida albicans hücreleri analiz edildi, ancak protokol herhangi bir desen hücresi, molekül veya malzeme grubuna uygulanabilir.

automation-bio-atomic-force-microscope-measurements-on-hundreds-c

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Açıklanan, yapışık hücreler ve mikroyapılı substratlar arasındaki mekanik etkileşimleri ölçmek için kullanılan protokollerdir. Bu etkileşimler, göç, proliferasyon, farklılaşma ve apoptoz dahil olmak üzere temel hücre davranışlarıyla yakından bağlantılıdır. Protokoller, her bir mikro direk için ilgili kuvvetlerin belirlenmesini sağlayan MechProfiler adlı açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı sunar.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Bu teknik polisakkarit kapsülü ve vücut yarıçaplarını ölçmek için tasarlanmış bir otomatik batch Image processor açıklar. Başlangıçta Cryptococcus neoformans kapsül ölçümleri için tasarlanmış iken otomatik görüntü işlemci dairesel nesneler diğer dayalı kontrast tespiti için de uygulanabilir.

Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk...

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Burada, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) bakteriyel karakterizasyonu için basit ve hızlı bir yöntem olarak uygulanmasını sunuyoruz ve bakteri boyutu ve şekli, bakteri kültürü biyofilmleri ve nanopartiküllerin bakterisitler olarak aktivitesi gibi ayrıntıları analiz ediyoruz.

Morfolojik Gözlem ve Bakteriyel Hücre Hasar Analizi için Hızlı Bir Teknik Olarak Temas Modu Atomik Kuvvet Mikroskobu

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Keşfedin, C. albicans hücrelerinde atomik kuvvet mikroskopisi ölçümlerini otomatikleştirme yöntemini. PDMS damga kullanarak saatte binlerce hücre analiz ederek mikrobiyal biyomekanik araştırmaları hızlandırın ve tıbbi tanı stratejileri geliştirin.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Daha fazla video keşfet